Um sistema BW repórter para estudar interações ligante-Receptor

1. a geração de um plasmídeo que expressa a construir quimérico Nota: O objectivo é gerar um plasmídeo que exprime o domínio extracelular do receptor de interesse fundido aos domínios transmembrana e intracelular do mouse CD3ζ cadeia (Figura 2A). Recupere a sequência do domínio extracelular do receptor de interesse, incluindo o peptídeo sinal. Obter material de DNA que é esperado para expressar este receptor (por exemplo, cDNA ou um plasmídeo). Obter material de DNA que expressa o transmembrana e os domínios intracelulares do mouse CD3ζ cadeia (EG., cDNA ou um plasmídeo). Desenha a sequência da proteína de fusão com base na estrutura geral, mostrada na Figura 2A. Certifique-se de que a sequência inteira é dentro do mesmo quadro de leitura de códon. Esta sequência é usada para projetar primers apropriados e verifique se o produto final. Desenha duas reações de PCR para amplificar cada um dos fragmentos das proteínas de fusão separadamente (Figura 2B, 2C)10.Nota: As condições específicas para as reações de PCR (ex., tempo de alongamento e a temperatura do recozimento) dependem da natureza dos primers, que são projetados para um receptor específico. Amplifica o segmento extracelular do receptor. Desenha uma cartilha 5′ que inclui parte do peptídeo sinal do receptor, uma sequência de consenso Kozak e um sítio de restrição apropriada (Figura 2B). Desenha uma cartilha 3′ que flancos de ambas as partes da proteína de fusão (Figura 2B). Por exemplo, o desenho inicial esta cartilha 3′ pode incluir os últimos 20 pares de bases do segmento extracelular do receptor e os primeiros 9 pares de bases do segmento de CD3ζ.Nota: Não há nenhuma necessidade de adicionar um site de restrição para o 3′ primer, desde que esta cartilha será usada para gerar a sequência fundida e não é utilizada para a ligadura. Amplifica o segmento CD3ζ. Desenha um primer 5′ que flancos de ambas as partes da proteína de fusão (Figura 2). Por exemplo, o desenho inicial 5′ primer pode incluir os última 9 pares de bases do segmento extracelular do receptor e os primeiros 20 pares de bases do segmento CD3ζ.Nota: Não há nenhuma necessidade de adicionar um sítio de restrição para o 5′ primer desde esta cartilha será usada para gerar a sequência fundida e não é utilizada para a ligadura. Desenha uma cartilha 3′ que inclui o fim da sequência de CD3ζ, bem como um sítio de restrição apropriada (Figura 2). Corrigi as sequências de primer em cada uma destas duas reações para que a temperatura do recozimento é semelhante em cada par (note que o primer, que inclui sequências de duas partes da proteína de fusão, apenas anneals com parte da sequência em cada reação). Realizar um PCR adicional em que uma mistura dos produtos das duas primeiras reações do PCR é usada como o modelo de DNA com o primer 5′ do segmento extracelular do receptor (etapa 1.4.1.1) e a 3′ do segmento CD3ζ (etapa 1.4.2.2) (Figura 2D),10 . Esta reação deve gerar a sequência final do fundido. Proceda como de costume para clonagem. Ligar o produto final do PCR para o destino cortou vector (vetor alvo é geralmente pcDNA3 que expressa a resistência G418 e ampicilina). Transforme o vetor ligado em bactérias competentes11. Descongele 50 µ l de bactérias competentes no gelo. Adicione o vetor ligado à bactéria e incubar no gelo por 20 min. Incubar a 42 ° C por 45 s. Adicione 200 µ l de LB sem antibióticos. Incube durante 1 h a 37 ° C, com agitação contínua. Sementes em um prato LB com os antibióticos apropriados (por exemplo, ampicilina solução com uma concentração final de 0,1 mg/mL). Coletar e crescer várias colónias bacterianas em 5 mL de LB (em tubos de 15 mL). No dia seguinte, extrair plasmídeos com um mini kit de preparação. Analise a inserção de gene com enzimas de restrição. Sequenciar as colônias relevantes e verifique se a sequência e o quadro de leitura (conforme indicado na etapa 1.3). Transforme o plasmídeo verificado em bactérias competentes11. Descongele a 20 µ l das bactérias competentes no gelo. Adicionar 1 µ l do plasmídeo para as bactérias e incubar no gelo por 20 min. Incubar a 42 ° C por 45 s. Adicione 200 µ l de LB sem antibióticos. Incube durante 1 h a 37 ° C, com agitação contínua. Sementes em uma placa de crescimento bacteriano com os antibióticos apropriados (por exemplo, ampicilina solução com uma concentração final de 0,1 mg/mL). No dia seguinte, cresce uma colônia bacteriana em um grande recipiente LB com ampicilina 0,1 mg/mL (~ 250 mL). No dia seguinte, realize prep maxi de acordo com as instruções específicas fornecidas pelo kit.Nota: Para o procedimento de eletroporação, uma grande quantidade de plasmídeo é exigida, conforme detalhado abaixo. 2. a transfeccao do plasmídeo que expressa a proteína quimérico em células de BW Nota: Diferentes métodos também podem ser empregados para transfeccao (EG., por infecção lentivirus). Antes o electroporation, execute a precipitação do álcool etílico do DNA conforme descrito abaixo. As próximas etapas exigem condições estéreis. No dia anterior, prepare as BW5147 células (“BW”) para eletroporação. 10 placas (de 10 cm) com 10 mL de 100.000 BW5147 células/mL (ou seja, um total de 10 x 106 células) da placa com RPMI suplementado com soro fetal bezerro de 10% (FCS), piruvato de sódio 1%, 1% L-glutamina, 1% não aminoácidos essenciais e 1% penicilina-estreptomicina (“meio completo”). Coloque 100 µ g do plasmídeo pcDNA3 que expressa a proteína de fusão em um tubo de 1,5-2 mL e adicionar o acetato de sódio 3M pH de 5,3-5,5 a ele. O volume do acetato de sódio deve corresponder a 0,1 (10%) do volume da 100 µ g plasmídeo; titular o pH do acetato de sódio com um medidor de pH pela adição de NaOH ou HCl. Adicione 2,5 volumes de etanol 100% a mistura do plasmídeo e o acetato de sódio, conforme descrito no passo 2.2 (2.5 x volume total de plasmídeo e sódio acetato). Incubar durante uma noite a-20 ° C ou por 2 h a 70 ° C. 2.4. 24h após tem sido banhadas às células de BW, coletar todas as BW células (~ 100 mL) em tubos de 2 50 mL. Centrifugar as células durante 5 min à 515 x g e descartar o sobrenadante. Ressuspender o pellet de ambos os tubos em 25 mL de RPMI – em um tubo único de 50 mL. Por exemplo, Ressuspender o sedimento de um tubo com 25 mL de RPMI – e em seguida, use este líquido para re-suspender o fluido no tubo de 50 mL, para que o sedimento total das células BW é re-suspenso em 25 mL do meio em um único tubo.Nota: O meio deve ser sem adições, desde que o soro pode interferir com a eletroporação. Centrifugar as células novamente por 5 min em 515 x g. Ressuspender o pellet em 1 mL de RPMI e transferir o conteúdo para uma cubeta de 0,4 cm no gelo. Centrifugue o plasmídeo que foi submetido a precipitação do álcool etílico (passo 2.3) por 30 min em 16.000 x g e 4 ° C. Lave uma vez com 1 mL de etanol a 70% e centrifugar por mais 20 min em 16.000 x g e 4 ° C (para lavar o sal). Remover todo o etanol e deixar o sedimento secar ligeiramente (ou seja, em um tubo aberto do capuz de cultura de tecidos). Ressuspender o sedimento com 100 µ l de RPMI-previamente aquecida a 60 ° C. Adicionar o plasmídeo re-suspenso (2.8 passo) para as células a cubeta e incubar durante 5 min no gelo. Electroporate as células em 0.23 kV, 250 capacitação. Isso deve levar ~ 4 ms. Transfira as células electroporated para um tubo de 50 mL, adicionar 50 mL de meio completo e centrifugar por 5 min em 515 x g. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células com 50 mL de meio completo. As células electroporated em pratos de cultura bem-24 (1 mL por bem, para um total de ~ 50 poços) da placa e incubar a 37 ° C e 5% CO2 por 48 h. Selecione as células transfectadas com antibióticos. Depois de 48 h adicionar 1 mL de meio completo, suplementado com 10 mg/mL G418 a cada poço (nesta fase o volume final em cada bem é 2 mL e a concentração final de G418 em cada bem é de 5 mg/mL).Nota: Se o plasmídeo contém uma resistência aos antibióticos diferente, determine a concentração do antibiótico, necessária para matar as células de BW untransfected antes desta etapa. Cada 48h, cuidadosamente descartar 1 mL do volume superior de cada poço sem agitando o meio no poço (as células de BW tendem a estar no fundo do poço). Adicione completo suplementado com 5 mg/mL G418 para cada poço, para que o volume final em cada poço é novamente 2 mL. As placas de cultura para o crescimento de células em todos os poços Examine regularmente.Nota: Uma mudança na cor do meio para amarelo pode ajudar a identificar o crescimento de células; no entanto, no início o médio será amarelo devido a G418 em si. Identifica positivos poços (poços com o crescimento de células). Esses poços são G418 resistente e, portanto, são esperados para expressar a proteína de fusão. Este processo normalmente leva ~ 3 semanas. 3. verificação da expressão do Receptor Transfectada nas células dos poços positivos. Mancha de células transfectadas com um anticorpo específico contra o receptor que foi transfectado BW. Compare o nível de expressão do receptor por citometria de fluxo para a expressão das controle células (untransfected BW). Após a verificação de um ou mais poços, usar células imediatamente para fins experimentais, crescer em cultura ou congelar para aplicações futuras. Verifique se a expressão do receptor transfectada antes de executar uma nova experiência. Após algumas semanas de crescimento, as células com G418 com uma expressão de receptores estável, G418 pode ser omitida do meio de cultura. 4. incubação das células transfectadas BW com alvos Nota: Quando utilizar células transfectadas BW pela primeira vez, é preferível para testá-los em alvos que expressam um conhecido ligante do receptor de interesse ou na placa-limite anticorpos especificamente dirigidos contra o receptor de interesse (cross-linking experiências; Veja abaixo, secção 4.2.1.3). De preferência, dividi as células BW 24 h antes do experimento (por exemplo, adicionando 10 mL de meio completo a 2 mL de células em cultura em uma nova placa de cultura de 10 cm). Incube as celulas transfectadas de BW com seus alvos. Realizar o experimento simultaneamente nas células de controle BW que expressam um vetor vazio (ou células de BW parentais). 96F placas são preferíveis (mas 96U placas também podem ser usadas). Realizar o experimento em triplicado. Suspenda todas as células no meio de completa. Prepare os alvos. O tipo de alvo varia em função do objectivo e pode ser células, as células que têm sido pré-incubadas com anticorpos, ou anticorpos sozinhos. Este sistema também tem sido usado com bactérias como metas5. Se as metas estão dividindo pilhas (isto é, linhas de células), eles irradiam em 6.000 rad antes do ensaio. Lugar de 50.000 das células alvo em um único poço de uma placa de 96 (em um volume de 100 µ l). Para experimentos com anticorpos e células de BW que expressam a FcγRs humana, incubar as células alvo com um anticorpo no gelo em um prato bem 96 (por exemplo, 50 µ l das células alvo e 50 µ l do anticorpo; doses diferentes de anticorpo podem ser testados). Se usando anticorpos sozinhos como alvos (cross-linking experimentos), devem estar ligados a placa. Para esta finalidade, primeiro incube os anticorpos em um meio completo em uma placa de 96F para 1-2 h a 37 ° C e 5% CO2 (uma típica dose inicial é de 0.5 μg de um anticorpo específico em 50 μL). Lave a placa para remover anticorpos não acoplados.Nota: neste caso, uma placa 96F permitirá a ligação do anticorpo para a placa, que após a adição das células transfectadas BW levará a ativação do receptor transfectada. Adicione as células de BW (células efetoras). Coloque 50.000 células BW em um único poço de uma placa de 96 (em um volume de 100 µ l). Complete o volume em cada poço a 200 µ l, se necessário. Incube as placas a 37 ° C e 5% CO2 por 48 h (este período pode ser calibrado). Após 48 h, congelar as placas a-20 ° C e degelo antes da ELISA, ou usá-lo imediatamente para ELISA (ver próximos passos). 5. ELISA Revesti uma placa de ELISA com um anticorpo de IL-2 anti-rato (anti-mIL-2). Coloque 0,05 µ g de mIL-2 em um volume de 50 µ l de PBS 1x por bem. Incube a placa de ELISA revestida com o anticorpo anti-mIL-2 a 4 ° C durante a noite ou a 37 ° C por 2 h.Nota: Para executar ELISA diretamente após a etapa de incubação, a ELISA deve ser revestida 24 h antes do final do período de incubação das células BW. Descartar o líquido na placa de ELISA e adicionar uma solução de bloqueio (200 µ l por alvéolo) que é composta de 1X PBS e 1% albumina de soro bovino (BSA). Incube a placa de ELISA para 2 h à temperatura ambiente. Lave a placa de ELISA três vezes com solução de PBS Tween 0,05% (ou seja, 0,5 mL de Tween-20 em 1 litro de 1X PBS). Pegue a placa de 96 que tem as células de BW que foram incubadas com seus alvos (4.3). Se a placa foi congelada, derretê-lo completamente (EG., por curto de incubação a 37 ° C). Centrifugue a placa 96 (5 min, 515 x g) e com cuidado transferir 100 µ l do sobrenadante em cada poço para a placa de ELISA pré-pintados e bloqueada.Nota: O sobrenadante deve ser coletado dos lados de cada poço para evitar tomar as células. Se desejar, adicione mIL-2 recombinante com concentrações definidas para uma das linhas vazias da placa de ELISA revestida para gerar uma curva padrão de mIL-2. Por exemplo, iniciar a partir de uma concentração de 2 mIL de 2.500 pg/mL e depois diminuir em 50% em cada poço subsequente; Não adicione mIL-2 para o último bem. Incube a placa de ELISA a 4 ° C durante a noite ou a 37 ° C por 2 h. Lave a placa de ELISA quatro vezes com PBS Tween. Adicione biotina anti-rato IL-2 para a placa de ELISA. Usar uma concentração de 1 µ g de anticorpo em 1 mL de 1X PBS com 1% de BSA e divida em 100 µ l por bem. Incube a temperatura ambiente durante 1 h. Lave a placa de ELISA seis vezes com PBS Tween. Adicione streptavidin HRP conjugado. Usar uma concentração de 1 µ l streptavidin em 1 mL de PBSX1 com 1% de BSA e dividi-lo em 100 µ l por bem. Incube a temperatura ambiente por 30 min. Lave a placa de ELISA seis vezes com PBS Tween. Adicione 100 µ l por poço da solução de substrato TMB. Complete esta fase rapidamente para minimizar as diferenças entre os poços devido desfasamentos temporais ao adicionar o TMB. Leia a placa ELISA com um leitor ELISA a 650 nm (a leitura pode ser repetido se o sinal é fraco).