両生類における卵巣モニタリングと制御のための生殖技術
1Reproductive Sciences,San Diego Zoo Institute for Conservation Research, 2Recovery Ecology,San Diego Zoo Institute for Conservation Research, 3Menagerie du Jardin des Plantes,Museum National d’Histoire Naturelle, 4Cincinnati Zoo & Botanical Garden,Center for Conservation and Research of Endangered Wildlife
Summary
両生類生物学の研究は、多くの分類学的グループの生物を駆動する生殖、生理学的、発生学的および発達過程に関する貴重な情報を提供します。ここでは、両生類の卵巣制御とモニタリングを研究するために使用できるさまざまな方法論に関する包括的なガイドを紹介します。
Abstract
両生類における卵巣の制御とモニタリングには多面的なアプローチが必要です。生殖行動を正常に誘導し、生理学的または分子研究のためのガメや胚の獲得に成功できるいくつかのアプリケーションがあります。両生類は脊椎動物の研究の4分の1に貢献しており、この文脈で関心を持っているのは、生殖過程と胚学的発達に関する科学界の知識への貢献である。しかし、この知識のほとんどは、少数の種に由来しています。近年、世界中の両生類の減少は、保護主義者による介入を増やす必要がある。絶滅のリスクに対応して出現し続ける捕虜の回復と保証のコロニーは、人間のケアの下で保持される両生類の生存と繁殖に既存の研究と臨床応用を非常に貴重にします。捕虜集団の成功は、その健康と繁殖と、その種の最も多様な遺伝的表現を進める生存可能な子孫を開発する能力に基づいている。研究者や獣医師にとって、卵巣の発達と健康を監視し、制御する能力は、したがって、不可欠です。この記事の焦点は、両生類の卵巣機能を監視し、必要に応じて制御するために使用できるさまざまな補助生殖技術を強調することです。理想的には、あらゆる生殖と健康の問題は、適切な捕虜の畜産を通じて減らされるべきであるが、他の動物と同様に、健康と生殖病理学の問題は避けられない。非侵襲的な技術は、身体状態指数と超音波の計算のための行動評価、目視検査および触診および形態測定を含む。侵襲的な技術は、ホルモン注射、血液採取、および手術を含む。卵巣制御は、必要なアプリケーションと関心のある種に応じて、さまざまな方法で行使することができます。
Introduction
両生類は、長い間、研究分野の広い範囲によって重要な生物学的および医学的モデルとして認識されています。キセノプス・レービスやX.トロピカル、ヒョウカエル(リソベート(旧ラナ)ピピエンス)、アキソロトル(アンビストマ・メキシカム)などの特定の種を研究することによって得られたデータが適用されている。人間を含む他の脊椎動物種の数。これらの両生類や他の両生類の研究から生殖を助けた獣医、畜生技術は、捕虜の稀な集団の成功したケア、維持および持続可能性の開発を担当する人々に援助を提供する1,2,3,4.
リスクの高い両生類種1、2で多くの絶滅の潮流を逆転させるため、自然保護に基づくアプローチの同時使用に関心が高まっている。この記事では、アヌランおよびカウデートのモデル種における両生類卵巣機能を監視および制御するために現在利用可能な方法論を提供する。さらに、卵の保持の一般的な生殖病理学に対処するための既存の技術が提示される。
多くの分類群と同様に、両生類卵巣制御は、環境と生理学の間で緊密に同期された一連の相互作用を伴う。温度および光周期(近接シグナルとして知られている)は、それらが急速に遺伝的、ホルモンおよび概日プロセス(究極の信号)3、4に変換される目および脳によって解読される。この記事で説明する卵巣機能を監視および制御する方法には、侵襲的および非侵襲的な技術が含まれる。機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)の研究と教育の要件は、物理的な痛みや精神的苦痛を最小限に抑え、痛みを和らげる薬物を必要としないものとして非侵襲的な技術を定義します5.ここで、非侵襲的な技術は、目視検査および触診、行動観察、形態測定および超音波を含む。それどころか、採血、ホルモン投与、手術(卵摘出と卵子の除去)の技術は、痛みや不快感を引き起こし、麻酔または手続き後の薬物療法を必要とするので侵襲的に分類される。
非侵襲的な卵巣モニタリング技術は、ほとんどの捕虜両生類の日常ケアルーチンに容易に組み込むことができます。種に応じて、卵巣の重力は、多くの場合、簡単な目視検査(ガラスカエル)によって決定することができます。他のケースでは、触診は、女性が重力であるかどうかを示す場合があります。体重、スナートウロスタイル長(SUL)、スナアウトベント長(SVL)、標準質量指数(SMI)などの様々な身体状態指数(BCI)は、卵4、6、7の有無を予測するために利用可能です。 8,9.しかし、ほとんどの人が年齢、体の形または組成物(例えば、保持された水対卵巣質量または脂肪)6を考慮しないので、結果の解釈に注意する必要があります。決定的な生殖診断は、卵子の発達と卵巣サイクル4、7のステージングに関して得られたより深い知識を持つ超音波を介して達成することができます。超音波はまた、生殖病理学および関連する生理学的条件4、8を確認し、監視する手段を提供する。
健康状態に関する情報を提供することに加えて、血液サンプリングは生殖ホルモンを測定するために使用することができます。ホルモンプロファイリングが最終的な目標である場合, 全身ステロイド データを混乱させる可能性のあるストレス関連の影響を避けるために重要です。.潜在的に強力なモニタリングツールである一方で、両生類種における外因性ホルモン投与に対する生来の内分泌的応答を実証する研究はまだない。血液は、いくつかのサイトから安全に取ることができます。カエルでは、これは腹部静脈、言語叢、大腿静脈および心臓9、10を含む。Caudatesでは、血液は腹部尾静脈から採取される。侵襲性の程度、必要な拘束量、麻酔薬の必要性、標的とされる器官の繊細さ、および動物の大きさは、両生類患者の収集技術を選択する際に考慮すべき要因である。本稿では、Forzanら9.で最初に述べたカエルの顔上顎または筋肉皮静脈からの血液採取の技術を紹介する。
卵巣制御は種に特異的であり、ホルモンプロトコルをテストし、最適化する必要があります。季節性および関連する循環ホルモンmilieuを除いて、卵巣コントロールはまた、年齢、監禁に費やされた時間、および繰り返されるホルモン投与への暴露に密接に関連し、文献11にはほとんど情報がない,12歳,13.生殖行動、ゲームの産生、成熟および卵巣を引き起こすホルモン療法の実施は、捕虜に関連する一般的な生殖問題を解決するための広く報告されたアプローチとなっている4, 8,14,15,16.脊椎動物の生殖を制御するメカニズムは高度に保存されているため、多くのホルモン、神経ペプチド、市販の薬物が他の分類群で治療的に使用され、多くの中で確実に使用できる。両生類種(表1)。ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)およびヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)(またはそのバリエーション、すなわち、PMSGおよびeCG)17、18、個別または組み合わせのいずれかで、両生類捕虜に広く使用されているを含む繁殖プログラム: 南ロッキー山脈ボリアル (アナキシルスボレアスボレアス)4,19,20;ヒキガエル、ダスキーゴーファーカエル、ラナ・セボサ(ランゴルンら、未発表)7;湾岸ウォータードッグ、ネクトゥルスベエリ20;ワイオミングヒキガエル、アナキシラスバクテリ18;ブルフロッグ、ラナ・カテスビアナ21;アメリカのヒキガエル、アナキシルスアメリカ人22;草のカエル、リンパ疱タスマニエンシス23;コキ、エリューセロダクチルスコキ24;ゼノプス、ゼノプス・ラエビス25;ガンターのヒキガエル、プセオフリングエンテリ26;北ヒョウカエル、リソバテスピピエンス;アルゼンチンの角カエル、セラトフリは華やか;クランウェルの角のカエル、C.クランウェル;アメリカの地上カエル、オドントフリヌスアメリカ人27;と火災サラマンダー(サラマンドラ)228.ステロイドホルモンは、プロゲステロン(P4)のような、あまり一般的に報告されていないが、アヌランの一部の種で排卵および卵巣を引き出す上で良好な有効性を実証している16、18、29。プロスタグランジン(特にプロスタグランジン2-α(PGF2α)は、コルチコステロイド30、31、32、34と共に排卵に関与し、その間に高レベルに達する排卵相31.
インビトロ研究では、PGF2αは排卵31の強力な誘導者であり、生体内ではラナ・マスコサ4、30、32における保持卵の卵巣を誘導することができる。下垂体抽出物はまた、排卵15、16、34の効果的な誘導者である。しかし、バイオセキュリティを取り巻く懸念と病気感染の可能性は、多くの場合、このアプローチを検討する際に捕獲繁殖コロニーの抑止力である35.
この記事の最後のセクションでは、外科的処置を詳述し、卵巣研究を拡大したり、生殖病理学の解決を支援するための代替アプローチを提供します。卵管切除術は、生理的研究のための卵母細胞を得るために両生類で最も一般的に行われます。しかし、別のオプションが失敗した場合に保持卵の救済策を提供することもできます。この手順は侵襲的であるが、卵塊を露出させるために完全な麻酔および切開を必要とするが、安楽死を必要としない。さらに、部分的な耳切り後、動物は完全に回復し、生殖後に活動的な手術後8、36を続けることができる。
以下に説明するプロトコルは、アヌランおよびカウデートにおける卵巣制御およびモニタリングの侵襲的および非侵襲的な方法を概説する。アヌランの技術を説明するために選ばれた特定の種には、R.粘膜およびX.laevisが含まれる。ネクトゥルス・マキュロスス、N.ベエリ、N.アラバメンシス、およびA.メキシコは、同様にカウデートの技術を記述するために使用される種を含む。
Protocol
サラマンダーの手順はシンシナティ動物園&植物園(CZBG)機関ケアと使用委員会(IACUC)プロトコル11-106、13-110、14-133、および15-138によって承認されました。すべてのカエルとヒキガエルの手順は、サンディエゴ動物園グローバル(SDZG)、機関ケアおよび使用委員会(IACUC)プロトコルによって承認されました:15-001、16-005および18-003。 動物の世話と治療は、国立自然史博物館(パリ)の倫理委員会(国立国立自然博物館、博物館、国立自然博物館、メナジェリー・デ・ジャルダン・デ・プラント(MNHN))によって承認されました。(コミッション・ド・ジェニー・ジェネティック、ディレクション・デ・サービス・ヴェテリネーレス、欧州連合指令2010/63/EU、合意決定No.C75-05-01-2 実験やその他の科学的目的に使用される脊椎動物のための欧州条約。この研究で使用されるすべてのプロトコルは、参照番号68-037の下で承認されました。 1. 非侵襲的卵巣モニタリング技術 目視検査と触診 以下に説明する 3 つの方法のいずれかで女性のアヌランを保持します。 カエルやヒキガエルの足をリングと小指で固定し、人差し指と中指でカエルの体の背側(腹部)を支え、親指で腹部側を支える(図1A)。 カエルやヒキガエルを腹部に親指で持ち、残りの指で動物の背中を固定します。非支配的な手を使用して動物の腹部を触診し、皮下凹凸があるかどうかを感じる(図1B)。 カエルやヒキガエルの腹部を手のひらに置き、人差し指の上に前腕をドレープし、親指を背中に置きます。 Caudatesは本質的に完全に水生性であるため、以下に説明する2つの方法のいずれかで目視検査を行う。 タンク水を含む別の4Lコンテナに動物を移動します。容器(蓋固定)を持ち上げ、下側に懐中電灯を照らして、卵の有無を可視化します。 MS222(0.5 g/L;トリカインメタンスルホン酸塩、0.5 M NaHCO3で緩衝)誘導後、動物を背中に回転させ、腹部を調べる。 形態測定評価 アヌラン注:麻酔は必要ありません。 キャリパーを用いて、口の先端から、体の中心に沿って尾部に沿って動物を測定し、SULおよびSVLを得た(図2A、B)。 デジタル精度スケールでプラスチック容器を引き出します。動物をタールコンテナに入れ、体重を量ります(図2C)。 ブルフロッグのような大型動物の場合、またはフィールドで重みを得る場合は、吊り下げスケール(図2D)を使用します。 多くのアヌラン種と同様に、R.ムスコサ成人女性を男性と区別するサイズが大きく、手にヌプティカル(親指)パッドが不足している(図3)。 次の式で全体的な健康状態の基本的な評価として、体の状態を計算します。フルトンのインデックス: K = 質量 ÷ 長さ3注: フルトンのインデックスは、質量と長さに関連する体積の寸法バランスを使用し、3 は質量と長さをアイソメ的に関連するスケーリング指数です。 カウデート 非麻酔動物を内部に入れる前に、空の袋で風通しの良いスケール。余分な水(図2D)を導入しないように注意し、動物が抑制されているストレス応答として粘液を分泌するように迅速に行動します。 再密封可能なビニール袋の底部のまっすぐな位置または拡大されたキャリパーを収容できる別のプラスチック容器に個人を固定することによって大人の措置を得る。 キャリパーで体長を測ります(図2E)。 成長を監視するために、スナウトの先端から尾の先端(SVL)までケーデートを測定します。 行動観察 リアルタイムで動物を物理的に観察したり、ビデオカメラを使用して動作を記録します。 動物の観察を記録して行動を分類し、エトグラムを構築する(図4)。 生殖行動の分類注:図4は、アヌランで観察される1種類の生殖行動を例示する。 超音波注:選択の超音波トランスデューサは、この例では、7.5 mHzの線形または多重(10-6 mHz)マイクロ凸、ネクトゥルスと10 MHzプローブと水溶性、R.muscosaのための無塩ゲルのために推奨されます。サラマンダーに超音波を行うことは麻酔を必要とするかもしれません(指示についてはセクション1.5を参照してください)。 アヌラン 2人を用いてR.ムスコサで超音波を行う(図5A)。 最初の人:支配的な手で動物を保持し、動物の腹部に水溶性、塩分フリーゲルを適用します。 第二者(超音波検査官):優勢な手で10MHzプローブを取り、プローブとゲルの間に良好な接触を確認するために腹部に適用します。 腕ピットのすぐ下から動物の腹部中線の中心に向かって内側にスライドし、卵巣全体を視覚化します。 超音波検査者:フレームを凍結し、超音波上の所望の画像をキャプチャするために非支配的な手を使用してください。 卵巣4属のために確立されたグレーディングシステムによって卵巣周期の段階を分類する(表2、図5B-F)。 手順の最後に動物から任意のゲルをすすいでください。 カウデート 非麻酔性ネクトゥルスをタンク水の2Lで満たされた4L長方形容器に移す。 部屋のライトをオフにしたり、動物の頭の上に片手をカップで囲むことで、動物の動きを最小限に抑えます。 トランスデューサを本体の壁から 1 ~ 2 cm の距離に配置します。 前肢に腹部中線レベルで心臓を見つけ、トランスデューサを遠位に動かして卵巣組織7を調べる。 属4(図6A、B、C)のために確立されたグレーディングシステムに従って女性を分類する。 動物の体がトランスデューサに対して角度がある場合に画像をキャプチャすることにより、中期から後期の段階で卵の正確な測定を得る(すなわち、線形ではなく、わずかなアーク。図6B)。それ以外の場合、卵胞が重なり合う場合、個々の卵の大きさを区別することが困難になります。 麻酔誘導と回復 アヌラン MS222(0.5 g/L;トリカインメタンスルホン酸緩衝(0.5M NaHCO3)は、前述の通りである。 動物が麻酔になった程度の主要な指標として右反射を使用してください。反射の完全な損失は、深い麻酔の状態を示しています。 右反射が失われたら、水浴ベースの麻酔(MS-222)から動物を取り除きます。 動物を濡れたタオル(麻酔フリーの脱塩素水で)に置きます。 外科手術全体の間に動物を湿らせておくことを確認してください。 赤いゴム製のカテーテル、手錠のない管または古典的な袖口の内気管の管が袖口を膨らませることなく小さい両生類を挿管する。 0.5-1%のイソファランで酸素の低い流れ(0.5-0.75 L/min)を提供します。 手順の後にイソファランを停止しますが、酸素の流れを1分間保ちます。 動物を吐き出し、麻酔フリーの脱塩水で2分間十分にすすいでください。 動物を塩素水の浅い量にするか、濡れたタオルの上に置きます。 後肢をそっと引っ張って伸ばすことで、動物の回復を評価します。四肢の応答収縮は、離脱反射を示す。 角呼吸(喉の動き)や右反射などの回復の他の指標を監視します。 すべての反射神経が戻った時に回復した両生類を考え、心臓と呼吸数が麻酔前の値に戻ったとします。 カウデート MS222(トリカインメタンスルホン酸塩の0.5g/L、0.5M NaHCO 3、(MS222)を4L長方形タンクに入れてネクツースとアンビストマを麻酔する。 エアストーン(1インチ)とエアポンプをタンクに入れ、一定の流れに入れて十分な酸素化を提供します。 四肢機能と右反射が失われた場合は、水浴ベースの麻酔(MS-222)から動物を取り除き、(麻酔フリーの脱塩素水で)タオルを濡らします。 タンクウォーターのスクイーズボトルで肌とエラの水分を維持します。 動物を回復するには、慎重に空気石でタンク水の2 Lで満たされた4 Lプラスチック容器に腹部側を置きます。注:回復は、その尾を移動し、前方に推進し、最終的に手足の機能的な動きに続く、ギル点滅から始まります。 元のハウジングタンクに動物を戻し、次の24時間にわたって密接に監視します。注:両生類のための麻酔の他の方法が存在し、これらはライトとウィテカー8に記載されています。 2. 侵襲的卵巣モニターおよび制御技術 注: この手順は Forzán et al.10から調整されています。 カエルを支配的な手で持ち、カエルの顔の静脈穿刺側を無菌の拭き取りまたはガーゼで乾かします。 顔を乾かして、血液が皮膚全体に分散しすぎないようにします。 針(26 G 1/2″および27 G 1/2″)を挿入し、ベベルを上向きにして、目の周りの上げられた皮膚と上顎の隆起が出会う皮膚を通して、三角形の点を形成する(黄色の輪郭)(図7A)近くの静脈フェイシャルにアクセスする静脈軌道後部。 右目の下と上顎の隆起の上に顔面静脈を穿刺し、目の中線から1〜2mmの間から始めます(図7A)。注: 小さいカエル(20g以下)の場合は、挿入ポイントを目の中線のすぐ下の位置に近づけます。 マイクロヘマトクリットチューブを下方に角度を付けて、重力がチューブに血流するのを助けます。血液は穿刺直後に流れるべきである(図7B、C)。 血流の最初の兆候で、穿刺部位にマイクロヘマトクリットチューブの先端を置き、血液の1-2完全なマイクロヘマトクリットチューブを収集し、チューブを収集するための適切な容器に配置する(図7B、C)。 血液が容易に流れない場合、または体積が非常に低い場合は、針の挿入をわずかにシフトするか、針を顔の反対側に挿入します。 少なくとも20sの穿刺部位にガーゼをしっかりと押すことによって出血を止める。 カエルを10分間水から出し、穿刺部位が再び開かないように確認します。 サンプリングされたカエルごとに新しい針と新しいマイクロヘマトクリットチューブを使用します。 3. ホルモン誘導 ホルモン製剤 最大の効果を確保するために使用する直前にホルモン注射を準備します。. 表 1に示す選択範囲からホルモンを選択します。 体重16のμLまたはmL/gを用いて注入されるホルモンの濃度を決定する。 水、リン酸緩衝生理食生(PBS)、生理食べ物両生類リンガー溶液(SARS)または生理食生の1つでホルモンを希釈する。 体重80~110g(個人観察)16のカエルの体重30~70g、300μLの注入量を超えないようにしてください。 10〜100gの範囲の任意の動物のホルモン投与中に動物を正しく保持するために、セクション1.1に記載されている保持のための適切な方法のいずれかを使用します。 アヌラン 体重計算(g/体重)あたりのグラムを使用して、個人ごとに必要な濃度を計算します。 投与の直前に、選択の無菌希釈剤で再構成する。 注射器に気泡が残っていないようにしてから注射器に入れないようにしてください。 非支配的な手で動物をしっかりと保持し、支配的な手で注射を管理します。 ホルモン仕様に従って注射を投与します。.肛他の最も一般的な注射は、皮下、下皮内または筋肉内(図8)である。 腹部の下部または背中の脚の近くの背部側の下部にIP注射を投与する(図9)。 好ましくは後肢に筋肉内注射を投与する。 カウデート (ネクチュラス) 上記の体重当たりのグラム法に従って無菌水中で選択したホルモンを再構成する。 ネクトゥルスの場合は、1.7-2.3 μg GnRH/g体重の用量を使用してください。 麻酔室からネクトゥルスを取り出し、外科ドレープで覆われた45°の表面に置きます。 頭を下に向けて動物を配置します。 腹部の後腹部(後脚の角)に15~20°の角度で接近します。注射器に空気を入らないのは注意してください。 インスリン注射器と27-30G針を使用して(IP)を注入する。 インスリン注射器と27-30 G針を使用してホルモンを注入します。 4. 手術 一般的な外科的準備と手順 無菌手順を維持するには、明確な滅菌プラスチックドレープを使用して外科的部位を隔離する。周囲の肌をしっとりと保つことで蒸発を減らします。 滅菌水で動物の皮膚に接触する材料を湿らせます。番号15または数11メスブレードで皮膚切開を行います。注:冷たい鋼鉄、放射線外科またはダイオードレーザーの組合せ。軽度の出血性処置における無毛症は、電気焼灼またはダイオードレーザーによって達成され得る。 綿の先端の槍またはアプリケーターを使用して、失血を追跡する小さな血管に局所的な圧力を適用できるようにします。 綿の先端の槍またはアプリケーターを使用して、標準的なガーゼの正方形の代わりに小さな限られたスペースを管理します。 1kg未満の動物の体重に手術を行う場合は、細かい小さな先端を備えた眼科用器具のようなマイクロ機器を使用してください。 切開の異なるサイズに合わせて、プラスチック、自己保持リトラクタ(例えば、ローンスターリトラクタ)を使用してください。 コエロミック切開を引き込むには、まぶたリトラクタを使用します。 小さい患者の外科を行うために必要な場合は拡大器械使用を使用する。注:両生類の外科的処置には鎮鎮症が必要です。手術中に適切な鎮鎮温を投与しない場合は、正常な機能の復帰が遅れていることが関連している。また、鎮薬は麻酔薬の効果を増強する (表 3)34. アヌラン X. laevisがステップ 1.5.1 で説明したように麻酔を受けたら、動物を後膜の回復に置きます (図 10A,C)。 手術35の少なくとも10分間、手術部位上の10〜15sまたは0.75%クロルヘキシジン溶液の部位に希釈ポビドンヨウ素溶液(1/10)で湿った滅菌ガーゼを拭くことによって、外科的フィールドを無菌的に調製する。 15番または11番メスを使用してきれいな切開を残して、1つの大胆なストロークで中間コエロム(肩とクローカの間)に3mmのパラメディア皮膚切開を行います。注:皮膚切開にもダイオードレーザーを使用することがあります。 腹部膜を上げ、作り、切開し、15番または11番のメスを使用して慎重に解剖する。(図10B、D)。 まぶたリトラクタ(または適切な装置)でコエロミクス切開を引き込みます。 卵塊の一部を血管を帯びずに切除する。 完全な腫瘍切り取りについては、電気焼灼またはレーザーダイオードによって周囲の血管を焼き上ける(図11)。 モノフィラメント縫合糸を使用して、中断された、絶え間ない縫合パターンでセリオトミー切開を閉じる。 カウデート 一度A。メキシコは麻酔され、左骨盤の四肢を尾部ベースに対して単に置き、右横の再債務に置く。 10-15 s.のサイトに希釈ポビドンヨウ素溶液(1:10)で湿った滅菌ガーゼを置くことによって、無菌の外科場を無菌的に準備し、0.75%のクロルヘキシジン溶液に浸した滅菌ガーゼを使用し、少なくとも10分間外科部位に置きます。手術前 (図 12A)36,37 . 肩と後肢の間に線を引き、体を3つの等しい部分に分割します(図12B)。 2 番目と 3 番目の部分の間に切開部位を作成します。 基礎となる筋肉をつかみ、コエロミック内臓から離れて上昇します。 小さな血栓をコエロム筋を通して、コエロミック空洞に優しく押し込む。 まぶたリトラクタ(または適切な材料)でコエロミクス切開を引き込みます(図12C)。 完全な耳切り切り術のために、電気焼灼またはレーザーダイオードによって周囲の血管を焼く(図12D)。 モノフィラメント縫合糸を使用して、中断された、絶え間ない縫合パターンでセリオトミー切開を閉じる。
Representative Results
形態測定と生殖 両生類における女性の生殖状態の可視化は、種によって異なる。最も効果的な方法は、超音波です。しかし、一部の種は、皮膚の透明度の変化を示す場合があります(図13A,B,C)。目視検査は、N.アラバメンシスとN.黄斑症で観察される皮膚が半半透明である場合、重力と非重力の女性の違いを明確に示すことができる(図13A,B);。またはガラスカエルによって示されるように半透明(図13C)。N.ベエリの腹部の暗い斑点皮膚の着色は、この評価が行われることを禁止します。R.muscosaでは、皮膚は半透明ではありませんが、皮膚が剥離しているため、最近卵巣に溶解したメスと比較して顕著な違いが検出され、動物は薄く見えます(黄色い線)グラビッド(青い線)の女性(図13D)。経験を持つハンドラーは、大きな女性と重力の1の違いに慣れることができますが、重力段階の確認は超音波を必要とします。両生類の体重指数は、多くの数式を使用して計算できますが、生殖のための予測ツールとしての応用は議論の余地があります。R.ムスコサの場合、フルトンの指数、健康および生殖状態との相関関係は不明のままである。 生殖行動と超音波 我々の結果は、卵巣の予測のためにR.ムスコサにおける生殖行動を特徴付ける方法を示す(図4)。数時間から数週間に及ぶいくつかの段階には、男性が積極的に女性を追いかける求愛(図4A)、オスが女性の背中にしっかりと留め、十分な数と呼ばれる(図4B)。一度十分に切断されると、ペアは1-5週間十分に残ることができ、ペアは、十分に加えて、他の動作を表示します。Amplexusは、男性が柔らかいポンピング方法で女性を圧迫することを含む非常に活発な行動です(図4C);。女性が動き回り、断続的にハンドスタンドの動作を表示し始める(図4D,E);そして、卵の時間に近い、女性は、手立てで、男性が彼女の腹部を激しくポンプしながら、彼女が卵を貼ることができる表面に傾きます(この場合、女性が下から下方に彼女の腹部をこするのを観察することも可能です)彼女の腕はクローカに向かってピット。これは卵管に卵を押し下げる機械的な方法かもしれません)(図4F、G)。 本研究は、超音波が女性R.ムスコサおよびネクトゥルスの生殖状態を確認するための情報を提供する方法を示す。R.ムスコサ(図5C、D、E、F)で4段階の開発段階が表され、同様にネクチュラス4(図6A、B、C)で特徴付けられています。また、残留卵は卵の保持につながる追放に失敗する可能性があります(図5G、図15A、B)。ステージ1は、卵胞が視覚化しにくい卵巣の直後の卵巣を示す(図5C)。ステージ2は、卵巣全体に分散したエコードット(白い斑点)の出現によって表される(図5D)。ステージ2および3は、大きな中~大きな卵胞を表す暗い中心を持つ、より大きな丸みを帯びたエコー元ドットで表されます(図5E,F)。2013年から2017年まで、捕虜の女性ネクトゥルスは毎月超音波検査で検査を受けた。各試験の間、個人は属のために確立された生殖基準に従って成績のスコアを割り当てられました(表2)。毎年新しい卵を発達する雌の割合は平均88.2±3.01%であった(表5)。卵の発生が高い一方で、卵巣は確保されなかった(図16)。卵化を受けた雌の大半は卵の完全な補体を堆積させ、一部の個体は発達した卵のほんの一部しか堆積しなかった。体腔内の体液ゲインと一致する保持卵を持つそれらのR.ムスコサおよびネクチュラスメスは、破裂した血管と一致する皮膚上の赤い斑点と外側に視覚的に拡大した(図14A,B)) .体液貯留の程度は、超音波(図15B)を介してさらに評価することができる。いずれの種でも、保持卵は切断症を受けたり、よりエコー原性の外観を受けたりした(図14C,D,図15A)。 ホルモン投与 注射のタイプの深さに応じて、針の角度と深さが異なります。ほとんどの注射では、R.muscosaなどの種で作業する場合、針の深さは1-2ミリメートル以上である必要はありませんが、浸透の角度が異なります。プロスタグランジン注射は、90°で角度付きの内筋(im)針挿入を必要とし、R.ムスコサの後脚に、内腔内(ip)注射は、筋肉内注射と同様の深さで、の領域で投与された。45°でのコエロミックキャビティ(図10)。アンフィプレックスの投与は、コントロール(P=0.547)と比較してホルモン処理された雌によって沈着する卵の数を増やすことに有意な効果を持たず(P= 0.673)、またはオタマジャクシに生き残った胚の数に違いはなかった(P=0.629) (表4)一般的に、女性のオビポジスの割合は、2011年の80%から2014年には28%に減少した。2015年の女性のオビポシティングの数は、2013年(P= 0.0002)、2013年(P=0.0001)、2014年(P=0.0026)よりも有意に高かったが、2011年(P= 0.0885)ではなく、この種の女性が毎年の繁殖を必要としないという考えを再確認した。ネメント。卵の保持の徴候を持つR.ムスコサ女性の場合、PGF2αの筋肉内注射は、退化卵の追放を誘発する60%の成功率を持っていた。しかし、注射された5匹の雌のうちの1匹では、PGF2αは完全な追放を引き起こすのに十分ではなく、一部の卵は次の繁殖期まで雌の中に残った。17人のネクトゥルス女性がLHRH/(GnRH)を受け取り、13人がコントロールとして機能する滅菌水の偽注入を受けた(表5)。合計で、7人の雌ネクトゥルス(n=4アラバメンシス、n=2ベエリ、n=1黄斑)は、GnRH処理(n=6)および対照(n=5)個体の両方に起因する11個のフルクラッチに続いた。3匹の雌(n=2ベエリ、n=1黄斑)は5つの部分クラッチをオビポサイト化した(図13)。この現象は、3人の対照女性が同様に部分クラッチを堆積させたため、外因性ホルモン治療と関連しているようには見えなかった(表5)。オビポジションは、5年間にわたり37日間(3/31-5/7)の期間にわたって発生しました(表5)。LHRH/GnRH処理済みの卵子化率に差はなかった(P = 0.194)(41± 13.08%、範囲17-67%)および制御 (66.75 ± 11.79%、範囲 50-100%)女性。LHRH/GnRH処理されたメスは、注射後の平均7.44±1.41(範囲3-13)の卵を堆積させた。種の完全に水生性の性質と麻酔なしで手動で拘束することができないことを考えると、IPホルモン注射を行う前に適切なレベルの鎮圧を確保する必要がありました(麻酔の指示についてはセクション3.2を参照)。 採血、麻酔、手術 この記事の血液採取技術はForzan et al. 201310から採取され、侵襲性とストレスを最小限に抑えてR.ムスコサから血液を採取する効果的な方法を証明した。マイクロヘマトクリットチューブを用い、全血70μL当たり約35~45μlの血漿または血清を採取することができる(図7)。R.muscosaの最大回収量は、カエル10g当たり1個の完全なマイクロヘマトクリットチューブで、カエル1匹につき4個のチューブを40g以上でした。これは、100g当たり0.7mLの保存的な回収量であり、100g当たり1.0mLの最大推奨値の70%(アレンダーとフライ、2008年から適応)13であった。 両生類の麻酔や手術はめったに報告されませんが、用量と有効性は種固有の方法で異なることを注意することが重要です。例えばボンビナオリエンタリスでは、MS222は高用量(1g/L)でも非常に低い効果を有し、ボリアルヒキガエルではアナキシラスボレアス、1g/Lは速く(分の問題)と長続きする(3+h)(カラタユド、個人的な観察)。R.ムスコサでは、麻酔はA.ボレアスのために報告された用量を必要とし、同様の効果と回復時間を有する。麻酔前の断食両生類は、全身麻酔下でも喉頭がしっかりと閉じたままで、通常は必要ありません。しかし、必要と認められる場合、特に麻酔手術がセロミック手術を含む場合、動物は麻酔前に24時間断食することができる。 手術中、右反射は動物が麻酔化されたことを主な指標としています。右反射は、動物が背中に置かれた後に直立した位置に戻ることができる能力と容易さの程度です。反射の喪失は麻酔の軽い段階を示唆する。外科面は、それをまっすぐにするために四肢を軽く引っ張ることを含む撤退反射の損失によって示され、動物はもはやそれを引き込むことのできない7.生殖手術には圧倒的な障害はなく、両生類の患者は主に高い脊椎動物よりも多くの失血を許容して治癒する。手術は、最初から最後まで約15分間続く、迅速に進行する必要があります。ステップは、最初の切開のための<1分、セリオトミーおよびリトラクタ挿入の場合は<2分、卵巣あたりの単離のための<2分、血管縫合またはテーター化および皮膚縫合<4分の間に<1分の時間を計る必要があります。MS222プロトコルによる手術後の総回復時間は約45分ですが、これは種固有の場合があります。A. ボアスボレアスとR.ムスコサの回復時間は、1 – 2時間まで長くなる可能性があります。手術を行う場合は、肺、消化管、または膀胱の穿刺を避け、大腸腺、リンパ心臓、血管、特に中腹部静脈に損傷を与えないように注意する必要があります。季節に応じて、大きな脂肪体の存在は、他の臓器の視覚化を困難にすることができます。目に見えて目が覚めると、後肢の緩やかな伸びに対する抵抗や、眼の周りの領域が刺激されたときに点滅する(個人的な観察)など、四肢刺激に対する動物の反応は、離脱反応として分類される。右反射は、撤退反射と神経の動きを含む他の回復指標と一緒に、回復の重要な指標です。 管理 共通名 種 ホルモン 手順 プライミングコンパウンド 報告されたプライミング用量 プライミング用量の数 タイミング (排卵用量の前の時間) 最終的な排卵/卵巣のために投与される化合物 用量 参照 プエルトリコのヒキガエル ペルトフリンキツネザル GnRHとhCG Ip Hcg 1.5 IU/g 2 hCG – 48 GnRH;hCG;GnRHa + hCG 0.2 μg;4 IU;0.5 μg + 4 IU カラタユドら未発表 山の黄色い足のカエル ラナ・ムスコサ アンフィプレックス, ルト Ip GnRHa (des-Gly10, D-Ala6, プロ-NHEt9-GnRH) 0.4 μg/g 1 24歳 GnRH + メット 1 x 0.4 μg/g + 10 μg/g カラタユドら, 2018 PGF2α Im PGF2α 5 ng/g 1 48歳 PGF2α 5 ng/g 南ロッキーマウンテンボリアルヒキガエル アナキシラス・ボレアス hCG, GnRH Ip Hcg 3.7 IU/g 2 96、24 hCG + GnRHa 13.5 IU/g + 0.4 μg/g カラタユドら, 2015 ノーザンクリケットカエル アクリス・クレピタン アンフィプレックス 水に加え (10 mL) なし なし 0 Na GnRH + メット 0.17 μg + 0.42 μg / μl スナイダーら, 2012 北ヒョウカエル リトバテス・ピピエンス アンフィプレックス Ip なし なし 0 24歳 GnRH + メット 1 x 0.4 μg/g + 10 μg/g トルドーら, 2010 アルゼンチンの角カエル セラトフィルオルナタ アンフィプレックス Ip なし なし 0 24歳 GnRH + メット 1 x 0.4 μg/g + 10 μg/g クランウェルの角のカエル セラトフリース・クランウェリ アンフィプレックス Ip なし なし 0 24歳 GnRH + メット 1 x 0.4 μg/g + 10 μg/g アメリカの地上カエル オドントフリヌス・アメリカンヌス アンフィプレックス Ip なし なし 0 24歳 GnRH + メット 1 x 0.4 μg/g + 10 μg/g ダスキーゴーファーカエル ラナ・セヴォーサ hCG, GnRH Ip Hcg 3.7 IU/g 2 96、24 GnRH + hCG 1 x 0.4 μg/g + 13.5 IU/g グラハムら, 2018 コキ エリューセロダクチルス・コキ 魚、鳥類、哺乳類、GnRH(D-アラ、デグリー、エスLHRH)、hCG Sc mLHRH; アラー;fLHRH;GnRHa;Hcg なし 0 Na mLHRH; アラー;fLHRH;GnRHa;Hcg 7μg、 33μg;28μg;7μg、 20μg;5, 10, 15, 20 μg;165 IU マイケルら 2004 ガンターのヒキガエル シュードフリン・グエンテリ Gnrh グンラ 0.4 μg/g 1 26歳 GnRHa の有無にかかわらず 0.4 μg/g 新羅 2010 コロボリーカエル シュードフリン・コロボリー ルクレリン Sc ルクレリン 1 μg 1 26歳 ルクレリン 5 μg バーン&新羅、2010 北コロボリーカエル シュードフリン・ペンギレイ GnRHa GnRH (D-アラ、 デスグリー、 eth LHRH) Ta なし なし 0 Na グンラ 0.5 -2.0 μg/g 新羅ら, 2017 湾岸ウォータードッグ ネクトゥルス・ベエリ [des-Gly10, D-Ala6]-LhRH-RHエチルアミド酢酸塩水和物 Ip なし なし 0 Na LHRH 100 μg / 500 μL Stoops et al., 2014 南ベルカエル /うなり草カエル リトリア・ラニフォルム des-Gly10, D- アラ6-[LHRH] Sc なし なし 0 Na des-Gly10, D- アラ6-[LHRH] 50 μg Mann et al., 2010 ファウラーのヒキガエル アナキシルス・ファウレリ GnRH、hCG、P4 Ip Hcg 3.7 IU/g ブラウンら,2006 アクソロトル (メキシコのサラマンダー) アンビストマ・メキシナム 卵胞刺激ホルモン Im なし なし 0 Na Fsh 400IU トロティエとアームストロング(1974年) アフリカの爪のカエル ゼノプス・ラエビス hCG および P4 水を加えた。Ip PMSG、hCG マルセック 、 2016 タイガーサラマンダー アンビストマ・ティグリナム hCG, LH ワイオミングヒキガエル アナクシラス・バクスターリ hCG, GnRHa, P4 Ip hCG + GnRHa 100 IU + 0.8 μg 1 72歳 hCG + GnRHa 100 IU + 0.8 μg ブラウンら,2006 北ヒョウカエル リトバテス・ピピエンス 下垂体エキス(PE)、P4、テストステロン(T)、コルチコステロン[C]、アンフィプレックス、ドンペリドン(D) SC、IP なし なし 0 Na PE, PE+T, PE+P4, PE+C;アンフィプレックス、 GnRH + D 1 mL で約 100 IU (LHRH) ;PE+0.002μg/μL;PE+0.01mg/50mL;PE+0.1mg/50mL;0.4 μg/g + 10 μg/g; 0.4 μg/g + D ライト、1961年。フォート、2000年;トルドーら, 2013 地上カエル リンパ時代のタスメニエンシス 下垂体抽出物, hCG, GnRHa, PZ Ip グンラ 0.9-1.2μg/g + PZ 10 μg/g 1 20歳 PE;PE + hCG;GnRH + PZ PE ボル;PE vol + 100 IU hCG;GnRH (0.9-1.2μg/g) + PZ (10μg/g) クルーローら, 2018 緑と黄金の鐘のカエル リトアイア・アウレア Gnrh Ip グンラ 10 μg 1 72歳 GnRHa + hCG 20 μg + 300 IU クルーローら, 2018 グレートバールカエル ミクソフェイズ・ファシオラトゥス hCG および PMSG Sc PMSG、hCG 50 IU & 25 IU;1×100 IU 2;2 PMSG-144 & 96; hCG-24 Hcg 100IU クルーローら, 2012 より多くのホルモンプロトコルと種については、ライトとウィテカーを参照してください, 2001 表1:両生類種および外因性ホルモンの一部は、文献で報告されているようにそれらに試験した。ヒト絨毛性ゴナドトロピン (hCG);ゴナドトロピン放出ホルモン (GnRH);放電ホルモン放出ホルモン (LHRH);文字m、aおよびfは「哺乳類」、’鳥類’および’魚’を表します。妊娠中のマレ血清ゴナドトロピン (PMSG);プロゲステロン (P4);卵胞刺激ホルモン FSH);下垂体抽出物 (PE);テストステロン (T);コルチコステロン(C)。記載されているドーパミンアンタゴニストが含まれます: ドンペリドン (D);ピモジド (P);メトクロプラミド(MET)。アンフィプレックスは、GnRHおよびメトクロプラミド27から成る化合物に与えられる名前である。ルクリンは、有効成分が酢酸レプ酸レポロリンである市販のGnRHアゴニストです。4,7,17歳,18歳,19歳,20歳,26歳,27歳,38歳,39歳,40歳,41歳,42歳,43歳,44歳,45歳 グレード 生殖状態 説明 0 非グラビッド 卵は見えない 1 早期グラビッド 目に見える卵(1〜2ミリメートルの大きさ)は、卵に関連付けられている明確なエコーラインはありません。 2 ミッドグラビッド 卵2〜3ミリメートルの大きさ、各卵に関連付けられている明確なエコーライン。 3 後期グラビッド 卵4〜5mmの大きさ、エコー原性線はまだ目に見える、卵の無響外観の顕著な増加。 4 保持卵 内部卵構造に存在するエコー元物質の様々な程度は、非晶質形状を取る。いくつかは非常にエコーゲンになり、体腔内の体液貯留に関連付けられて. 表2:捕虜女性ネクトゥルスの生殖状態をスコアリングするために使用されるグレーディングシステムとラナ・ムスコサ超音波検査によって。 薬物 投与量とルート コメント – リファレンス ブプレノルフィン 50 mg/Kg (イントラスロミック) 東部赤色斑ニュート(ノトフタルムスビリセンス)での実験的研究。鎮鎮薬は手術前に行われるべきである。(コーラー、2009) ブトルファノール 1 – 10 mg/Kg (IM またはイントラスロミック) 様々な特定の責任があります。1 mg/kg から始することをお勧めします。 ブトルファノール 0.5 mg/L (お風呂) 東部赤色斑ニュート(ノトフタルムスビリセンス)での実験的研究。(コーラー、2009) フェンタニル 1 mg/kg 鎮食器> 4時間, ナルトレキソンによって拮抗 (スティーブンス, 1997) メロキシカム 0.1 ~ 0.2 mg/kg (IM) (2011年ミンター) 表3:両生類の鎮鎮薬のためのプロトコル。 ラナ・ムスコサ 年 2014年 2015年 いいえ ♀ 18歳 18歳 卵の発達 61パーセント 94パーセント 制御♀ 4 6 アンフィプレックス♀ 4 7 平均日ポストアンフィプレックスからオビポジットへ 10.5年 10.9年 オビポジションレート(アンフィプレックス) 22.20パーセント 33.33パーセント オビポジションレート(コントロール) 22.20パーセント 38.88パーセント 表4:コントロール捕虜雌と比較した両比レックス処理間の生殖パラメータの比較ラナ・ムスコサ2014年と2015年に。 ネクトゥルスsp. 年 1 2 3 4 5 いいえ ♀ 6* 7 7* 7* 7* 卵の発達 83パーセント 100パーセント 86パーセント 86パーセント 86パーセント LHRH ♀ 3 5 3 6 0 制御♀ 2 2 3 0 6 ポストLHRHからオビポシットへ 5 7 5.5 (範囲 3 ~ 8) 13歳 N/a オビポジションレート(LHRH) 60パーセント 20パーセント 67パーセント 17パーセント N/a オビポジションレート(コントロール) 50パーセント 50パーセント 100パーセント N/a 67パーセント * n=1 ♀卵の発達なし 表5:LHRH間の生殖パラメータの比較(GnRH)-治療と制御(滅菌水)キャプティブ女性ネクトゥルス5年間の3種から(2012-2017) 図1:カエルを保持する3つの方法。(A) 手順 1.(B) 手順 2.(C) 手順 3.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図 2: 形態学的評価。(A, B)SVL/SUL (C, D)体重,R.ムスコサとD.ネクトゥルスで(E) キャリパーによるサイズ測定。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図3:性的な変形は、女性と比較して成人R.ムスコサ男性の鼻親指パッドによって区別される。(A)女性(B)男性.下のパネルは、男性対女性の長さを示しています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図4:R.ムスコサにおける卵巣に至る生殖行動の特徴付け(A) 求人。(B) アンプレクサス。(C) オスは、十分な数の中で女性を絞る。(D, E)手立ちの女性。(F, G)腹部の収縮と卵巣。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図5:発達段階4に従って生殖状態を持つR.ムスコサA-Bに対して行われた超音波。(A,B)ラナ・ムスコサで超音波検査を行う。(C) グレード 0.(D) グレード1。(E) グレード2。(F) グレード3。(G) グレード4(排卵・保存卵)こちらをクリックして、この図の大きなバージョンをご覧ください。 図6:ネクトゥルスの超音波画像。(A) グレード1。(B) グレード2。(C)グレード3の卵。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図7:R.ムスコサにおける血液採取。(A) 静脈軌道後部を、軌道の真ん中にある顎線のすぐ上の顔面静脈に穿刺して採取する。(B, C)血液は皮膚の表面に放出され、ヘパリン化された毛細管で採取される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図8:両生類における注射方法。注射のタイプの深さに応じて、針の角度と深さが異なります。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図9:R.ムスコサにおけるホルモン注射。ラナ・ムスコサ女性におけるホルモン治療による卵巣の誘導は、両膜内に注入した。卵巣は、この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図10:手術前の準備。(A)希釈ポビドネヨウ素溶液(1/10)を用いて手術領域の無菌調製物(1/10)、トラキセファルス樹脂。(B)キセノプス・レービスまたは(C)レーザー・ダイオード皮膚切開におけるきれいなメス切開、リトバテス・カテスベアヌス。(D) 中腹部静脈、トラキセファルス樹脂を損傷しないようにする。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図11:キセノプス・レービスにおける眼腫瘍(A) 大きな脂肪体を露出して動かして卵塊を明らかにする。(B) 血管をライゲーションすることなく卵塊の一部を切除する。(C) 完全な血管を完全に腫瘍腫取りのために、電気焼灼によって周囲の血管を焼く。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図12:A.メキシコにおける前外科的製剤および腫瘍手術(A)滅菌ガーゼに浸漬し、0.75%クロルヘキシジン溶液を手術部位に塗布(B)。肩と後肢の間の線は、動物を3つの等しい部分に分割し、青いスポットは切開部の部位をマークします。(C) まぶたリトラクタでコエロミクス切開を撤回する。(D) 完全な耳たぶ目の場合は、電気焼灼によって周囲の血管を焼き上ける。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図13:生殖段階の視覚的評価(A, B)半半透明の皮膚、ネクトゥルスを介した生殖段階の視覚評価。(C) 半透明の皮膚、ヒアリノバトラキウム(ガラスカエル)。(D) 前(右、青い線)と卵巣後(左 – 黄色の線)の前にR.ムスコサの視覚的評価。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図14:卵の保持。(A, B)卵保持の重症例を有するメスラナ・ムスコサ。(C)超音波は、古い退化、卵(上)と大きな卵(中央および下部パネル)排卵し、コエロムに閉じ込められている示しています。(D) 手動ストリッピングによって取り出された保持卵。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図15:(A)が外観(円)でエコー原性となり、体腔内の(B)体液貯留(矢印)に関連したネクチュラスにおける保持卵の超音波画像。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図16:完全または部分的なクラッチ(2013-2017)をオビポサイト化した捕虜女性ネクトゥルスの割合(2013-2017)は、オビポシットをしなかったものと比較した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
直接的な取り扱い、目視観察および形態測定は非侵襲的な技術を提供し、女性の生殖段階を決定するための最初の評価基準である。しかし、この研究は、重力卵巣が常に触診によって確実に識別されるとは限らないことを示している。種に応じて、重力卵巣は、動物の腹部側の半半透明の皮膚(図13A、B)を通して視覚的に検出されることがある(図13C)。卵巣を完了した女性は、重力女性と比較して外観に明らかな変化を示すことができます(例えば、皮膚のゆるみと体重の最大30%の損失、図13D)。繁殖中、雄と雌は排卵と排卵の近くに関する情報を提供する特定の行動を表示します。R.ムスコサの場合、女性が卵巣に近い兆候は、女性がハンドスタンドに入ることから始まる。
アヌランとカウデートへの超音波技術の適用は、卵の有無の診断を可能にし、卵子が発達した卵子の完全または部分的な放出に関連していたかどうか。したがって、この方法は、腹部皮膚の透明性、または表皮の一貫性によって変化する視覚化技術を介して重力/非重力状態を決定することに限定されることなく、生殖状態のより完全かつ正確な評価を提供します。異なる両生類種。超音波は、動物に対する比較的容易で、ほとんどストレスを伴い(図5および図13)、生殖周期を特徴付け、生殖状態4を決定するために使用することができる。種に精通することが重要です。しかし、この研究は、ネクトゥルスとR.ムスコサが生殖段階の同様の分類を可能にする生殖パターンにおいて共通の発達徴候を共有することを示した(図5)。この技術を通じて、卵の発達は捕虜ネクトゥルスとR.ムスコサで高く、これらの種は両方とも季節パターンに従っているという証拠があります。これらの現象の理由は不明であり、さらなる調査を必要としますが、超音波を使用せずに、卵子の保持や部分的な卵巣などの卵巣機能不全のいくつかの領域は検出されなかったでしょう。この技術への将来のアプリケーションは、任意の年に雌を選択する必要があるかどうか、および卵巣が完了しているかどうかを決定するために使用されます。
R.muscosaで提示されたような採血プロトコルは、効果的であり、動物に最小限の苦痛を引き起こすが、捕虜および野生の捕獲されたアヌラン(Calatayud、未発表)でホルモンプロファイルを研究するのに最適である。現在まで、捕虜R.ムスコサの年間ホルモンプロファイルに関する情報は存在しないため、ホルモンが健康と生殖にどのように影響しているかについての知識はありません。さらに、この種の雌が年間ブリーダーではないかもしれないという証拠で、ホルモンプロファイリングは卵巣周期を追跡するための別の方法になります。超音波と一緒に、ホルモン分析は、女性が卵巣の準備ができているかのより良い予測につながる可能性があります。さらに、過去1年間に、捕虜R.ムスコサ集団におけるインターセックスの2例が文書化されている。さらに、親指パッドの開発は、古い創設女性の一部に記載されています。この理由は現在調査中ですが、最初の結果は、テストステロンのレベルの変化に関連する可能性があることを示唆しています (Calatayud, 未発表).異なる年齢の女性の識別ホルモンサイクルは、女性が男性に関連する二次性的特徴を開発する理由と、これが高齢化人口で期待されるかどうかについて理解するのに役立ちます。
外因性ホルモン療法は、捕虜両生類で頻繁に遭遇する生殖機能障害を克服するために使用されています。しかし、本研究におけるR.ムスコサおよびネクトゥルス集団の両方について、ホルモン治療と対照雌の間の卵巣の有意な差は、それぞれ2年および5年の期間にわたって検出されなかった。これは、ホルモン投与プロトコル、用量、プライミングおよび使用されるホルモンの組み合わせが種に対して十分ではなかったことを示している可能性があります。個々の女性の生殖履歴の詳細な分析は、R.ムスコサが毎年の繁殖を経験しないかもしれないことを示唆しています, また、治療された女性で観察されるホルモン効果の欠如を説明することができます.一定の割合の女性が毎年一貫して繁殖をスキップしているので、種の自然史を理解することは、外因性ホルモンの必要性があるかどうか、そしてそれらが最も効果的である可能性があるかどうかを判断するのに役立ちます。この記事で概説する手順は、多くの種(表1)に適用することができ、5gから150gの範囲のアヌラン用です。より大きな動物は、異なる注射器と針ゲージを必要とする場合があります。注射の場所は、筋肉内、食皮内、皮下注射または皮内注射を必要とするいくつかのホルモンによって異なります(図7)。
卵胞目の目的のための手術は、胚学的研究のための卵母細胞を得るために様々な両生類種で使用される一般的な方法です。卵子保存術はまた、集団制御および卵の保持などの医学的問題のために示されるかもしれない。卵母細胞の採取が研究目的で行われる部分的な卵性腫瘍の場合、手術は動物が生殖されたままであることを確認しなければならない。PGF2αの投与は、女性R.ムスコサにおける卵の保持を解決する上でいくつかの約束を示している。いくつかの個体では、PGF2αは以前に保持された卵の完全な堆積を引き起こしたが、他の部分堆積のみがすべての卵を除去するために手動剥取を必要とする起こった。PGF2αは、R.ムスコサにおける卵保持手術の代替として役立つかもしれないが、他の両生類における同様の病理状態を改善する能力は、種特異的な検証を必要とする。アヌランまたはカウデート患者に外科的介入が義務付けられている場合、切開が行われる前に十分な麻酔の平面を確保する必要があります。この研究で概説されているように、各タキサに対する規範的な誘導および回復応答を評価し、監視するためには、直感的な観察スキルが必要です。特定の解剖学、適切な外科的アプローチ、無限り、穏やかな組織操作および適切な術後管理に精通したら、生殖手術は圧倒的な障害をもたらさない。
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ナタリー・カラタユドは、バーバラ・デュラント博士に超音波の訓練と援助を行い、SDZGの私の研究アソシエイトポジションに資金援助を授与してくれたエクスプラドラ・デ・イムブルズ(EISA)に感謝したいと思います。原稿に関するコメントと公式のレビュー担当者(彼らが誰であろうと)にカイリー・ケーン博士に感謝します。写真を提供するためのサンディエゴ動物園保全研究所の2018サマーフェローのジョナサン・デインのおかげで(図1A,B)。モニカ・ストゥープスは、動物園と水族館保護基金とディズニー・ワールドワイド・コンサベーション・ファンドに対し、捕虜のネクチュラス人口を確立するための財政支援を行うための感謝の意を表します。また、両生類の擁護者であるアイリス・デ・ラ・モットさんからの私的寄付も通じて支援を受けました。クリストファー・デチャント氏とマーク・キャンベル博士に感謝の気持ちを述べました。
Materials
| GE logiq Book XP and 8C-RS probe 4e10 MHz GE Medical Systems | GE medical systems | GE logiq Book XP | Ultrasound |
| Aloka 500 7.5mHz linear or IBEX multi-frequency (10-6mHz) micro-convex | GE medical systems | 8C-RS (10 MHz) | Ultrasound probe |
| BD disposable U-100 insulin syringe (28-29 G needle) | Mettler Electronics Corp CA | Sonigel | Ultrasound gel (water soluble, salt-free) |
| Hormone | |||
| Gonadotropin releasing hormone | BACHEM | 4012028 | synonym: [Des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9]-GnRH acetate abbreviation: GnRH |
| Lutenizing hormone releasing hormone | BACHEM, Sigma-Aldrich | 4033013; L1898 | synonym: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 acetate salt; [D-Ala6}-LHRH acetate salt hydrate abbreviation: LHRH |
| Human chorionic gonadotropin | BACHEM, Sigma-Aldrich | 4030270, 4018894; C1063, CG5, CG10 | synonym: Chorionic gonadotropin-β (109-145)(109-119); Choriogonin, HCG (2,500IU, 5,000IU, 10,000IU) abbreviation: hCG |
| Prostaglandin 2α | Sigma-Aldrich | P40424; | synonym: (5Z,9α,11α,13E,15S)-9,11,15-Trihydroxyprosta-5,13-dienoic acid tris salt, PGF2α−Tris; abbreviation: PGF2α |
| Follicle-stimulating hormone | Sigma-Aldrich | F4021, F8174 | synonym: porcine, sheep abbreviation: FSH |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | 46665; P7556 | synonym: Vetranal; P4 water soluble abbreviation: P4 |
| Pituitary extract | na | synonym: Check papers for amphibian species derivation abbreviation: PE |
|
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Prospec; Lee Biosolutions; Sigma-Aldrich | HOR-272; 493-10; 9002-70-4 | synonym: Pregnant Mare Serum Gonadotropin abbreviation: PMSG |
| Metaclopromide | Sigma-Aldrich | M0763 | synonym: 4-Amino-5-chloro-N-[2-(diethylamino)ethyl]-2-methoxybenzamide, Methoxychloroprocainamide abbreviation: MET |
| Lucrin | BACHEM; Sigma-Aldrich | 4033014; L0399 | synonym: Leuprorelin acetate abbreviation: Lucrin |
| Lutalyse | Pfizer | synonym: PGF2α – Dinoprost tromethamine abbreviation: Lut |
|
| Pimozide | Sigma-Aldrich | P1793 | synonym: 1-[1-[4,4-bis(4-Fluorophenyl)butyl]-4-piperidinyl]-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one abbreviation: PZ |
| Amphiplex | see above | synonym: Gonadotropin releasing hormone + metoclopramide abbreviation: GnRH + MET |
|
| Ovopel | Ovopel | na | synonym: GnRHa + dopamine receptor antagonist (administered 1 pellet/ kg) abbreviation: Ovo |
| Ovaprim | Pentair aquatic eco-systems | Ova10 | synonym: Salmon gonadotropin + domperidone abbreviation: Ova |
| Domperidone | Sigma-Aldrich | D122 | synonym: 4-(5-Chloro-2-oxo-1-benzimidazolinyl)-1-[3-(2-oxobenzimidazolinyl)propyl]piperidine abbreviation: DOM |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Calatayud, N. E., Chai, N., Gardner, N. R., Curtis, M. J., Stoops, M. A. Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians. J. Vis. Exp. (147), e58675, doi:10.3791/58675 (2019).