Pulmão microRNA Profiling através do ciclo estral em camundongos expostos de ozônio
Summary
Aqui nós descrevemos um método para avaliar a expressão de pulmão de miRNAs que são previstos para regular os genes inflamatórios usar ratos expostos ao ozônio ou ar filtrado em diferentes fases do ciclo estral.
Abstract
Criação de perfil de MicroRNA (miRNA) tornou-se de interesse para os investigadores que trabalham em diversas áreas de pesquisa da biologia e da medicina. Atuais estudos mostram um promissor futuro de usar miRNAs no diagnóstico e cuidados de doenças pulmonares. Aqui, definimos um protocolo para miRNA perfis para medir a abundância relativa de um grupo de miRNAs previstos para regular os genes inflamatórios no tecido do pulmão de um modelo de mouse de inflamação das vias aéreas induzida por ozônio. Porque tem sido demonstrado que os níveis de hormônio sexual circulante podem afetar a regulação da imunidade inata de pulmão em mulheres, a finalidade desse método é descrever um inflamatório miRNA perfilação protocolo em ratos fêmeas, levando em consideração o ciclo estral estágio de cada animal no momento da exposição do ozônio. Abordamos também abordagens aplicáveis bioinformática com miRNA uma métodos de identificação de descoberta e de destino usando- se, um software R/Bioconductor, e software de análise funcional de entender o contexto biológico e caminhos associados expressão diferencial de miRNA.
Introduction
microRNAs (miRNAs) são curtos (19-25 nucleotides), ocorrem naturalmente, não-codificantes moléculas de RNA. Sequências de miRNAs são evolutivas conservada entre espécies, sugerindo a importância de miRNAs na regulação de funções fisiológicas1. microRNA expression profiling tem provado para ser útil para identificar os miRNAs que são importantes na regulação de uma variedade de processos, incluindo a resposta imune, diferenciação celular, processos de desenvolvimento e apoptose2. Mais recentemente, os miRNAs foram reconhecidos por seu potencial uso no diagnóstico da doença e terapêutica. Para pesquisadores estudando os mecanismos de regulação gênica, medir miRNA expressão pode iluminar sistemas-nível modelos de processos regulatórios, especialmente quando informações miRNA são mescladas com mRNA profiling e outros dados de genoma-escala3. Por outro lado, os miRNAs também foram mostrados para ser mais estável que os mRNAs em uma variedade de tipos de amostra e também são mensuráveis com maior sensibilidade do que proteínas4. Isto levou a interesse considerável no desenvolvimento de miRNAs como biomarcadores para diversas aplicações de diagnósticos moleculares, incluindo doenças pulmonares.
No pulmão, miRNAs desempenham um papel importante nos processos de desenvolvimento e a manutenção da homeostase. Além disso, sua expressão anormal tem sido associada com o desenvolvimento e a progressão de várias doenças pulmonares5. Doença pulmonar inflamatória induzida pela poluição do ar tem demonstrado maior gravidade e pior prognóstico nas fêmeas, indicando que os hormônios e o ciclo estral podem regular pulmão inata imunidade e miRNA expressão em resposta aos desafios ambientais 6. no presente protocolo, usamos a exposição de ozônio, que é um componente importante da poluição do ar, para induzir uma forma de inflamação pulmonar em ratos fêmeas que ocorre na ausência de imunidade adaptativa. Usando ozônio, nós estão induzindo o desenvolvimento das vias aéreas hyperresponsiveness que está associada a danos nas células epiteliais das vias respiratórias e um aumento de neutrófilos e mediadores inflamatórios em vias aéreas proximais7. Atualmente, não existem protocolos bem descritos para caracterizar e analisar os miRNAs em todo o ciclo estral em camundongos expostos de ozônio.
Abaixo, descrevemos um método simples para identificar os estágios do ciclo estral e miRNA expressão no tecido pulmonar de ratos fêmeas exposto ao ozônio. Também abordamos a bioinformática eficazes abordagens para identificação miRNA descoberta e alvo, com ênfase na biologia computacional. Analisamos os dados de microarray usando- se, um software de R/Bioconductor que fornece uma solução integrada para a análise de dados a partir de experimentos de expressão de gene8. Análise de dados de matriz PCR de se tem uma vantagem em termos de poder sobre os procedimentos de teste-t com base quando usando o pequeno número de amostras/matrizes para comparar a expressão. Para compreender o contexto biológico miRNA dos resultados da expressão, usamos o software de análise funcional. Para entender os mecanismos de regulação transcricionais mudanças e prever os prováveis resultados, o software combina miRNA-expressão datasets e conhecimento a partir da literatura9. Esta é uma vantagem quando comparado com o software que só olham para o enriquecimento estatístico em sobreposição a conjuntos de miRNAs.
Protocol
Representative Results
Discussion
MicroRNA perfis é uma técnica vantajosa para diagnóstico da doença e investigação mecanicista. Neste manuscrito, definimos um protocolo para avaliar a expressão de miRNAs que são previstos para regular os genes inflamatórios nos pulmões de ratos fêmeas expostos ao ozônio nas fases do ciclo estral diferente. Métodos para a determinação do ciclo estral, tais como o método de detecção visual, têm sido descritos16. No entanto, estes dependem de medições one-time e, portanto, não …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada por concessões do NIH K01HL133520 (PS) e K12HD055882 (PS). Os autores Dr. Joanna Floros agradecer a assistência com experimentos de exposição de ozônio.
Materials
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | 8 weeks old |
| UltraPure Water | Thermo Fisher Scientific | 10813012 | |
| Sterile plastic pipette | Fisher Scientific | 13-711-25 | Capacity: 1.7mL |
| Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 2951TS | |
| Light microscope | Microscope World | MW3-H5 | 10X and 20X objective |
| Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP | Henry Schein Animal Health | 55853 | 90 mg/kg. Controlled drug. |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Laboratories | 139-236 | 10mg/kg. Controlled Drug. |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dilute to 70% ethanol with water. |
| 21G gauge needle | BD Biosciences | 305165 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 329654 | 1mL |
| Operating Scissors | World Precision Instruments | 501221, 504613 | 14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip |
| Tweezer Kit | World Precision Instruments | 504616 | |
| -80 ˚C freezer | Forma | 7240 | |
| Spectrum Bessman Tissue Pulverizers | Fisher Scientific | 08-418-1 | Capacity: 10 to 50mg |
| RNase-free Microfuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12400 | 1.5 mL |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep Plus | Zymo Research | R2071 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | |
| Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array | Qiagen | MIMM-105Z | |
| Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12225 | for 20 μl reactions |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation | https://office.microsoft.com/excel/ | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/ | |
| R Software | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
| Thermal cycler or chilling/heating block | General Lab Supplier | ||
| Microcentrifuge | General Lab Supplier | ||
| Real-time PCR cycler | General Lab Supplier | ||
| Multichannel pipettor | General Lab Supplier | ||
| RNA wash buffer | Zymo Research | R1003-3-48 | 48 mL |
| DNA digestion buffer | Zymo Research | E1010-1-4 | 4 mL |
| RNA pre-wash buffer | Zymo Research | R1020-2-25 | 25 mL |
| Ultraviolet ozone analyzer | Teledyne API | Model T400 | http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 |
| Mass flow controllers | Sierra Instruments Inc | Flobox 951/954 | http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html |
Riferimenti
- Rebane, A., Akdis, C. A. MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).
- Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. How do microRNAs regulate gene expression?. Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).
- Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases. Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).
- Sessa, R., Hata, A. Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases. Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).
- Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation. Biology of Sex Differences. 9 (1), 18 (2018).
- Aris, R. M., et al. Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy. American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
- Krämer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis. Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. In vitro exposure of proteins to ozone. Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression. Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).
- Smyth, G. K., et al. Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User’s Guide. Bioconductor. , (2002).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538 (2012).
- Alves, M. G., et al. Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology. Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).
- Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Walker, S. E., Lorsch, J. RNA purification- precipitation methods. Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).
- Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).
- Smyth, G. K. Limma: linear models for microarray data. Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).
- Griffiths-Jones, S. miRBase: the microRNA sequence database. Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).
- Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets. RNA. 12 (2), 192-197 (2006).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions. Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).
- Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression. Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).
