microRNAs (miRNAs) er kort (19 til 25 nukleotider), naturlig forekommende, ikke-koding RNA molekyler. Sekvenser av miRNAs er evolusjonære bevart over arter, tyder betydningen av miRNAs i å regulere fysiologiske funksjoner¹. microRNA expression profilering har vist seg for å være nyttig for å identifisere miRNAs som er viktige i regulering av en rekke prosesser, inkludert immunforsvar, celledifferensiering, utviklingsprosesser og apoptose². Nyligere har miRNAs blitt anerkjent for deres mulige bruk i sykdom diagnostikk og therapeutics. For forskere studere mekanismer av genet, kan måle miRNA uttrykk opplyse systemer nivå modeller av regulatoriske prosesser, spesielt når miRNA informasjonen flettes med mRNA profilering og andre genomet-skalaen data³. På den annen side, miRNAs har også vist seg å være mer stabilt enn mRNAs i en rekke prøven typer og er også målbar med større følsomhet enn proteiner⁴. Dette har ført til betydelig interesse for utvikling av miRNAs som biomarkers for ulike molekylær diagnostiske programmer, inkludert lungesykdommer.

I lungene spille miRNAs viktige roller i utviklingsprosesser og vedlikehold av homeostase. Videre har deres unormale uttrykk vært knyttet til utvikling og progresjon av ulike lungesykdommer⁵. Inflammatorisk lungesykdommer forårsaket av luftforurensning har vist større alvorlighetsgrad og dårligere prognose i kvinner, som indikerer at hormoner og estrous syklusen kan regulere lunge medfødt immunitet og miRNA uttrykk i reaksjoner på miljørelaterte utfordringer ⁶. i denne protokollen, bruker vi ozon eksponering, som er en viktig komponent av luftforurensning, for å indusere en form for lungebetennelse i kvinnelige mus som oppstår i fravær av adaptiv immunitet. Ved hjelp av ozon, er vi indusere utviklingen av luftveiene hyperresponsiveness som er tilknyttet airway epithelial celleskader og en økning i nøytrofile og inflammatoriske mediatorer i proksimale airways⁷. Foreløpig er det ikke godt beskrevet protokoller for å karakterisere og analysere miRNAs over estrous syklusen i ozon-eksponerte mus.

Nedenfor beskriver vi en enkel metode for å identifisere estrous syklus faser og miRNA uttrykk i lungevev av kvinnelige mus utsatt for ozon. Vi også ta effektive bioinformatikk tilnærminger til miRNA oppdagelsen og target identifikasjon, med vekt på beregningsorientert biologi. Vi analyserer microarray dataene med limma, en R/Bioconductor programvare som tilbyr en integrert løsning for å analysere data gen uttrykk eksperimenter⁸. Analyse av PCR matrisedata fra limma har en fordel i forhold til makt over t-test basert prosedyrer når bruk av matriser/prøver for å sammenligne uttrykk. For å forstå biologisk sammenheng med miRNA uttrykk resultater, brukt vi så funksjonell analyseprogramvare. For å forstå mekanismene regulere transcriptional endringer og forutse sannsynlig utfall, kombinerer programvaren miRNA uttrykk datasett og kunnskap fra litteratur⁹. Dette er en fordel når sammenlignet med programvare som bare se for statistiske berikelse i overlappende til sett med miRNAs.