RNA-basierten Reprogrammierung von menschlichen primäre Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen

RNase-freie Bedingungen arbeiten Sie und aseptische Techniken wenn möglich. Führen Sie alle Zelle kulturbezogene Manipulationen in einer biologischen Sicherheitsschrank mit aseptischen Techniken. Folgen Sie institutionelle Biosafety Standards für die Arbeit mit menschlichen Zellen. 1. Reagenzien und Geräte zur Vorbereitung der Neuprogrammierung Einleitung Bereiten Sie die geändert-mRNA cocktail Codierung Neuprogrammierung Faktoren. Folgen Sie die bisher veröffentlichten Protokoll10 um in-vitro- Transkription, Begrenzung, und dephosphorylation Verfahren für jede veränderte mRNA Kodierung Neuprogrammierung Faktor. Nach der letzten Aufbereitungsschritt eluieren die modifizierte mRNA mit Nuklease-freies Wasser, ergänzen die gereinigten modifizierte mRNA-Lösung mit 1 U/µL RNase-Inhibitor quantitate die modifizierte mRNAs mit einem Spektralphotometer und bei-80 ° C für bis zu 6 Monate zu speichern. Bereiten Sie mehrere Aliquote jede veränderte mRNA zur Minimierung der Anzahl der Frost-Tau-wechseln.Hinweis: Ähnliche Protokolle für modifizierte mRNA Produktion wurden berichtet an anderer Stelle5,8,11. Vorlagen für in-vitro- Transkription können durch PCR-Amplifikation von entsprechenden Plasmid-Vorlagen mit Primer in der Tabelle der Materialien gemäß den zuvor veröffentlichten Protokoll10aufgeführten generiert werden. Plasmid-Vorlagen für jeden Neuprogrammierung Faktor (M3O9, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG, LIN28A) und mWasabi (Kontrolle zur Transfektion) von Addgene, ein Non-Profit-Plasmid-Repository verfügbar sind. Mischen Sie die modifizierte mRNAs in einem molaren Verhältnis von 3:1:1:1:1:1 (M3O: SOX2: KLF4: cMYC: NANOG: LIN28A) und beinhalten 10 % mWasabi modifizierte mRNA als ein Steuerelement für die Transfektion Effizienz. Passen Sie die Konzentration der komplette modifizierte mRNA Umprogrammierung mischen, um eine Endkonzentration von 100 ng/µL indem Nuklease-freie Wasser mit 1 U/µL RNase-Inhibitor ergänzt. Bereiten Sie sieben 33 µL-Aliquots der kompletten geändert mRNA-Cocktail. Speichern der gemischten Neuprogrammierung Aliquote bei-80 ° C.Hinweis: für jede Transfektion 1.000 ng der modifizierte mRNA-Cocktail wird pro Bohrloch hinzugefügt (d. h. insgesamt 3.000 ng für 3 Brunnen). Jede 33 µL aliquoten ist bemessen, um 3 Brunnen einer 6-Well-Format-Platte transfizieren und umfasst 3 µL überschüssige Menge zu pipettieren Fehler ausmachen. Vorbereitung sieben 33 µL-Aliquots ist ausreichend, füllen Sie eine volle Fibroblasten Neuprogrammierung des 3 Brunnen in einer 6-Well-Format-Platte. Bereiten Sie den Cocktail der Neuprogrammierung MiRNA imitiert. Auflösen, lyophilisiert MiRNA Mimik (Syn-hat-MiR-302a – 3p, Syn-hat-MiR-302b – 3p, Syn-hat-MiR – 302c – 3p, Syn-hat-MiR-302d-3 p, Syn-hat-MiR-367-3 p), eine Endkonzentration von 5 Pmol/µL (5 µM) in Nuklease-freies Wasser mit 1 U/µL RNase-Inhibitor ergänzt. Bereiten Sie mehrere Aliquote jede MiRNA Mimik und bei-80 ° C für langfristige Lagerung Lagern. Mischen Sie alle MiRNA Mimik in einem Molverhältnis von 1:1:1:1:1, eine Endkonzentration von 5 Pmol/µL (5 µM). Bereiten Sie sieben 14 µL-Aliquots von der MiRNA imitiert Mischung. Speichern der gemischten Aliquote bei-80 ° C.Hinweis: Für jede Transfektion wird 20 Pmol des MiRNA-Mimik-Mix pro Bohrloch (d. h. insgesamt 60 Pmol für 3 Brunnen) hinzugefügt. Jedes 14 µL aliquoten ist bemessen, um 3 Brunnen einer 6-Well-Format-Platte transfizieren und beinhaltet 2 µL überschüssige Menge zu pipettieren Fehler ausmachen. Vorbereitung sieben 14 µL-Aliquots ist ausreichend, füllen Sie eine volle Fibroblasten Neuprogrammierung des 3 Brunnen in einer 6-Well-Format-Platte. Bereiten Sie die Transfektion Puffer. Vorwärmen einer 500 mL-Flasche und eine 100 mL Flasche frisch reduziert Serum Mittel-bis ca. 2 h bei Raumtemperatur (RT). Verwenden Sie kein Wasserbad. Übertragen Sie einen pH-Meter auf eine biologische Schrank. Waschen Sie das Messgerät Glaselektrode mit Nuklease-freies Wasser. Kalibrieren Sie das pH-Meter gemäß den Anweisungen des Herstellers. Waschen Sie die Elektrode wieder mit Nuklease-freies Wasser. Übertragen Sie beide Flaschen reduziert Serum Medium in der Biosicherheit Schrank. Verwenden Sie zur Einstellung des pH-Wertes der RT 500 mL Flasche. Messen Sie den Basen pH-Wert des Mediums reduziert Serum durch Einfügen des pH-Messgerätes Glaselektrode in den Puffer. Warten Sie bis zu 1 min vor dem Lesen des pH-Werts auf dem Zähler. Fügen Sie 3 – 4 mL 1 M NaOH in 500 mL reduziert Serum Medium, verschließen Sie die Flasche und mischen Sie gut. Warten Sie bis zu 5 min, vor dem Öffnen der Flasche für pH-Messung. Legen Sie das pH-Meter-Elektrode in den Puffer und warten Sie, bis die Lesung am pH-Meter stabilisiert. Weitere kleine Volumen von 1 M NaOH hinzu, bis der pH-Wert des Mediums reduziert Serum 8.15 – 8.17 erreicht. Kalibrieren Sie das pH-Meter mehrmals während des Prozesses. Wenn der pH-Wert zu jedem Zeitpunkt höher als 8,18 wird, reduzieren sie durch Zugabe von frischen reduziert Serum Medium aus der vorgewärmten 100 mL-Flasche (Schritt 1.3.1).Hinweis: Der pH-Wert des Puffers reduziert Serum Medium-basierte Transfektion ist wichtig. Umprogrammierung wird erfolgreich sein, wenn der pH-Wert des Puffers Transfektion etwa 8,2 ± 0,05 ist aber fehlschlagen kann, wenn der pH-Wert höher als 8,25 ist. Daher ist es ratsam zu stoppen, NaOH hinzufügen, sobald der Puffer pH 8,15-8.17 erreicht. Dadurch wird sichergestellt, dass der endgültige pH-Wert des Puffers Transfektion ca. 8,2 – 8,22 nach der Sterilisation. Filter zu sterilisieren den Transfektion Puffer mit einem 0,22 µm Vakuumfiltration System. Aliquot der sterilisierten Puffer in 5 oder 15 mL Röhrchen mit minimalen Luftraum. Lagern Sie Aliquote des Puffers Transfektion für bis zu 3 Monate bei 4 ° c Messen Sie den pH-Wert der Aliquote in regelmäßigen Abständen. Die Aliquote zu verwerfen, wenn der pH-Wert höher als 8,25. Begrenzen Sie aliquoten Nutzung, 2 Transfektionen, nur da Exposition des Puffers Transfektion, atmosphärische Luft den pH-Wert des Puffers erhöht. Bereiten Sie die Fibroblasten Erweiterung Medium (FEM): minimale wesentliche Medium mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 x 1 X Glutamin ergänzen und nicht-essentiellen Aminosäuren, 55 µM 2-Mercaptoethanol, 1 X Pen/Strep/Fungizone ergänzt. Speichern der FEM bei 4 ° C. Vorbereiten der Neuprogrammierung Medium: DMEM/F12 (keine HEPES) mit 20 % Ko Serum Ersatz (KOSR), 0,5 x nicht-essentiellen Aminosäuren, 0,5 X Glutamin ergänzen, 55 µM 2-Mercaptoethanol, 50 µg/mL Ascorbinsäure, 1 X Stift/Strep/Fungizone, 100 ng/mL bFGF ergänzt , und 200 ng/mL B18R. Bereiten Sie das Medium bei Einleitung der Reprogrammierung ohne bFGF und B18R, und bei 4 ° c lagern Nicht nach 1 Monat nach Vorbereitung verwenden. Fügen Sie bFGF und B18R unmittelbar vor jedem Gebrauch eine aliquote Größe für diesen Tag nutzen hinzu. Bereiten Sie die Beschichtung Medium durch Zugabe von 5 % Hitze-inaktivierten (HI) FBS in der Neuprogrammierung Medium mit 20 % KOSR ohne bFGF und B18R aus Schritt 1.5. Am Tag der beabsichtigten Verwendung der mittlere frisch zubereiten. Fügen Sie bFGF und B18R unmittelbar vor der Anwendung am Tag 0 der Neuprogrammierung. Kalibrieren der Gewebekultur Inkubatoren vor dem Beginn der Reprogrammierung nach den Anweisungen des Herstellers mit einem handheld digital CO2 -Analysator. Verwenden Sie einen Low-O2 -Inkubator für die Neuprogrammierung Schritte zur erfolgreichen iPSC Generation sorgen. 2. Kultivierung Fibroblasten Umprogrammierung Bereiten Sie Fibroblasten vor Einleitung einer Neuprogrammierung (Tag -2). Eine neue 10 cm Gewebekultur Platte mit 5 mL 0,1 % Gelatine zu beschichten. Tippen Sie auf oder schwenken Sie die Platte, um sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche beschichtet ist. 15 min bei 37 ° c inkubieren Aspirieren Sie Gelatine und 10 mL FEM Set beiseite. Lassen Sie sich nicht die beschichtete Oberfläche der Platte zum Trocknen vor der Zugabe FEM. Aspirieren Sie sorgfältig das abgebrannte Medium aus der Fibroblasten. Spülen Sie die Zellen einmal mit 5 mL des DPBS, das restliche Serum zu entfernen. 3 mL Trypsin-EDTA hinzugeben. Schütteln Sie die Platte, um vollständige Abdeckung über der Zellen zu gewährleisten. Aspirieren Sie überschüssigen Flüssigkeit, ~ 500 µL von Trypsin zu verlassen. Nicht übermäßig abzusaugen, da kann das Trocknen und die Fibroblasten zu töten. Inkubieren Sie die Fibroblasten mit Trypsin-EDTA für 3 min bei 37 ° c Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und fest aber vorsichtig auf die Seite der Platte, die Zellen zu verdrängen. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Wenn die Zellen abgetrennt und schwebend sind, fahren Sie fort. Wenn die Zellen noch hängen, für weitere 3 min inkubieren. Schnell spülen/sammeln der freistehenden Zellen mittels FEM 5 mL Trypsin-EDTA neutralisieren. Bewegen Sie die Fibroblasten-Suspension in einem 15 mL konische Röhrchen. Stellen Sie sicher, dass die Zellen gut gemischt sind. Mischen Sie vorsichtig die Zellsuspension um große Klumpen von Zellen zu brechen, dann zählen sie auf eine Hemocytometer. Transfer 2,5 x 105 Zellen in die Gelatine beschichtet 10-cm-Schüssel in Schritt 2.1.1 vorbereitet. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2 befeuchtete regelmäßige Gewebekultur Inkubator.Hinweis: Die Zelldichte ist entscheidend für hohe Neuprogrammierung Effizienz zu erreichen, da es wichtig ist, dass die Fibroblasten gesund und schnell teilenden sind. Beschichtung 2,5 x 105 Zellen ergibt sich eine 40-60 % Konfluenz 2 Tage später für die meisten Fibroblasten Proben. Passen Sie die Menge entsprechend für kranke oder alternde Zellen, die gewünschte 40-60 % Konfluenz 48 h später zu erreichen. Ersetzen Sie das Medium mit 10 mL frisches FEM am Folgetag (Tag-1). Platte die Fibroblasten zur Neuprogrammierung (Tag 0) zu initiieren. Überprüfen Sie die Fibroblasten umprogrammiert werden bei 40 – 60 % Konfluenz (Abbildung 2, Tag 0). Wenn die Zellen über- oder unter Zusammenfluss sind, Durchgang der Fibroblasten, wie unter Punkt 2.1 beschrieben und die Dichte Beschichtung entsprechend anzupassen. Kultur für weitere 2 Tage. Überführen Sie 4 mL des DPBS in ein 15 mL konische Röhrchen. Fügen Sie 100 µL der rekombinanten menschlichen (Rh) Laminin-521. Pipette rauf und runter, um gründlich zu mischen. Fügen Sie 1 ml pro Bohrloch des verdünnten RhLaminin-521 in 3 Brunnen von einem 6-Well-Platte. Inkubieren Sie die beschichtete Platte bei 37 ° C für 2 h. 6 mL FEM und 4 mL Beschichtung Mittel-bis 37 ° c warm Ergänzen Sie die Beschichtung Medium mit bFGF, eine Endkonzentration von 100 ng/mL und B18R, eine Endkonzentration von 200 ng/mL. Aspirieren Sie sorgfältig das abgebrannte Medium von Fibroblasten (Schritt 2.2.1). Spülen Sie die Zellen mit 5 mL des DPBS und 3 mL Trypsin-EDTA. Schütteln Sie die Platte, um die Zellen mit Trypsin-EDTA zu decken. Aspirieren Sie überschüssigen Flüssigkeit, ~ 500 µL von Trypsin, verlassen, wie in Schritt 2.1.3 getan. Inkubieren Sie die Fibroblasten mit Trypsin-EDTA für 3 min bei 37 ° c Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und fest aber vorsichtig auf die Seite der Platte, Zellen zu verdrängen. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Wenn die Zellen abgetrennt und schwebend sind, fahren Sie fort. Wenn die Zellen noch hängen, für weitere 3 min inkubieren. Spülen/sammeln der freistehenden Zellen mittels FEM 5 mL Trypsin-EDTA neutralisieren. Bewegen Sie die Fibroblasten-Suspension in einem 15 mL konische Röhrchen. Stellen Sie sicher, dass die Zellen gut gemischt sind und auf eine Hemocytometer zählen. Pipette 12.000 Zellen in 4 mL Medium vorgewärmte Überzug aus Schritt 2.2.4.Hinweis: Zentrifugieren Sie die Zellen an jedem beliebigen Punkt nicht. Die Anzahl der vergoldeten Zellen einstellbar nach oben oder unten je nach Bedarf für langsam oder schnell-wachsende Linien, beziehungsweise. Entfernen Sie die beschichtete Platte aus dem Inkubator und aspirieren Sie verdünnte RhLaminin-521 aus den beschichteten Vertiefungen. Lassen Sie nicht die Oberfläche der Brunnen trocken. Aufschwemmen Sie sanft Zellen Mittel-und Beschichtung. 1 mL Zellsuspension in jedem beschichtet Pipette gut (d. h. 3.000 Zellen pro Well). Legen Sie die vergoldeten Zellen in ein Trigas-Gewebekultur Inkubator mit O2 bis 5 % (Low-O2) festgelegt. Sobald die Platte nach unten festgelegt ist, Dispergieren Sie sanft aber gründlich Zellen durch den Wechsel zwischen einer nach oben/unten und links/rechts Bewegung. Wiederholen Sie die Anträge 2 weitere Male. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht. Schwenken Sie die Platte zu mischen nicht. Reprogrammierung Mittel-bis eine 15 mL konische Rohr 4 mL Pipette und legen Sie sie in den Low-O2 Inkubator mit einer gelockerten Kappe, über Nacht equilibrate. Fügen Sie bFGF und B18R nicht bis zum nächsten Tag. 3. Einleitung des Reprogramming (Tag 1) Hinweis: Sobald die Reprogrammierung initiiert wird, ist tägliche Wartung erforderlich für ca. 1 Monat. Achten Sie darauf, entsprechend zu planen. Alle nachfolgenden Zelle Inkubationen müssen unter Low-O2 Bedingungen im 37 ° C, 5 % CO2, 5 % O2 befeuchtete Trigas Gewebekultur Brutkasten durchgeführt werden. Ersetzen Sie das Überzug Medium mindestens 1 h vor Transfektion. Entfernen Sie die äquilibriert Neuprogrammierung Mittel aus dem Low-O2 -Inkubator. Fügen Sie bFGF hinzu, eine Endkonzentration von 100 ng/mL und B18R, eine Endkonzentration von 200 ng/mL. Mischen Sie gut. Verfahren mit 1 gut zu einem Zeitpunkt, eine 1-mL-Pipette verwenden Sie, um das verbrauchte Medium zu entfernen und ersetzen Sie es mit 1 mL der Neuprogrammierung Medium mit bFGF und B18R ergänzt. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes gut. Verwenden Sie keine Vakuum Aspiration, die übermäßig trocknet die Zellen, verursacht Stress und Neuprogrammierung Effizienz reduziert. Die Platte mit Zellen in den Low-O2 Inkubator zurück. Transfizieren Fibroblasten mit 5 µL RNAiMax Transfection Reagens pro 1 µg der modifizierte mRNA, und 1 µL des Transfection Reagens pro 6 Pmol von MiRNA imitiert pro Transfektion.Hinweis: Optimale Ergebnisse werden erzielt, wenn Transfektionen für 16-20 h gehen. Die Transfektion Reagenz ist verdünnter 10 X; die 100 ng/µL modifizierte mRNA cocktail ist verdünnt 5 X; und die 5 Pmol/µL MiRNA imitiert, die Mischung ist verdünnt 8,33 x mit der Transfektion Puffer vor der Komplexierung. Eine Zusammenfassung der Transfektion Setup finden Sie unter Tabelle 1 . Während der Vorbereitung der Transfektion mischt, um zu minimieren potentielle Reagenzien RNase indem Sie die folgenden standard-Labor-Praxis. Equilibrate ein Aliquot des Puffers Transfektion (Schritt 1.3) für ca. 1 h bei RT Verwenden Sie eine 37 ° C Wasserbad oder Inkubator nicht zum Aufwärmen des Transfektion Puffers. Entfernen einer einzigen aliquoten modifizierte mRNAs (33 µL) und MiRNA imitiert (14 µL) von-80 ° C und wärmen sie auf RT für ca. 3-5 min bis aufgetaut. Nicht Auftauen der Aliquote bei 37 ° C. Drehen sie sich kurz in ein Microfuge. Wärmen Sie die Transfektion Reagenz RT ca. 3-5 Minuten. Verwenden Sie keine 37 ° C Wasserbad oder Inkubator. Invertieren der geschlossenen Rohr 2 – 3 Mal um das Reagenz zu mischen. Drehen Sie es nach unten kurz in ein Microfuge. Übertragen Sie 279 µL des Puffers RT Transfektion in eine RNase-freie Microcentrifuge Schlauch. Fügen Sie 31 µL des Transfection Reagens zu einem Endvolumen von 310 µL. Mischung gründlich durch pipettieren. Tun Sie nicht Wirbel. Inkubieren Sie das Rohr bei RT für 1 min.Anmerkung: Dieses Volumen des verdünnten Transfection Reagens reicht bis hin zu komplexen modifizierte mRNA und MiRNA imitiert Aliquote aus Schritt 3.2.3. Die 33 µL aliquoten modifizierte mRNA 132 µL des Puffers RT Transfektion hinzufügen. Pipette vorsichtig mischen: Endvolumen ist 165 µL. 14 µL aliquoten von MiRNA Fließbildern 102,6 µL des Puffers RT Transfektion hinzufügen. Pipette vorsichtig mischen: Endvolumen ist 116.6 µL. Fügen Sie 165 µL des verdünnten Transfection Reagens aus Schritt 3.2.5 zu den verdünnten mRNA aus Schritt 3.2.6 geändert. Pipette zum Mischen: Endvolumen ist 330 µL. Die verdünnte MiRNA Mimik Mischung aus Schritt 3.2.7 116.6 µL des verdünnten Transfection Reagens aus Schritt 3.2.5 hinzufügen. Gut mischen (Endvolumen ist 233.2 µL). 15 min bei RT erlauben die Transfektion Puffer bis hin zu komplexen mit der modifizierten mRNAs inkubieren und MiRNA imitiert. Entfernen Sie die Platte mit Zellen aus dem Low-O2 -Inkubator. Fügen Sie 100 µL (1 µg) die komplexiert mRNA Transfektion Mischung in jede Vertiefung tropfenweise die gut rüber geändert. Die Transfektion komplexe durch sanft aber gründlich rühren die Platte mit einer nach oben/unten und links/rechts Bewegung zu zerstreuen. Schwenken Sie die Platte zu mischen nicht. Fügen Sie 66,7 µL (20 Pmol) komplexiert MiRNA Mimik Transfektion Mix in jede Vertiefung tropfenweise das gut rüber. Transfektion komplexe durch sanft aber gründlich rühren die Platte mit einer nach oben/unten und links/rechts Bewegung zu zerstreuen. Schwenken Sie die Platte zu mischen nicht. Setzen Sie die transfizierten Zellen Trigas-Brutkasten mit O2 bis 5 % (Low-O2) festgelegt. Sobald die Platte nach unten festgelegt ist, verteilen Sie sich die Transfektion komplexe wieder sanft aber gründlich rühren die Platte mit einer nach oben/unten und links/rechts Bewegung. Reprogrammierung Medium in einer 15 mL konische Rohr 4 mL Pipette und legen Sie sie in den Low-O2 Inkubator mit gelösten Deckel über Nacht equilibrate. Fügen Sie bFGF und B18R nicht bis zum nächsten Tag. Rohr 1 – RNAiMax-Verdünnung (1. Mix) Reagenz Konzentration Volumen Transfektion Puffer 279 ΜL RNAiMax (add 2) 10 x 31 ΜL Gesamt: 310 µL (inkubieren Sie 1 min bei Raumtemperatur) Rohr 2 – modifizierte mRNA mix (2. Mischung) Reagenz Konzentration Volumen modifizierte mRNA-Mischung 100 ng/µL (5 X) 33 ΜL Transfektion Puffer 132 ΜL Gesamt: 165 µL (gleiches Volumen des verdünnten RNAiMax aus Rohr 1 hinzufügen) Rohr 3 – MiRNA Mimik mix (3. Mischung) Reagenz Konzentration Volumen MiRNA imitiert Mischung 5 Pmol/µL (8,33 X) 14 ΜL Transfektion Puffer 102,6 ΜL Gesamt: 116.6 µL (gleiches Volumen des verdünnten RNAiMax aus Rohr 1 hinzufügen) Tabelle 1: Vorbereitung der Transfektion Mischung. 4. ersetzen Reprogramming Medium zwischen Transfektionen (2, 4, 6, 8, 10 und 12 Tage) Die mittleren 16-20 h nach Transfektion zu ersetzen, wie in 3.1.1–3.1.2 beschrieben. Hinzu kommt eine Endkonzentration von 100 ng/mL und B18R, eine Endkonzentration von 200 ng/mL in Neuprogrammierung mittlere Aliquote bFGF. Überwachen Sie mWasabi Ausdruck täglich Transfektion Qualität unter Verwendung eines Mikroskops, so konfiguriert, dass EGFP visualisieren zu bestätigen.Hinweis: mWasabi Ausdruck sollte minimal ersichtlich sein, am 2. Tag und Erhöhung der Helligkeit mit jeder zusätzlichen Transfektion. (5) jeden zweiten Tag Transfektionen (3, 5, 7, 9, 11 und 13 Tage) Führen Sie die Transfektion, wie in Schritt 3.2 beschrieben. Ändern Sie das Medium nicht auf Tage der Transfektion. Bereiten Sie eine 4 mL Aliquot der Neuprogrammierung Medium und legen Sie sie in den Low-O2 Inkubator für die mittlere Änderung am Folgetag equilibrate. Fügen Sie bFGF und B18R nicht bis zum nächsten Tag. 6. Verfahren nach endgültigen Transfection durchgeführt werden Führen tägliche mittlere Änderungen vom 14. Tag bis ca. 17. Tag. 7 mL der Neuprogrammierung Mittel-bis 37 ° c warm Fügen Sie bFGF hinzu, eine Endkonzentration von 100 ng/mL.Hinweis: B18R entfällt nach der endgültigen Transfection. Über Tag 14 ist es nicht mehr notwendig, das Medium über Nacht im Brutschrank Low-O2 equilibrate. Entfernen Sie das Medium aus allen Brunnen mit einer serologischen Pipette. Weiterhin vermeiden Sie die Verwendung von Aspiration. Hinzugeben Sie 2 mL Medium ergänzt mit bFGF pro Bohrloch Umprogrammierung. Analysieren Sie an den Tagen, 17 und 18 die umprogrammierten Brunnen unter einem invertierten oder sezierenden Mikroskop. Wenn Kolonien sich in der Nähe zueinander durch hohen Wirkungsgrad der Neuprogrammierung bilden und nicht manuell isoliert werden kann, trennen Sie die Kolonien durch eine optionale Passagierung umprogrammierten Brunnen in Schritt 7 unten beschrieben durchführen. Wenn Kolonien spärlich und gut getrennt sind, manuell wählen Sie die Klone direkt aus der umprogrammierten nun, wie in Schritt 8 und Subkultur iPSCs nach Standardprotokollen beschrieben aus. 7. Optional Verfahren: Passagierung Zellen aus umprogrammiert Brunnen mit EDTA Bereiten Sie 0,5 mM EDTA in DPBS (EDTA vor) durch Verdünnung 0,5 M EDTA Vorratslösung. Filter zu sterilisieren EDTA mit einem 0,22 µm Vakuumfiltration System. Bereiten Sie Feeder-freie pluripotenten Stammzellen (PSC) Medium (z. B. mTeSR1) entsprechend den Anweisungen des Herstellers. 32 mL PSC Mittel-bis 37 ° c Vorwärmen Alle Brunnen aus zwei 6-Well-Format-Platten mit hESC-qualifizierte extrazelluläre Matrix (ECM) nach den Anweisungen des Herstellers zu beschichten. Dichtplatten mit Paraffin zu Filmen und inkubieren sie für 1 h bei RT Aspirieren der ECM-Lösung von den vorgewärmten Tellern und ersetzen Sie es mit 2 mL PSC Medium pro Bohrloch. Lassen Sie nicht die Oberfläche der Brunnen trocken. Legen Sie sie beiseite. Aspirieren der Neuprogrammierung Medium aus 2 umprogrammierten Brunnen an einem Tag, wenn die Kolonien groß und klar geformte sind (in der Regel Tag 18). Spülen Sie einmal mit 1 mL EDTA und Absaugen. Fügen Sie 1 mL EDTA pro Bohrloch. 4 min bei 37 ° c inkubieren Schonend entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und legen Sie sie in die Biosicherheit Kabinett.Hinweis: an dieser Stelle können Zellen sehr locker eingehalten und leicht verdrängt werden. Aspirieren Sie sorgfältig EDTA aus beiden Brunnen. Fügen Sie 3 mL vorgewärmten PSC Medium zu jedem gut behandelt mit EDTA. Verwenden Sie einen Zelle-Schaber, um sanft aber gründlich Zellen aus den beiden Brunnen zu verdrängen. Verwenden einer serologischen Pipette vorsichtig pipette die Zellsuspension und unterteilen Sie große Klumpen. Nicht pipette, bis die Zelle Klumpen verschwunden sind. Erhalten Sie iPSC-Cluster.Hinweis: Große Klumpen Plating iPSC Kolonie Auswuchs wirkt nicht. Wenn es übermäßig große Zelle Klumpen gibt, vermeiden Sie einfach in das nächste Gericht zu übertragen. Mit einer serologischen Pipette, gleichmäßig verteilen Sie Zellen aus jedem Brunnen EDTA behandelt durch Pipettieren 0,5 mL in jede Vertiefung der ECM-beschichteten 6-Well-Platte.Hinweis: Zellen aus den umprogrammierten Brunnen nicht kombinieren (z.B. umprogrammiert gut 1 sollten gleichmäßig verteilt werden, in den ersten 6-Well-Platte und umprogrammierten gut 2 sollten gleichmäßig verteilt werden, in der zweiten 6-Well-Platte). Die vergoldeten Zellen in den Low-O2 Inkubator zurück. Um Zellen gleichmäßig zu verteilen, schütteln Sie jede Platte hin- und Herbewegung und von Seite zu Seite. Nicht schwenken. Ersetzen Sie täglich das PSC-Medium. 8. Entnahme iPSC Kolonien 15 mL PSC Mittel-bis 37 ° c Vorwärmen Bestreichen Sie alle Brunnen von einem einzigen 6-Well-Platte mit hESC-qualifizierte ECM nach den Anweisungen des Herstellers. Versiegeln Sie die Platten mit Paraffin Film zu und inkubieren sie für 1 h bei RT Aspirieren Sie das Kulturmedium aus Brunnen iPSCs sammeln verwendet wird. Spülen Sie einmal mit 1 mL EDTA und Absaugen. Fügen Sie 1 mL EDTA pro Bohrloch. 4 min bei 37° c inkubieren Während die Zellen Inkubation sind, Aspirieren der ECM-Lösung von den vorgewärmten Tellern und mit 2 mL PSC Medium pro Bohrloch zu ersetzen. Die Teller beiseite stellen. Entfernen Sie vorsichtig die Platte mit iPSCs abgeholt aus dem Inkubator und legen Sie sie in die Biosicherheit Kabinett.Hinweis: an dieser Stelle können Zellen sehr locker eingehalten und leicht verdrängt werden. Aspirieren Sie sorgfältig EDTA. Fügen Sie sehr sanft 3 mL vorgewärmten PSC Medium, kümmert sich nicht um iPSC Kolonien zu vertreiben. Bewegen Sie die Platte an einen umgekehrten oder sezierenden Bereich besser zu visualisieren Kolonien. Bereiten Sie eine 1-mL-Pipette mit einer sterilen Spitze. Drücken Sie den Kolben vollständig, dann verwenden Sie die Pipettenspitze vorsichtig kratzen eine Kolonie während des Zeichnens langsam Flüssigkeit in die Spitze, die Kolonie zu sammeln. Zeichnen Sie als wenig Mittel wie möglich beim Pflücken der iPSC-Kolonie. Um die Kolonie zu übertragen, pipette 3 – 4 Mal rauf und runter in einem einzigen Brunnen der ECM-beschichtete Platte aus Schritt 8.2. Wiederholen Sie bis 6 Kolonien abgeholt und in einzelnen Wells überführt wurden. Wählen Sie no more als 2 Kolonien aus jedem einzelnen Brunnen, wenn eine optionale Passagierung in Schritt 7 beschrieben durchgeführt wurde. Verwenden Sie ein standard humanen Stammzellen-Protokoll, um unten alle verbleibenden Brunnen einfrieren. Auftauen lassen und neu Platte gefrorenen Vorräte, wenn weitere Kolonien später abgeholt werden müssen. (9) Charakterisierung der iPSCs Durchführen Sie TRA-1-60 Färbung für die Analyse der Effizienz (Tag 18) Neuprogrammierung.Hinweis: 2 von 3 umprogrammiert Brunnen sind für die zukünftige Kolonie Kommissionierung passagiert. Die restlichen gut einsetzbar für TRA-1-60 zu beflecken. Dieses Verfahren kann auf die Labor-Benchtop durchgeführt werden. Waschen Sie die umprogrammierten gut mit 1 mL PBS. Zellen mit eiskalten Methanol bei-20 ° C für 5 min zu beheben. Aspirieren Sie Methanol. Trocken gut für ca. 2 min. Seien Sie vorsichtig, nicht übermäßig trocken. Die Zellen sind genug, wenn sie eine transluzente/Matte Farbe werden getrocknet. Waschen Sie die gut 3 Mal mit 1 mL PBS für 5 min mit sanft schütteln. Während der Waschgänge bereiten Sie 3 mL 3 % Wasserstoffperoxid in PBS. Aspirieren Sie die PBS. 2 mL verdünnte Wasserstoffperoxid-Lösung zugeben. 15 min bei RT mit sanft schütteln inkubieren. 4 mL der blockierenden Lösung vorbereiten: 10 % Bovine Serum Albumin (BSA) in PBS. Aspirieren der Peroxid-Lösung. Waschen Sie nun 2 Mal mit 1 mL PBS für 5 Minuten. Aspirieren Sie PBS und 2 mL Lösung in den Brunnen zu blockieren. 1 h bei RT inkubieren Waschen Sie die gut 3 Mal mit 1 mL PBS für 5 min mit sanft schütteln. Verdünnen Sie Primärantikörper Anti-TRA-1-60 in 1: 100 in der blockierenden Lösung ergänzt mit 0,05 % Natriumazid. 1 mL der Antikörper Verdünnung für 1 auch ein 6-Well-Format Gericht vorzubereiten. Der Brunnen der Antikörper-Verdünnung hinzu und wickeln Sie die Platte mit Parafilm um Verdunstung zu vermeiden. Inkubation über Nacht bei 4 ° C mit sanft schütteln.Hinweis: Bei Bedarf kann die Inkubation mit dem primären Antikörper für 1 h bei RT mit sanft schütteln erfolgen. Die Primärantikörper Verdünnung kann bis zu 5 mal wiederverwendet werden. Waschen Sie nach der Inkubation mit dem primären Antikörper auch 3 Mal mit 1 mL PBS für 5 min mit sanft schütteln. Verdünnen Sie die Anti-Maus HRP-konjugierten Sekundärantikörper bei 1: 200 in der blockierenden Lösung. Inkubieren Sie den Brunnen mit der Sekundärantikörper Verdünnung für 2 h bei RT mit sanft schütteln. Aspirieren der Sekundärantikörper Verdünnung und waschen Sie auch 3 Mal mit 1 mL PBS für 5 min mit sanft schütteln. Bereiten Sie beim dritten waschen die Substratlösung nach Anweisungen des Herstellers. Aspirieren Sie nach der letzten Wäsche PBS. Fügen Sie 1 mL der Substratlösung hinzu und inkubieren Sie bis die gewünschte Farbe (ca. 10 min) entwickelt. Aspirieren Sie die Substratlösung. Spülen Sie den Brunnen mit Wasser für 5 min unter sanft schütteln. Zählen der Kolonien, falls gewünscht. Reprogrammierung Effizienz = (Anzahl der Kolonien) / (Anzahl der vergoldeten Fibroblasten) x 100 %. Aspirieren Sie für die langfristige Lagerung Wasser aus den bunten Teller und an der Luft trocknen über Nacht bei RT Seal der getrocknete Platte mit Parafilm und Lagerung bei 4 ° C für bis zu 2 Jahre später Neuprogrammierung Effizienz bewerten.