Репортер BW системы для изучения взаимодействия рецептор лиганд

1. поколение плазмида, который выражает химерных построить Примечание: Цель заключается в создании плазмида, который выражает внеклеточного домена рецептора интерес, сливается в трансмембранного и внутриклеточных домены мыши CD3ζ цепи (рис. 2A). Извлечение последовательности внеклеточного домена рецептора интерес, включая сигнал пептид. Получение материала ДНК, который, как ожидается, выразить этот рецептор (например, cDNA или плазмиду). Получение материала ДНК, который выражает трансмембранного и внутриклеточных домены мыши CD3ζ цепи (например., cDNA или плазмиду). Дизайн последовательность синтез белка на основе общей структуры, показано на рисунке 2А. Убедитесь, что вся последовательность находится в пределах той же раме кодон чтения. Эта последовательность используется для разработки соответствующей грунтовки и проверки конечного продукта. Дизайн два ПЦР-реакции для того чтобы усилить каждый из фрагментов синтез белков отдельно (Рисунок 2B, 2 C)10.Примечание: Особые условия для ПЦР-реакции (например., удлинение времени и отжига температура) зависят от характера праймеров, которые предназначены для конкретных рецепторов. Усилить внеклеточного сегмент рецептора. Дизайн грунт 5′, который включает в себя часть сигнала пептид рецептора, последовательность Козак консенсус и соответствующие ограничения сайта (рис. 2B). Дизайн грунт 3′, что Бока обе части синтез белка (рис. 2B). Например для первоначального дизайна этот грунт 3′ может включать 20 последних пар оснований внеклеточного сегмента рецептора и первые 9 низкопробных пар CD3ζ сегмента.Примечание: Существует не нужно добавить сайт ограничение в грунт 3′, так как этот грунт будет использоваться для создания плавленого последовательности и не используется для перевязки. Усиливает CD3ζ сегмента. Дизайн праймера 5′, который флангов обе части синтез белка (рис. 2 c). Например для первоначального дизайна грунтовка 5′ может включать последние 9 низкопробных пар внеклеточного сегмента рецептора и первые 20 пар оснований CD3ζ сегмента.Примечание: Существует не нужно добавить сайт ограничение в грунт 5′, поскольку этот грунт будет использоваться для создания плавленого последовательности и не используется для перевязки. Дизайн грунт 3′, которая включает в себя конец последовательности CD3ζ, а также соответствующее ограничение сайта (рис. 2 c). Исправьте последовательностей праймера в каждой из этих двух реакций, так что отжига температура похожа в каждой паре (Обратите внимание, что грунт, который включает в себя последовательности из двух частей синтез белка, только anneals с частью последовательности в каждой реакции). Выполнить дополнительные PCR, в котором используется смесь продуктов ПЦР первых двух реакций как шаблон ДНК с 5′ грунтовка внеклеточного рецептор сегмента (шаг 1.4.1.1) и 3′ CD3ζ сегмента (шаг 1.4.2.2) (Рисунок 2D)10 . Эта реакция должна генерировать окончательного плавленого последовательности. Приступить, как обычно для клонирования. Перевязать конечный продукт PCR с целью сократить вектор (вектор целевой обычно является pcDNA3, который выражает G418 и ампициллин сопротивление). Трансформировать перевязаны вектор в компетентных бактерий11. Оттепель 50 мкл компетентным бактерий на льду. Добавьте перевязаны вектор для бактерий и инкубировать на льду за 20 мин. Инкубируйте на 42 ° C для 45 s. Добавьте 200 мкл фунтов без антибиотиков. Инкубируйте 1 час при 37 ° C с непрерывной тряски. Семя на плите LB с соответствующие антибиотики (например, ампициллин решение с конечной концентрации 0,1 мг/мл). Собирать и расти несколько бактериальных колоний в 5 мл фунтов (в 15 мл пробирок). Следующий день, экстракт плазмид с набором мини-prep. Анализ гена вставка с энзимами ограничения. Последовательность соответствующих колоний и убедитесь, что последовательность и рамка чтения (как указано в шаге 1.3). Трансформировать проверенных плазмида в компетентных бактерий11. Размораживание 20 мкл компетентным бактерий на льду. 1 мкл плазмида бактерий и инкубировать на льду за 20 мин. Инкубируйте на 42 ° C для 45 s. Добавьте 200 мкл фунтов без антибиотиков. Инкубируйте 1 час при 37 ° C с непрерывной тряски. Семя на пластине роста бактерий с соответствующие антибиотики (например, ампициллин решение с конечной концентрации 0,1 мг/мл). Следующий день, растут бактериальные колонии в большом контейнере LB с 0,1 мг/мл ампициллин (~ 250 мл). Следующий день, выполняют макси приготовительная согласно инструкции, представленной в комплект.Примечание: Для электропорации процедуры, большое количество плазмида требуется, как описано ниже. 2. transfection плазмида, выражающий химерных белка в BW клетки Примечание: Различные методы могут также использоваться для transfection (например., лентивирусные инфекции). До электропорация выполняют этанола осадков ДНК, как описано ниже. Следующие шаги требуют стерильных условий. За день до, подготовить BW5147 (клетки «BW») для электропорации. Пластина 10 пластины (10 см) с 10 мл 100 000 BW5147 клеток/мл (т.е. в общей сложности 10 х 106 клеток) с RPMI, дополненная плода теленка 10% сыворотки (FCS), пируват натрия 1%, 1% L-глютамином, 1% несущественные аминокислот и 1% пенициллин стрептомицином («полного среднего»). Место 100 мкг плазмида pcDNA3, который выражает синтез белка в 1,5-2 мл трубку и добавить 3 M ацетат натрия при pH 5.3-5.5 к нему. Объем ацетат натрия должна соответствовать 0,1 (10%) объема 100 мкг плазмиды; Титруйте pH ацетат натрия с рН метр путем добавления NaOH или HCl. Добавьте 2.5 тома 100% этанола в смесь плазмида и ацетат натрия как описано в шаге 2.2 (2,5 x общий объем плазмиды и натрия ацетата). Инкубируйте на ночь при-20 ° C или за 2 ч при 70 ° C. 2.4. 24 ч после покрытием BW клетки собирают все клетки BW (~ 100 мл) в 2 50 мл трубки. Центрифуга клетки для 5 мин на 515 x g и удалить супернатант. Вновь приостановите гранулы из обеих трубок в 25 мл RPMI – в единый 50 мл трубки. К примеру, вновь приостановить Пелле одной трубки с 25 мл RPMI – и затем использовать эту жидкость вновь приостановить жидкости в других 50 мл трубки, таким образом, чтобы общая гранулы из клеток BW вновь приостановлено в 25 мл среды в однотрубных.Примечание: Средство должно быть без дополнений, так как сыворотки может мешать электропорации. Центрифуга клетки снова за 5 мин на 515 x g. Вновь приостановить гранулы в 1 мл RPMI и передавать содержимое до 0,4 см кювета на льду. Центрифуга плазмиды, которые прошли этанола осадков (шаг 2.3) за 30 мин при 16000 x g и 4 ° C. После промойте 1 мл 70% этанола и центрифуги для другого 20 минут, 16000 x g и 4 ° C (смыть соль). Удалите все этанола и пусть гранулы сухого слегка (т.е., в открытой трубой в культуре ткани капот). Вновь приостановить лепешка с 100 мкл RPMI-ранее подогретой до 60 ° C. Добавить вновь приостановлено плазмида (шаг 2.8) клетки в кювет и инкубировать в течение 5 минут на льду. Electroporate клетки на 0,23 кв, 250 дипломирования. Это должно занять ~ 4 мс. Electroporated клетки перехода к 50 мл трубки, добавить 50 мл полного среднего и центрифуги для 5 мин в 515 x g. Отменить супернатант и вновь приостановить клетки с 50 мл полной среды. Пластина electroporated клеток в культуре 24-ну блюда (1 мл на хорошо, в общей сложности ~ 50 скважин) и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2 в течение 48 часов. Выберите transfected клеток с помощью антибиотиков. После 48 h добавить 1 мл полного среднего, дополнена 10 мг/мл G418 для каждой скважины (на данном этапе конечный объем в каждом хорошо 2 мл и конечная концентрация G418 в каждом хорошо 5 мг/мл).Примечание: Если плазмида содержит различные антибиотикорезистентности, определите антибиотик концентрации, необходимые для убить untransfected BW клетки до этого шага. Каждые 48 ч, тщательно отбросить 1 мл верхняя объема каждой скважины без перемешивания среды в скважине (BW клетки, как правило, быть в нижней части скважины). Добавление полного среднего, дополнена 5 мг/мл G418 для каждой скважины, так что окончательный объем в каждой скважине снова 2 мл. Изучение культуры пластин для роста клеток на всех скважинах регулярно.Примечание: Изменения в цвет средне-желтый может помочь определить рост клеток; Однако, в начале носителя будет желтый из-за G418 сам. Выявление положительных скважин (скважины с ростом клеток). Эти колодцы являются G418 устойчивостью и поэтому, как ожидается, выразить синтез белка. Этот процесс обычно занимает ~ 3 недели. 3. Проверка выражения Transfected рецепторами в клетках в положительных скважин. Пятно transfected клеток BW с специфическим антителом против рецептора, который был transfected. Сравните уровень экспрессии рецептора подачей cytometry выражение управления (клетки untransfected BW). После проверки одного или нескольких скважин немедленно использовать клетки в экспериментальных целях, растут в культуре или заморозить для будущих приложений. Проверьте выражение transfected рецептора перед выполнением новый эксперимент. После нескольких недель роста, клетки с G418 с выражением стабильной рецепторов, G418 может быть опущен из питательной среды. 4. инкубации клеток Transfected BW с целями Примечание: При использовании transfected клеток BW для в первый раз, желательно проверить их на цели, которые выражают известные лигандов рецепторов интерес или плита прыгните антител, конкретно направленных против рецептора интерес (сшивки эксперименты; Смотрите ниже, в разделе 4.2.1.3). Предпочтительно разбить ячейки BW 24 ч до эксперимента (например, путем добавления 10 мл полного среднего до 2 мл клеток в культуре в новой пластинкой культуры 10 см). Инкубируйте transfected клеток BW с их целями. Выполните эксперимент одновременно управления BW клетки, которые выражают пустой вектор (или родительский BW клетки). 96f пластины являются предпочтительными (но может также использоваться 96U пластины). Выполнение эксперимента в трех экземплярах. Приостановите все клетки в средне-полной. Подготовка целей. Тип целевого объекта изменяется в зависимости от цели и может быть клетки, клетки, которые были предварительно инкубировали с антителами, или только антитела. Эта система также используется с бактериями как цели5. Если целевые показатели делящиеся клетки (то есть, клеточных линий), облучить их в 6000 rad до assay. Место 50 000 клеток-мишеней в одном хорошо 96 пластины (в объеме 100 мкл). Для экспериментов с антител и BW клетки, которые выражают человеческого FcγRs, инкубации клеток-мишеней с антитело на льду в 96 хорошо плиты (например, 50 мкл клеток-мишеней и 50 мкл антител; могут быть проверены различные антитела доз). При использовании антител только как цели (сшивки экспериментов), они должны быть пластины привязкой. Для этой цели сначала инкубации антитела в полной среды в 96F пластина для 1-2 ч при 37 ° C и 5% CO2 (типичная начальная доза-0,5 мкг специфического антитела в 50 мкл). Вымойте тарелку, чтобы удалить несвязанные антитела.Примечание: В этом случае плиты 96F позволит Связывание антитела к пластине, которая после добавления transfected клеток BW приведет к активации рецептора transfected. Добавьте BW (эффекторные клетки). Место 50000 BW клетки в один хорошо 96 пластины (в объеме 100 мкл). Полный объем в каждой скважине до 200 мкл при необходимости. Инкубируйте пластин при 37 ° C и 5% CO2 в течение 48 часов (этот период времени может быть откалиброван). После 48 ч, заморозить пластины при-20 ° C и оттепели до ELISA, или использовать немедленно для ИФА-диагностики (см. Далее). 5. ELISA Герб ELISA пластины с антитело против мыши Ил-2 (анти-mIL-2). 0,05 мкг mIL-2 место в объеме 50 мкл ПБС в колодец. Инкубируйте пластину покрытием ELISA с антителом mIL-2 на 4 ° C на ночь или на 37 ° C в течение 2 ч.Примечание: Для выполнения ELISA сразу после инкубации шаг, пластину ELISA должны быть покрыты 24 h до конца периода инкубации клеток BW. Отменить жидкости в пластину ELISA и добавить блокировки решение (200 мкл в колодец), который состоит из ПБС и 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА). Инкубируйте пластину ELISA втечение 2 ч при комнатной температуре. Вымойте пластину ELISA три раза с 0,05% раствора PBS анимации (т.е. 0,5 мл Tween-20 в 1 литре ПБС). Возьмите 96 пластина, которая имеет BW клетки, которые инкубировали с их целями (4.3). Если плита был заморожен, полностью разморозить его (например., короткий инкубационный при 37 ° C). Центрифуга 96 пластина (5 мин, 515 x g) и тщательно передавать предварительно покрытых и заблокированных ELISA пластины 100 мкл супернатант в каждой скважине.Примечание: Супернатант должны быть собраны из сторон каждой скважины, чтобы избежать принятия клетки. При желании, добавьте один из пустых строк с покрытием плиты ELISA для создания стандартной кривой mIL-2 рекомбинантных mIL-2 с определенной концентрации. Например, начать с мил-2 концентрация 2500 пг/мл и затем уменьшить на 50% в каждом последующем хорошо; не добавляйте mIL-2 к последнему хорошо. Инкубируйте ELISA пластины на 4 ° C на ночь или при 37 ° C на 2 ч. Вымойте пластину ELISA четыре раза с PBS анимации. Добавьте биотина анти мыши IL-2 пластину ELISA. Использовать в концентрации 1 мкг антител в 1 мл раствора 1 x PBS с 1% BSA и разделить на 100 мкл в колодец. Инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч. Вымойте тарелку ELISA шесть раз с PBS анимации. Добавьте HRP конъюгированных стрептавидина. В 1 мл раствора PBSX1 с 1% BSA использовать концентрацию 1 мкл стрептавидина и разделите его на 100 мкл в колодец. Инкубации при комнатной температуре за 30 мин. Вымойте тарелку ELISA шесть раз с PBS анимации. 100 мкл на хорошо ТМБ раствора субстрата. Завершите этот этап быстро свести к минимуму различия между скважинами из-за времени запаздывания при добавлении ТМБ. Читайте пластину ELISA с ELISA пластины чтения на 650 Нм (чтение может быть повторяться, если сигнал слабый).