Summary

폐 예측에 관한 프로 파일링 걸쳐 the Estrous 사이클 오존에 노출 된 쥐에

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

여기 우리가 폐 식 평가 하는 방법을 설명 예측 하는 miRNAs의 염증 유전자를 조절 하기 위해 마우스를 사용 하 여 오존에 노출 또는 estrous 주기의 여러 단계에서 공기를 필터링.

Abstract

(미르) 예측에 관한 프로 파일링 생물학과 의학의 다양 한 연구 분야에서 일 하는 연구원에 게 관심사의 되고있다. 현재 학문은 보여준다는 약속 miRNAs 및 폐 질환 진단에 사용의 미래. 여기, 우리 미르 규제는 오존 유발 기도 염증 마우스 모델의에서 폐 조직에 염증 유전자를 예측 하는 miRNAs의 그룹의 관계 되는 풍부를 측정 하는 프로 파일링에 대 한 프로토콜을 정의 합니다. 보였다는 순환 호르몬 수준의 영향을 미칠 수 여성에서 폐 타고 난 면제의 규칙, 때문에이 방법의 목적은 프로 파일링 프로토콜 estrous 주기를 고려 하는 여성 쥐에는 염증 미르 설명 하 오존 노출 시간에 각 동물의 단계. 우리는 또한 limma, R/Bioconductor 소프트웨어를 사용 하 여 미르 검색 및 대상 식별 방법에 적용 가능한 생물 정보학 접근 주소 및 생물 학적 컨텍스트 및 경로 이해 하기 기능 분석 소프트웨어와 관련 된 차동 미르 식입니다.

Introduction

microRNAs (miRNAs)는 짧은 (19-25의 뉴클레오티드), 자연스럽 게 발생, 비 코딩 RNA 분자. MiRNAs의 순서는 진화 생리 기능1조절에 miRNAs의 중요성을 제안 하는 종에 걸쳐 보존 이다. 예측에 관한 식 프로 파일링 miRNAs 다양 한 면역 반응, 세포 분화, 발달 과정 및 apoptosis2를 포함 하 여 프로세스의 규칙에 중요 한 식별 하는 데 도움이 될 입증 되었습니다. 더 최근에, miRNAs 질병 진단 및 치료에 그들의 잠재적인 사용에 대 한 인정을 받고 있다. 유전자 규칙의 기계 장치를 공부 하는 연구원에 대 한 측정 미르 식 수 계몽 규제 프로세스의 시스템-레벨 모델 미르 정보가 mRNA 프로 파일링과 다른 게놈 규모 데이터3병합 하는 경우에 특히. 다른 한편으로, miRNAs mRNAs 견본 종류의 범위에서 보다 더 안정적인 것으로 표시 되었습니다 또한 되며 또한 단백질4보다 큰 감도와 측정. 이 폐 병을 포함 한 다양 한 분자 진단 응용을 위한 생체로 miRNAs의 개발에 상당한 관심을 주도하 고 있다.

폐, miRNAs 개발 프로세스 및 항상성 유지에 중요 한 역할을 재생합니다. 또한, 그들의 비정상적인 식 개발 및 다양 한 폐 질환5진행 관련 된 되었습니다. 공기 오염에 의해 유도 된 염증 성 폐 질환 큰 심각도 및 여성, 호르몬과 estrous 주기 환경 문제에 대 한 응답에서 폐 선 천 적 면역과 미르 식 규제 수 나타내는에서 가난한 예 후를 시연 하고있다 6.이 프로토콜을 사용 하 여 오존 노출, 대기오염의 주요 구성 요소인 적응 면역의 부재에서 발생 하는 여성 쥐에서 폐 염증의 형태를 유도. 오존을 사용 하 여 우리 기도 상피 세포 손상 및 호 중구 증가 염증 성 중재자 인접 항공7에 관련 된 기도 hyperresponsiveness의 개발을 유도 하. 현재, 거기에 잘 설명된 프로토콜 특성화 및 오존 노출 쥐에서 estrous 주기 miRNAs 분석 되지 않습니다.

아래, 우리 estrous 주기 단계 및 오존에 노출 여성 쥐의 폐 조직에서 miRNA 식을 식별 하는 간단한 방법을 설명 합니다. 우리는 또한 효과적인 생물 정보학 전산 생물학에 대 한 강조와 함께 미르 검색 및 대상 식별, 접근 주소. Limma, 진 식 실험8에서 데이터 분석을 위한 통합된 솔루션을 제공 하는 R/Bioconductor 소프트웨어를 사용 하 여 microarray 데이터 분석. Limma 에서 PCR 배열 데이터의 분석 비교 식 배열/샘플 작은 수를 사용 하는 경우 t-검정에 근거한 절차를 통해 권력의 측면에서 장점이 있다. MiRNA 식 결과의 생물 학적 맥락 이해, 우리는 다음 기능 분석 소프트웨어를 사용. Transcriptional 변화를 조절 하는 메커니즘을 이해 하 고 예측 가능성이 결과, 소프트웨어 미르 식 데이터 집합 및 문학9에서 지식을 결합 합니다. 이것은 통계 농축 miRNAs의 세트에 중복에 보면 소프트웨어와 비교 하면 이점이 다입니다.

Protocol

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 펜실베니아 주립 대학에 의해 승인 되었습니다. 1입니다. Estrous 주기 단계의 평가 제대로 C57BL/6 마우스 (8-9 주 이전)을 사용 하 여 한 손으로 마우스 억제 기술 Machholz 외.10에서 설명 하는 여성을 제 지 하십시오. 매우 순수한 물 10 μ로 살 균 플라스틱 피 펫을 채우십시오….

Representative Results

얼룩에 관찰 하는 다른 세포 유형 마우스 estrous 주기 단계 (그림 1)를 식별 하는 데 사용 됩니다. 이러한 세포 형태학에 의해 식별 됩니다. Proestrus, 동안 세포는 거의 독점적으로 라운드 모양, 올바른 nucleated 상피 세포 (그림 1A)의 클러스터. 마우스 발 정기 단계에 있을 때 셀 cornified 편평 상피 세포, 밀도가 포장된 클러스터 (<strong…

Discussion

예측에 관한 프로 파일링 질병 진단 및 기계 론 적인 연구에 대 한 유리한 기술입니다. 이 원고에 다른 estrous 주기 단계에 있는 오존에 노출 여성 쥐의 폐에 염증 유전자를 조절 하는 것으로 예측 하는 miRNAs의 식을 평가 하는 프로토콜을 정의 했습니다. Estrous 주기 시각 탐지 방법 등의 결정에 대 한 방법이 설명된16되었습니다. 그러나, 이러한 1 회 측정에 의존 하 고 따라서 신뢰할…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 NIH K01HL133520 (PS) 및 K12HD055882 (PS)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. 저자는 오존 노출 실험을 가진 원조에 대 한 박사 조 안 나 Floros를 감사합니다.

Materials

C57BL/6J mice The Jackson Laboratory 000664 8 weeks old
UltraPure Water Thermo Fisher Scientific 10813012
Sterile plastic pipette Fisher Scientific 13-711-25 Capacity: 1.7mL
Frosted Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 2951TS
Light microscope Microscope World MW3-H5 10X and 20X objective
Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP Henry Schein Animal Health 55853 90 mg/kg. Controlled drug.
Xylazine Sterile Solution Lloyd Laboratories 139-236 10mg/kg. Controlled Drug.
Ethanol Fisher Scientific BP2818100 Dilute to 70% ethanol with water.
21G gauge needle BD Biosciences 305165
Syringe Fisher Scientific 329654 1mL
Operating Scissors World Precision Instruments 501221, 504613 14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip
Tweezer Kit World Precision Instruments 504616
-80 ˚C freezer Forma 7240
Spectrum Bessman Tissue Pulverizers Fisher Scientific 08-418-1 Capacity: 10 to 50mg
RNase-free Microfuge Tubes Thermo Fisher Scientific AM12400 1.5 mL
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596026
Direct-zol RNA MiniPrep Plus Zymo Research R2071
NanoDrop Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W
miScript II RT kit Qiagen 218161
Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array Qiagen MIMM-105Z
Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes Thermo Fisher Scientific AM12225 for 20 μl reactions
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control Qiagen 219610
Microsoft Excel Microsoft Corporation https://office.microsoft.com/excel/
Ingenuity Pathway Analysis Qiagen https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/
R Software The R Foundation https://www.r-project.org/
Thermal cycler or chilling/heating block General Lab Supplier
Microcentrifuge General Lab Supplier
Real-time PCR cycler General Lab Supplier
Multichannel pipettor General Lab Supplier
RNA wash buffer Zymo Research R1003-3-48 48 mL
DNA digestion buffer Zymo Research E1010-1-4 4 mL
RNA pre-wash buffer Zymo Research R1020-2-25 25 mL
Ultraviolet ozone analyzer Teledyne API Model T400 http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400
Mass flow controllers Sierra Instruments Inc Flobox 951/954 http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Fuentes, N., Silveyra, P. Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice. J. Vis. Exp. (143), e58664, doi:10.3791/58664 (2019).

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