Baseado em RNA reprogramação de fibroblastos humanos primários em células-tronco pluripotentes induzidas

Trabalhar em condições de livre de RNase e utilizar técnicas assépticas quando possível. Execute todas as manipulações relacionadas à cultura de células em uma câmara de segurança biológica com técnicas assépticas. Siga as normas de biossegurança institucional para o trabalho com células humanas. 1. reagentes e equipamentos para preparação de reprogramação de iniciação Prepare os fatores modificado-mRNA cocktails codificação reprogramação. Siga o protocolo anteriormente publicados10 para executar em vitro transcrição, tampar e dephosphorylation procedimentos para cada mRNA modificados codificação individual fator reprogramação. Após a etapa final de purificação, Eluir o mRNA modificados com água livre de nuclease, complementar a solução de mRNA purificado modificados com 1 inibidor de RNase U / µ l, dosar os mRNAs modificados usando um espectrofotômetro e armazenar a-80 ° C por até 6 meses. Prepare várias alíquotas de cada mRNA modificado para minimizar o número de ciclos de gelo-degelo.Nota: Protocolos semelhantes para modificados mRNA produção ter sido relataram em outro lugar5,8,11. Modelos para a transcrição em vitro podem ser gerados pela amplificação por PCR de modelos correspondentes do plasmídeo usando as primeiras demão constantes da Tabela de materiais , de acordo com o protocolo anteriormente publicados10. Modelos de plasmídeo para cada fator de reprogramação (M3O9, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG, LIN28A) e mWasabi (controle para transfeccao) estão disponíveis a partir de Addgene, um repositório de plasmídeo sem fins lucrativos. Misture todos os mRNAs modificados em uma relação molar de 3:1:1:1:1:1 (M3O: SOX2: KLF4: cMYC: NANOG: LIN28A) e incluem 10% mWasabi modificado mRNA como um controle para a eficiência do transfection. Ajuste a concentração do mRNA modificada completa reprogramação a mistura para uma concentração final de 100 ng / µ l, adicionando água livre de nuclease suplementada com 1 inibidor de RNase U / µ l. Prepare-se sete 33 alíquotas µ l dos completos modificado cocktail de mRNA. Armazenar as alíquotas de reprogramação mistas a-80 ° C.Nota: para cada transfeccao, 1.000 ng do coquetel modificados do mRNA é adicionado por bem (ou seja, um total de 3.000 ng para 3 poços). Cada alíquota 33 µ l é dimensionada para transfect 3 poços de uma placa de formato 6-poços e inclui 3 µ l de volume em excesso para compensar erros de pipetagem. Preparando-se sete 33 alíquotas µ l é suficiente para completar uma reprogramação de fibroblastos completo de 3 poços em um prato de formato 6-poços. Prepare o coquetel de reprogramação miRNA imita. Dissolver o liofilizado miRNA imita (Syn-tem-miR-302a – 3P, Syn-tem-miR-302b – 3P, Syn-tem-miR – 302c – 3P, Syn-tem-miR-302d-3 p, Syn-tem-miR-367-3 p) a uma concentração final de 5 pmol / µ l (5 µM) em água livre de nuclease suplementada com 1 U / µ l de inibidor de RNase. Preparar várias alíquotas de cada mímica miRNA e armazenar a-80 ° C para armazenamento a longo prazo. Misture todos os imita miRNA na proporção molar de 1:1:1:1:1 para uma concentração final de 5 pmol / µ l (5 µM). Prepare-se sete 14 alíquotas µ l da miRNA imita a mistura. Armazenar as alíquotas misturadas a-80 ° C.Nota: Para cada transfeccao, 20 pmol de miRNA imita mistura é adicionado por bem (ou seja, um total de 60 pmol de 3 poços). Cada alíquota 14 µ l é dimensionada para transfect 3 poços de uma placa de formato 6-poços e inclui 2 µ l de volume em excesso para compensar erros de pipetagem. Preparando-se sete 14 alíquotas µ l é suficiente para completar uma reprogramação de fibroblastos completo de 3 poços em um prato de formato 6-poços. Prepare o buffer do transfection. Pré-aquecer uma garrafa de 500 mL e um frasco de 100 mL de meio de reduzida-soro fresco à temperatura ambiente (RT) por aproximadamente 2 h. Não use um banho de água. Transferi um medidor de pH para uma armário de biossegurança. Lave o eletrodo de vidro com água livre de nuclease. Calibre o medidor de pH de acordo com as instruções do fabricante. Lave o eletrodo com água livre de nuclease. Transferi as duas garrafas de meio reduzido-soro para a biossegurança do armário. Use a garrafa de 500 mL RT para ajustar o pH. Medir o base pH do meio reduzido-soro inserindo eléctrodo de vidro do medidor de pH para o buffer. Espere até 1 min. antes de ler o pH no medidor. Adicione 3-4 mL de 1 M de NaOH em 500 mL de soro e reduzida meio, feche a garrafa e misture bem. Espere até 5 min. antes de abrir a garrafa para medição de pH. Inserir o eletrodo de pH para o buffer e esperar até que a leitura do medidor de pH estabiliza. Continue a adicionar volumes pequenos de 1 M de NaOH até pH do meio reduzido-soro 8.15 – 8.17. Calibre o medidor de pH várias vezes durante o processo. Se em algum momento o pH se torna superior 8.18, reduzi-lo adicionando meio reduzido-soro fresco do frasco 100ml pré-aquecido (etapa 1.3.1).Nota: O pH do buffer reduzido-soro baseado no meio de transfeccao é essencial. Reprogramação será bem sucedida se o pH do buffer do transfection é aproximadamente 8,2 ± 0,05 mas pode falhar se o pH for superior a 8,25. Portanto, é aconselhável parar de adicionar NaOH, uma vez que pH do tampão atinge 8.15 – 8.17. Isto irá garantir que o pH final do buffer do transfection é aproximadamente 8,2 – 8.22 após a esterilização. Filtro de esterilizar o buffer de transfeccao usando um sistema de filtração de vácuo 0,22 µm. Alíquota o buffer esterilizado em tubos de 5 ou 15 mL com espaço de ar mínimo. Loja alíquotas do buffer do transfection por até 3 meses a 4 ° C. Medir o pH das alíquotas periodicamente. Descarte as alíquotas se o pH for superior a 8,25. Limitar o uso de alíquota para 2 transfections só, desde que a exposição do buffer do transfection para ar atmosférico aumenta o pH do buffer. Prepare o suporte de expansão de fibroblasto (FEM): essencial mínimo suplementado com 10% soro bovino fetal (FBS), 1 x não aminoácidos essenciais, 55 µM 2-Mercaptoetanol, 1 suplemento de glutamina de x, 1 x caneta/estreptococos/fungizone. Armazenar o FEM a 4 ° C. Prepare o suporte de reprogramação: DMEM/F12 (sem HEPES) suplementado com substituição de soro de nocaute de 20% (KOSR), 0,5 x não aminoácidos essenciais, suplemento de glutamina 0.5 x, 55 µM 2-Mercaptoetanol, 50 µ g/mL de ácido ascórbico, 1x caneta/estreptococos/fungizone, bFGF 100 ng/mL e 200 ng/mL B18R. Prepare o suporte na iniciação de reprogramação sem bFGF e B18R e armazená-lo em 4 ° C. Não usá-lo para além de 1 mês após a preparação. Adicione bFGF e B18R imediatamente antes de cada utilização a uma alíquota de porte para uso naquele dia. Prepare o suporte de chapeamento, adicionando 5% inactivadas pelo calor (HI) FBS no meio de reprogramação, contendo 20% KOSR sem bFGF e B18R da etapa 1.5. Prepare o fresco médio no dia do uso pretendido. Adicione o bFGF e B18R imediatamente antes do uso no dia 0 de reprogramação. Calibre as incubadoras de cultura de tecidos antes de iniciar a reprogramação de acordo com as instruções do fabricante usando um analisador de2 CO digital portátil. Use uma incubadora de baixo-O2 para as etapas de reprogramação para garantir a geração de iPSC bem sucedida. 2. cultivo de fibroblastos para reprogramação Prepare-se fibroblastos antes do início de reprogramação (dia -2). Casaco de uma nova placa de cultura de tecido de 10 cm com 5 mL de 0.1% de gelatina. Bata ou agite a placa para garantir que toda a superfície é revestida. Incube por 15 min a 37 ° C. Aspirar a gelatina e adicionar 10 mL de FME conjunto à parte. Não permita que a superfície revestida da placa para secar antes de adicionar o Fme Aspire cuidadosamente o gasto médio de fibroblastos. Enxague as células uma vez com 5 mL de DPBS para remover o soro residual. Adicione 3 mL de EDTA-tripsina. Agitar suavemente a placa para assegurar uma cobertura completa sobre as células. Aspire o excesso de líquido, deixando ~ 500 µ l de tripsina. Não aspire o excesso, pois isso pode secar e matar os fibroblastos. Incubar os fibroblastos com tripsina-EDTA para 3 min a 37 ° C. Retirar a placa da incubadora e firme, mas suavemente, toque o lado da placa para desalojar as células. Verifique as células sob o microscópio. Se as pilhas são desanexados e flutuante, prossiga. Se as células ainda estão conectadas, incube por mais 3 minutos. Rapidamente enxágue/coletar as células desanexadas usando 5ml de FEM para neutralizar o tripsina-EDTA. Mova a suspensão de fibroblasto em um tubo cônico de 15 mL. Certifique-se de que as células são bem misturadas. Misture suavemente a suspensão de eritrócitos para quebrar grandes aglomerações de células e, em seguida, contar-lhes um hemocytometer. Transferência de 2.5 x 105 células para o prato de 10 cm revestido de gelatina preparada na etapa 2.1.1. Incube as células durante a noite a 37 ° C, 5% CO2 regular umidificado tecido cultura incubadora.Nota: A densidade celular é essencial para alcançar alta eficiência de reprogramação, como é importante que os fibroblastos são saudáveis e rapidamente divisória. Chapeamento de 2.5 x 105 células produz uma confluência de 40-60% 2 dias mais tarde para a maioria das amostras de fibroblasto. Ajustar a quantidade em conformidade para células senescentes ou doentes alcançar a desejado 40-60% confluência 48 h mais tarde. Substitua o médio com 10 mL de FEM fresco no dia seguinte (dia -1). Placa de fibroblastos para iniciar a reprogramação (dia 0). Verifique se os fibroblastos ser reprogramado na confluência de 40 – 60% (Figura 2, dia 0). Se as células são over – ou Under confluente, passagem os fibroblastos, conforme descrito no passo 2.1 e ajustar a densidade de chapeamento de acordo. Cultura por mais 2 dias. Transferência de 4 mL de DPBS em um tubo cônico de 15 mL. Adicione 100 µ l de recombinante humano (rh) laminina-521. Pipete para cima e para baixo para homogeneizar. Adicione 1 ml por bem de rhLaminin-521 diluídos em 3 poços de uma placa de 6. Incube a placa revestida a 37 ° C por 2 h. Aquecer 6 mL de FEM e 4 mL de chapeamento de médio a 37 ° C. Completar o meio de chapeamento com bFGF a uma concentração final de 100 ng/mL e B18R para uma concentração final de 200 ng/mL. Aspire cuidadosamente o gasto médio de fibroblastos (etapa 2.2.1). Enxagúe as células com 5 mL de DPBS e adicionar 3 mL de EDTA-tripsina. Agitar suavemente o prato para cobrir as células com tripsina-EDTA. Aspire o excesso de líquido, deixando ~ 500 µ l de tripsina, como feito na etapa 2.1.3. Incubar os fibroblastos com tripsina-EDTA para 3 min a 37 ° C. Retirar a placa da incubadora e firme, mas suavemente, toque o lado da placa para desalojar as células. Verifique as células sob o microscópio. Se as pilhas são desanexados e flutuante, prossiga. Se as células ainda estão conectadas, incube por mais 3 minutos. Enxaguadura/coletar as células desanexadas usando 5ml de FEM para neutralizar o tripsina-EDTA. Mova a suspensão de fibroblasto em um tubo cônico de 15 mL. Certifique-se que as células são bem misturadas e contá-las em um hemocytometer. Pipete 12.000 células em 4 mL de meio de escaldadas chapeamento da etapa 2.2.4.Nota: Não centrifugar as células em qualquer ponto. O número de células chapeados pode ser ajustado para cima ou para baixo conforme necessário para linhas ou rápido-crescimento lento, respectivamente. Retirar a placa revestida da incubadora e Aspire rhLaminin-521 diluídos de Poços revestidos. Não permita que a superfície dos poços para secar. Suavemente Ressuspender as células em meio de chapeamento. Pipetar 1 mL da suspensão de células para cada um revestido bem (ou seja, 3.000 células por poço). Coloque as células chapeadas em uma incubadora de cultura de tecidos de tri-gás com O2 conjunto 5% (baixo-O2). Quando a placa estiver ajustada para baixo, delicadamente mas completamente disperse as células alternando entre um movimento para cima/para baixo, em seguida, esquerda/direita. Repita os movimentos 2 vezes mais. Incube as células durante a noite. Não agite o prato para misturar. Pipetar 4 mL de meio de um tubo cônico de 15 mL de reprogramação e colocá-lo na incubadora com um tampão afrouxada para equilibrar a noite baixo-O2 . Não adicione bFGF e B18R até ao dia seguinte. 3. início de reprogramação (dia 1) Nota: Uma vez iniciada a reprogramação, manutenção diária é necessária para cerca de 1 mês. Não se esqueça de planejar de acordo. Todos incubação do celular subsequentes deve ser realizadas em condições de baixo-O2 no 37 ° C, 5% de CO2, incubadora de cultura de tecidos de tri-gás umidificado 5% O2 . Substitua o meio de chapeamento de pelo menos 1 h antes do transfection. Retire o meio equilibrado e reprogramação da incubadora de baixo-O2 . Adicione bFGF a uma concentração final de 100 ng/mL e B18R para uma concentração final de 200 ng/mL. Misture bem. Procedendo com 1 bem de cada vez, use uma pipeta de 1 mL para remover o gasto médio e substituí-lo com 1 mL de reprogramação suplementado com bFGF e B18R. Repita isto para cada poço. Não utilize aspiração vácuo, que seca as células excessivamente, provoca estresse e reduz a eficiência de reprogramação. Mova a placa com células de volta para a incubadora de baixo-O2 . Transfect fibroblastos com 5 µ l de reagente de transfeccao RNAiMax por 1 µ g de mRNA modificados, e 1 µ l de reagente de transfeccao por 6 pmol de miRNA imita por transfecção.Nota: Melhores resultados são obtidos quando transfections prosseguir para 16 – 20 h. O reagente de transfeccao é diluída 10 x; a 100 ng / µ l cocktail modificados mRNA é diluído x 5; e a 5 imita pmol / µ l miRNA mistura é diluída 8,33 x com o buffer de transfeccao antes de complexação. Consulte a tabela 1 para obter um resumo da instalação do transfection. Enquanto prepara o transfeccao mistura, minimize exposição potencial dos reagentes a RNase, seguindo práticas de laboratório padrão. Equilibrar uma alíquota do buffer do transfection (etapa 1.3) por cerca de 1h na RT Não use um banho-maria a 37 ° C ou incubadora para aquecer o buffer do transfection. Retire uma alíquota única de mRNAs modificados (33 µ l) e miRNA imita (14 µ l) de-80 ° C e aquecê-las a RT por aproximadamente 3-5 min, até derretido. Não descongele as alíquotas a 37 ° C. Girá-los para baixo brevemente em uma microcentrífuga. Aquecer o reagente de Transfeccao para RT por aproximadamente 3-5 min. Não use um banho-maria a 37 ° C ou incubadora. Inverter o tubo fechado 2 – 3 vezes para misturar o reagente. Gire para baixo brevemente em uma microcentrífuga. Transferi 279 µ l de buffer de Transfeccao de RT em um tubo de microcentrifugadora RNase-livre. Adicione 31 µ l do reagente de Transfeccao para alcançar um volume final de 310 µ l. Mix completamente por pipetagem. Fazer não o vórtice. Incube o tubo em RT por 1 min.Nota: Este volume de reagente de transfeccao diluído é suficiente para o complexo mRNA modificados e miRNA imita alíquotas da etapa 3.2.3. Adicione 132 µ l de buffer de Transfeccao de RT para a alíquota de 33 µ l de mRNA modificados. Pipetar delicadamente para misturar: volume final é µ l 165. Adicione 102.6 µ l de buffer de Transfeccao de RT para a alíquota de 14 µ l de miRNA imita. Pipetar delicadamente para misturar: volume final é 116.6 µ l. Adicione 165 µ l do reagente diluído transfeccao de passo 3.2.5 para o diluídos modificado do mRNA da etapa 3.2.6. Pipeta para misturar: volume final é 330 µ l. Adicione 116.6 µ l de reagente de transfeccao diluídos de passo 3.2.5 à mistura do passo 3.2.7 imita miRNA diluídos. Misture bem (o volume final é 233.2 µ l). Incubar durante 15 min em RT para permitir que o buffer de Transfeccao para complexos com os mRNAs modificados e miRNA imita. Remova a placa com células da incubadora de baixo-O2 . Adicione 100 µ l (1 µ g) do complexado modificado mistura de transfeccao mRNA para cada poço, gota a gota através do poço. Disperse os complexos de transfeccao por delicadamente mas completamente agitar a placa com um movimento para cima/para baixo, em seguida, esquerda/direita. Não agite o prato para misturar. Adicione 66,7 µ l (20 pmol) da mistura do transfection miRNA complexado imita a cada poço, gota a gota através do poço. Disperse a complexos de transfeccao por delicadamente mas completamente agitar a placa com um movimento para cima/para baixo, em seguida, esquerda/direita. Não agite o prato para misturar. Coloque as células transfectadas dentro da incubadora de tri-gás com O2 conjunto 5% (baixo-O2). Quando a placa estiver ajustada para baixo, disperse os complexos de transfeccao novamente por delicadamente mas completamente agitar a placa com um movimento para cima/para baixo, em seguida, esquerda/direita. Pipetar 4 mL de reprogramação médio em um tubo cônico de 15 mL e colocá-lo na incubadora de baixo-O2 com tampa solta para equilibrar durante a noite. Não adicione bFGF e B18R até ao dia seguinte. Tubo 1 – RNAiMax diluição (mistura 1) Reagente Concentração Volume de Buffer de transfeccao Μ L 279 RNAiMax (adicione 2) 10 x Μ L 31 Total: 310 µ l (incubar 1 min à temperatura ambiente) Tubo 2 – mRNA modificados mix (mistura 2) Reagente Concentração Volume de mistura de mRNA modificados 100 ng / µ l (5x) Μ L 33 Buffer de transfeccao Μ L 132 Total: 165 µ l (adicione igual volume de RNAiMax diluído de 1 tubo) Tubo 3 – miRNA imita mistura (mistura 3) Reagente Concentração Volume de miRNA imita mistura 5 pmol / µ l (8.33 x) Μ L 14 Buffer de transfeccao 102.6 Μ l Total: 116.6 µ l (adicione igual volume de RNAiMax diluído de 1 tubo) Tabela 1: Preparação da mistura do transfection. 4. substituição de reprogramação médio entre Transfections (dias 2, 4, 6, 8, 10 e 12) Substitua o pós-transfection médio 16 – 20 h, conforme descrito em 3.1.1–3.1.2. Adicione bFGF a uma concentração final de 100 ng/mL e B18R para uma concentração final de 200 ng/mL em alíquotas médias reprogramação. Monitorar mWasabi expressão diariamente para confirmar a qualidade de transfeccao usando um microscópio configurado para visualizar EGFP.Nota: a expressão mWasabi deve ser minimamente aparente no dia 2 e aumento de brilho com cada transfeccao adicional. 5. todos os outros-dias Transfections (dias 3, 5, 7, 9, 11 e 13) Execute o transfeccao, conforme descrito no passo 3.2. Não altere o meio nos dias do transfection. Preparar uma aliquota de 4 mL de reprogramação médio e coloque-o na incubadora de baixo-O2 para equilibrar a mudança média no dia seguinte. Não adicione bFGF e B18R até ao dia seguinte. 6. os procedimentos a efectuar após a Final do Transfection Executar alterações médias diárias do dia 14, através de aproximadamente dia 17. Aquecer 7 mL de reprogramação de médio a 37 ° C. Adicione bFGF a uma concentração final de 100 ng/mL.Nota: B18R não é mais necessário após o final do transfection. Além do dia 14, já não é necessário equilibrar o meio durante a noite na incubadora de baixo-O2 . Remova o meio de todos os poços, com uma pipeta sorológica. Continue a evitar o uso de aspiração. Adicione 2 mL de reprogramação suplementado com bFGF por bem. Nos dias 17 e 18, analise os poços reprogramados sob um microscópio invertido ou dissecação. Se colônias formam-se em estreita proximidade com os outros devido a alta eficiência de reprogramação e não podem ser manualmente isoladas, separe as colônias através da realização de uma passagem opcional de poços reprogramados descritos na etapa 7 abaixo. Se as colónias são esparsas e bem separadas, escolha manualmente os clones directamente a partir do reprogramadas bem como descrito na etapa 8 e subcultura iPSCs de acordo com protocolos padrão. 7. procedimento opcional: Células de passagem de poços reprogramado usando EDTA Prepare 0,5 mM EDTA em DPBS (EDTA) diluindo a solução estoque de EDTA 0,5 M. Filtro de esterilizar EDTA usando um sistema de vácuo da filtragem de 0,22 µm. Prepare-se isento de alimentador pluripotentes células-tronco (PSC) médio (por exemplo, mTeSR1) de acordo com as instruções do fabricante. Pré-aquecer 32 mL de meio PSC 37 ° c. Cubra todos os poços de duas placas de formato 6-poços com hESC qualificado da matriz extracelular (ECM) seguindo as instruções do fabricante. Placas de vedação com parafina de cinema e incubam-os por 1 h no RT Aspirar a solução ECM as chapas previamente aquecido e substituí-lo com 2 mL do meio de CPS por bem. Não permita que a superfície dos poços para secar. Reserve-os. Aspire a reprogramação médio de 2 poços reprogramadas em um dia, quando as colônias são grandes e claramente formado (geralmente dia 18). Lave uma vez com 1 mL de EDTA e Aspire. Adicione 1 mL de EDTA por bem. Incubar durante 4 min a 37 ° C. Delicadamente, retirar a placa da incubadora e colocá-lo na biossegurança do armário.Nota: neste ponto, as células podem ser muito frouxamente aderidas e facilmente desalojados. Aspire cuidadosamente com EDTA de dois poços. Adicione 3 mL de meio PSC pré-aquecido a cada bem tratados com EDTA. Use um raspador de célula para delicadamente mas completamente deslocar células de dois poços. Use uma pipeta sorológica suavemente Pipetar a suspensão de eritrócitos e terminar em grandes aglomerações. Não Pipete até que todos os grupos de célula sumiram. Preserve clusters de iPSC.Nota: Chapeamento de grandes massas que não afetará consequência natural de colônia de iPSC. Se houver células excessivamente grandes aglomerados, simplesmente Evite transferi-los para o próximo prato. Usando uma pipeta sorológica, distribua uniformemente as células de cada poço tratados com EDTA por pipetagem 0,5 mL em cada poço da placa ECM-revestido 6-poços.Nota: Não combinar células reprogramadas poços (i.e., reprogramado bem 1 deve ser uniformemente distribuída para a primeira placa de 6, e reprogramadas bem 2 deve ser uniformemente distribuída para a segunda placa de 6). Mova as células chapeadas de volta para a incubadora de baixo-O2 . Para distribuir as células, agite cada placa e para trás e de lado. Não agitar o frasco. Substitua o meio PSC diariamente. 8. colheita iPSC colônias Pré-aquecer 15 mL do meio PSC 37 ° c. Cubra todos os poços de uma placa única de 6 com ECM hESC qualificado, seguindo as instruções do fabricante. Selar as placas com película de parafina e incube-os por 1 h no RT Aspire o meio de cultura de poços, sendo usado para coletar iPSCs. Lave uma vez com 1 mL de EDTA e Aspire. Adicione 1 mL de EDTA por bem. Incubar durante 4 min a 37° C. Enquanto as células estão incubando, aspirar a solução ECM as chapas previamente aquecido e substitua por 2 mL do meio de CPS por bem. Reserve as placas. Remova cuidadosamente a placa com iPSCs para ser colhidos a partir da incubadora e colocá-lo na biossegurança do armário.Nota: neste ponto, as células podem ser muito frouxamente aderidas e facilmente desalojados. Aspire cuidadosamente com EDTA. Muito suavemente adicione 3 mL de meio PSC previamente aquecido, tomando cuidado para não desalojar colônias de iPSC. Mova a placa para um escopo invertido ou dissecação para melhor Visualizar colônias. Prepare uma pipeta de 1 mL com uma ponta estéril. Pressione o êmbolo totalmente e, em seguida, use a ponta da pipeta para raspar suavemente uma colônia enquanto desenha lentamente o líquido na ponta para coletar a colônia. Desenhar como meio pouco possível ao escolher a colônia de iPSC. Para transferir a colônia, pipete acima e para baixo 3 a 4 vezes em um único poço da placa ECM-revestido de passo 8.2. Repita até 6 colônias foram escolhidas e transferidas para poços individuais. Escolha não mais de 2 colônias de qualquer poço único se uma passagem opcional descrito no passo 7 foi executada. Use um protocolo padrão células-tronco humanas para congelar para baixo todos os poços restantes. Descongelar e re-placa estoques congelados se mais colônias devem ser colhidas mais tarde. 9. caracterização de iPSCs Realize TRA-1-60 de coloração para análise de reprogramação de eficiência (dia 18).Nota: 2 dos 3 reprogramado poços são passados para a colheita futura colônia. Bem o restante pode ser usado para coloração de TRA-1-60. Este procedimento pode ser realizado na bancada do laboratório. Lave o reprogramadas bem com 1 mL de PBS. Fixe as células com metanol gelada a-20 ° C por 5 min. Aspire o metanol. Seco o poço de aproximadamente 2 min. tenha cuidado para não secar demasiado. As células tenham secado bastante quando eles se tornam uma cor translúcida/fosco. Lave os bem 3 vezes com 1 mL de PBS por 5 min com agitação suave. Durante as lavagens, prepare-se 3 mL de peróxido de hidrogênio 3% em PBS. Aspire a PBS. Adicione 2 mL de solução diluída de peróxido. Incube durante 15 min em RT com agitação suave. Preparar 4 mL da solução de bloqueio: 10% albumina de soro bovino (BSA) em PBS. Aspire a solução de peróxido. Lave os bem 2 vezes com 1 mL de PBS por 5 min. Aspire PBS e adicionar 2 mL de solução de bloqueio dentro do poço. Incubar durante 1 h em RT. Lave os bem 3 vezes com 1 mL de PBS por 5 min com agitação suave. Dilua o principal anticorpo anti-TRA-1-60 de 1: 100 em solução bloqueio suplementada com 0,05% de azida de sódio. Prepare-se 1 mL da diluição de anticorpo para 1 bem de um prato de formato 6-poços. Adicionar a diluição do anticorpo para o bem e enrole a placa com parafilm para evitar a evaporação. Incube durante uma noite a 4 ° C, com agitação suave.Nota: Se necessário, a incubação com o anticorpo primário pode ser feita por 1h no RT com agitação suave. A diluição do anticorpo primário pode ser reutilizada até 5 vezes. Após a incubação com o anticorpo primário, lave os bem 3 vezes com 1 mL de PBS por 5 min com agitação suave. Dilua anti-rato HRP-conjugado anticorpo secundário no 1: 200 na solução de bloqueio. Incube o poço com a diluição de anticorpo secundário para 2h em RT com agitação suave. Aspirar a diluição do anticorpo secundário e lave os bem 3 vezes com 1 mL de PBS por 5 min com agitação suave. Durante a terceira lavagem, prepare a solução de substrato, seguindo as instruções do fabricante. Após a lavagem final, Aspire PBS. Adicione 1 mL da solução de substrato e incubar até a cor desejada desenvolve (aproximadamente 10 min). Aspire a solução de substrato. Enxágue bem com água por 5 min agitando suavemente. Conte as colônias, se desejado. Reprogramação de eficiência = (número de colônias) / (número de fibroblastos chapeados) x 100%. Para armazenamento a longo prazo, aspirar a água do prato manchada e secar ao ar durante a noite às RT. fechar a placa seca com parafilm e armazenar a 4 ° C por até 2 anos avaliar a eficiência de reprogramação mais tarde.