МикроРНК легких профилирования через эстральный цикл в подвергшихся воздействию озона мышей
Summary
Здесь мы описываем метод, чтобы оценить выражение легких адаптивной, прогнозируются регулировать воспалительные гены с помощью мыши воздействию озона или отфильтрованным воздухом на разных стадиях эстрального цикла.
Abstract
МикроРНК (miRNA) профилирование стал интерес для исследователей, работающих в различных областях исследований в биологии и медицины. Текущие исследования показывают, многообещающего будущего использования адаптивной диагностики и ухода за легочных заболеваний. Здесь мы определить протокол для Мирна, профилирование для измерения относительного изобилия группы интерферирующим предсказал регулировать воспалительные гены в легочной ткани от модели мыши воспаление озона индуцированной дыхательных путей. Потому что было показано, что циркулирующие уровни полового гормона может повлиять на регулирование легких врожденного иммунитета у самок, этот метод предназначен для описания воспалительных Мирна, профилирование протокол в самок мышей, принимая во внимание эстральный цикл стадии каждого животного во время воздействия озона. Мы также рассмотреть применимые биоинформатики подходы к Мирна обнаружения и целевых методов идентификации с помощью Лимма, R/Bioconductor программного обеспечения, и программное обеспечение функционального анализа для понимания биологических контекст и пути, связанные с Дифференциальный Мирна выражение.
Introduction
микроРНК (интерферирующим) являются короткие (19-25 нуклеотидов), естественным, некодирующих молекул РНК. Последовательности адаптивной эволюционных сохранение видов, предлагая важность интерферирующим в регулировании физиологические функции1. микроРНК выражение профилирование было доказано быть полезны для выявления адаптивной, которые имеют важное значение в регуляции различных процессов, в том числе иммунного ответа, дифференцировки клеток, процессов развития и апоптоз2. Совсем недавно адаптивной были признаны за их потенциального использования в терапии и диагностики заболеваний. Для исследователей, изучение механизмов регуляции генов измерения Мирна выражение может просветить модели уровне систем регулирования процессов, особенно когда Мирна информации объединяется с мРНК профилирования и другие геном масштаба данных3. С другой стороны адаптивной также было показано, быть более стабильным, чем mRNAs в широкий спектр типов образцов и также поддаются измерению с большей чувствительностью, чем белки4. Это привело к большой интерес в развитии интерферирующим качестве биомаркеров для различных молекулярных диагностических приложений, включая легочных заболеваний.
В легких адаптивной играют важную роль в процессах развития и поддержания гомеостаза. Кроме того их аномальные выражения был связан с развития и прогрессирования различных легочных заболеваний5. Воспалительные легочных заболеваний, вызванных загрязнением воздуха продемонстрировала большую серьезность и бедных прогнозом у самок, указав, что гормоны и эстральный цикл может регулировать легких врожденный иммунитет и Мирна выражение в ответ на экологические проблемы 6. в настоящем Протоколе, мы используем воздействия озона, который является одним из основных компонентов загрязнения воздуха, чтобы побудить форму воспаления легких в самок мышей, что происходит в отсутствие адаптивного иммунитета. С помощью озона, мы вызывая развитие сократимость hyperresponsiveness, который связан с повреждения эпителиальных клеток дыхательных путей и увеличение числа нейтрофилов и воспалительных медиаторов в проксимальном airways7. В настоящее время есть не хорошо описанные протоколы охарактеризовать и проанализировать интерферирующим эстрального цикла в подвергшихся воздействию озона мышей.
Ниже мы опишем простой метод для определения этапов эстрального цикла и Мирна выражение в легочной ткани самок мышей, воздействию озона. Мы также рассмотреть эффективные биоинформатики подходы к обнаружения и целевой идентификации Мирна, с акцентом на вычислительной биологии. Мы анализируем microarray данные с помощью Лимма, R/Bioconductor программное обеспечение, которое обеспечивает интегрированное решение для анализа данных из выражения гена эксперименты8. Анализ ПЦР массива данных от Лимма имеет преимущество с точки зрения власти над t теста на основе процедур при использовании небольшое количество массивов/образцы для сравнения выражений. Чтобы понять биологические контексте Мирна выражение результатов, затем мы использовали программное обеспечение функционального анализа. Для того чтобы понять механизмы, регулирующие transcriptional изменений и прогнозирования вероятных результатов, программное обеспечение сочетает в себе Мирна выражения наборов данных и знаний из литературы9. Это преимущество по сравнению с программным обеспечением, просто искать статистических обогащения в перекрывающимися наборами адаптивной.
Protocol
Representative Results
Discussion
МикроРНК профилирование является выгодным техника для диагностики заболеваний и механистические исследований. В этой рукописи мы определили протокол для оценки выражения интерферирующим прогнозам регулировать воспалительные гены в легких самок мышей, воздействию озона в различных…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантов из низ K01HL133520 (PS) и K12HD055882 (PS). Авторы благодарят д-р Джоанна Floros за помощь с озоном воздействия экспериментов.
Materials
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | 8 weeks old |
| UltraPure Water | Thermo Fisher Scientific | 10813012 | |
| Sterile plastic pipette | Fisher Scientific | 13-711-25 | Capacity: 1.7mL |
| Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 2951TS | |
| Light microscope | Microscope World | MW3-H5 | 10X and 20X objective |
| Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP | Henry Schein Animal Health | 55853 | 90 mg/kg. Controlled drug. |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Laboratories | 139-236 | 10mg/kg. Controlled Drug. |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dilute to 70% ethanol with water. |
| 21G gauge needle | BD Biosciences | 305165 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 329654 | 1mL |
| Operating Scissors | World Precision Instruments | 501221, 504613 | 14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip |
| Tweezer Kit | World Precision Instruments | 504616 | |
| -80 ˚C freezer | Forma | 7240 | |
| Spectrum Bessman Tissue Pulverizers | Fisher Scientific | 08-418-1 | Capacity: 10 to 50mg |
| RNase-free Microfuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12400 | 1.5 mL |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep Plus | Zymo Research | R2071 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | |
| Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array | Qiagen | MIMM-105Z | |
| Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12225 | for 20 μl reactions |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation | https://office.microsoft.com/excel/ | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/ | |
| R Software | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
| Thermal cycler or chilling/heating block | General Lab Supplier | ||
| Microcentrifuge | General Lab Supplier | ||
| Real-time PCR cycler | General Lab Supplier | ||
| Multichannel pipettor | General Lab Supplier | ||
| RNA wash buffer | Zymo Research | R1003-3-48 | 48 mL |
| DNA digestion buffer | Zymo Research | E1010-1-4 | 4 mL |
| RNA pre-wash buffer | Zymo Research | R1020-2-25 | 25 mL |
| Ultraviolet ozone analyzer | Teledyne API | Model T400 | http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 |
| Mass flow controllers | Sierra Instruments Inc | Flobox 951/954 | http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html |
Riferimenti
- Rebane, A., Akdis, C. A. MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).
- Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. How do microRNAs regulate gene expression?. Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).
- Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases. Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).
- Sessa, R., Hata, A. Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases. Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).
- Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation. Biology of Sex Differences. 9 (1), 18 (2018).
- Aris, R. M., et al. Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy. American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
- Krämer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis. Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. In vitro exposure of proteins to ozone. Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression. Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).
- Smyth, G. K., et al. Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User’s Guide. Bioconductor. , (2002).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538 (2012).
- Alves, M. G., et al. Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology. Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).
- Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Walker, S. E., Lorsch, J. RNA purification- precipitation methods. Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).
- Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).
- Smyth, G. K. Limma: linear models for microarray data. Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).
- Griffiths-Jones, S. miRBase: the microRNA sequence database. Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).
- Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets. RNA. 12 (2), 192-197 (2006).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions. Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).
- Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression. Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).
