फेफड़े microRNA ओजोन-उजागर चूहों में मद चक्र भर में profiling
Summary
यहां हम एक विधि का वर्णन करने के लिए miRNAs की फेफड़ों की अभिव्यक्ति का आकलन है कि भड़काऊ जीन को विनियमित चूहों ओजोन या मद चक्र के विभिंन चरणों में फ़िल्टर की गई हवा का उपयोग करने की भविष्यवाणी कर रहे हैं ।
Abstract
MicroRNA (miRNA) की रूपरेखा जीव विज्ञान और चिकित्सा के विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों में काम कर रहे शोधकर्ताओं के लिए ब्याज की बन गई है. वर्तमान अध्ययन निदान और फेफड़ों के रोगों की देखभाल में miRNAs का उपयोग कर के एक होनहार भविष्य दिखाते हैं । यहां, हम एक ओजोन प्रेरित airway सूजन माउस मॉडल से फेफड़ों के ऊतकों में भड़काऊ जीन को विनियमित करने की भविष्यवाणी की miRNAs के एक समूह के रिश्तेदार बहुतायत को मापने के लिए miRNA रूपरेखा के लिए एक प्रोटोकॉल को परिभाषित । क्योंकि यह दिखाया गया है कि परिसंचारी सेक्स हार्मोन का स्तर महिलाओं में फेफड़े के जन्मजात प्रतिरक्षा के विनियमन को प्रभावित कर सकते हैं, इस विधि का उद्देश्य मादा चूहों में एक भड़काऊ miRNA profiling प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए है, ध्यान में मद चक्र लेने ओजोन एक्सपोजर के समय प्रत्येक जानवर की स्टेज । हम भी limma, एक आर/कंडक्टर सॉफ्टवेयर, और कार्यात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए miRNA खोज और लक्ष्य पहचान तरीकों को लागू bioinformatics दृष्टिकोण को संबोधित जैविक संदर्भ और साथ जुड़े रास्ते को समझने के लिए विभेद miRNA अभिव्यक्ति ।
Introduction
microRNAs (miRNAs) कम कर रहे है (19 से 25 न्यूक्लियोटाइड), स्वाभाविक रूप से होने वाली, गैर-आरएनए अणु कोडन । miRNAs के अनुक्रम प्रजातियों के पार संरक्षित विकासवादी हैं, शारीरिक कार्यों को विनियमित करने में miRNAs के महत्व का सुझाव1। microRNA अभिव्यक्ति रूपरेखा miRNAs की पहचान करने के लिए उपयोगी साबित किया गया है कि प्रक्रियाओं की एक किस्म के विनियमन में महत्वपूर्ण हैं, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया सहित, कोशिका विभेद, विकासात्मक प्रक्रियाओं, और apoptosis2. हाल ही में, miRNAs रोग निदान और चिकित्सकीय में उनके संभावित उपयोग के लिए मांयता प्राप्त किया गया है । जीन विनियमन के तंत्र का अध्ययन शोधकर्ताओं के लिए, miRNA अभिव्यक्ति मापने प्रणालियों विनियामक प्रक्रियाओं के स्तर के मॉडल, विशेष रूप से जब miRNA जानकारी mRNA profiling और अंय जीनोम के साथ विलय कर सकते है स्केल डेटा3। दूसरी ओर, miRNAs भी नमूना प्रकार की एक श्रेणी में mRNAs से अधिक स्थिर होना दिखाया गया है और भी प्रोटीन की तुलना में अधिक से अधिक संवेदनशीलता के साथ मध्यम श्रेणी के4। यह फेफड़ों के रोगों सहित विविध आणविक नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए miRNAs के विकास में काफी रुचि के लिए नेतृत्व किया गया है ।
फेफड़ों में, miRNAs विकास प्रक्रियाओं और homeostasis के रखरखाव में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । इसके अलावा, उनकी असामांय अभिव्यक्ति के विकास और विभिंन फुफ्फुसीय रोगों के प्रगति के साथ जुड़ा हुआ है5। वायु प्रदूषण से प्रेरित भड़काऊ फेफड़ों की बीमारी महिलाओं में अधिक से अधिक गंभीरता और गरीब रोग का निदान का प्रदर्शन किया है, यह दर्शाता है कि हार्मोन और मद चक्र पर्यावरणीय चुनौतियों के जवाब में फेफड़ों जंमजात उन्मुक्ति और miRNA अभिव्यक्ति को विनियमित कर सकते हैं 6. इस प्रोटोकॉल में, हम ओजोन जोखिम, जो वायु प्रदूषण का एक प्रमुख घटक है का उपयोग करें, मादा चूहों में फेफड़ों की सूजन का एक रूप प्रेरित है कि अनुकूली उन्मुक्ति के अभाव में होता है । ओजोन का उपयोग करके, हम airway उपकला कोशिका क्षति और समीपस्थ एयरवेज7में न्यूट्रोफिल और भड़काऊ मध्यस्थों में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है कि airway hyperresponsiveness के विकास उत्प्रेरण कर रहे हैं. वर्तमान में, वहां अच्छी तरह से नहीं कर रहे है प्रोटोकॉल का वर्णन करने और ओजोन उजागर चूहों में मद चक्र भर में miRNAs विश्लेषण ।
नीचे, हम एक सरल करने के लिए मद चक्र चरणों और मादा ओजोन के संपर्क में चूहों के फेफड़े के ऊतकों में miRNA अभिव्यक्ति की पहचान विधि का वर्णन । हम भी गणना जीव विज्ञान पर जोर देने के साथ miRNA खोज और लक्ष्य पहचान के लिए प्रभावी bioinformatics दृष्टिकोण का पता । हम limma, एक आर/कंडक्टर सॉफ्टवेयर है कि जीन अभिव्यक्ति प्रयोगों8से डेटा का विश्लेषण करने के लिए एक एकीकृत समाधान प्रदान करता है का उपयोग कर microarray डेटा का विश्लेषण । limma से पीसीआर ऐरे डेटा का विश्लेषण शक्ति के मामले में टी परीक्षण आधारित प्रक्रियाओं में एक फायदा है जब arrays की छोटी संख्या का उपयोग कर अभिव्यक्ति की तुलना/ miRNA अभिव्यक्ति परिणामों के जैविक संदर्भ को समझने के लिए, हम तो कार्यात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया । आदेश में transcriptional परिवर्तन विनियमन तंत्र को समझने के लिए और संभावना परिणाम की भविष्यवाणी करने के लिए, सॉफ्टवेयर miRNA-अभिव्यक्ति डेटासेट और साहित्य9से ज्ञान को जोड़ती है । यह एक फायदा है जब सॉफ्टवेयर के साथ तुलना में है कि बस miRNAs के सेट के लिए अतिव्यापी में सांख्यिकीय संवर्धन के लिए देखो ।
Protocol
Representative Results
Discussion
MicroRNA profiling दोनों रोग निदान और यंत्रवत अनुसंधान के लिए एक लाभप्रद तकनीक है । इस पांडुलिपि में, हम miRNAs की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल परिभाषित किया है कि विभिन्न मद चक्र चरणों में ओजोन को …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अनुसंधान NIH K01HL133520 (पी एस) और K12HD055882 (पी एस) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । लेखकों ने ओजोन एक्सपोजर प्रयोगों के साथ सहायता के लिए डॉ॰ जोआना Floros का धन्यवाद किया ।
Materials
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | 8 weeks old |
| UltraPure Water | Thermo Fisher Scientific | 10813012 | |
| Sterile plastic pipette | Fisher Scientific | 13-711-25 | Capacity: 1.7mL |
| Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 2951TS | |
| Light microscope | Microscope World | MW3-H5 | 10X and 20X objective |
| Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP | Henry Schein Animal Health | 55853 | 90 mg/kg. Controlled drug. |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Laboratories | 139-236 | 10mg/kg. Controlled Drug. |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dilute to 70% ethanol with water. |
| 21G gauge needle | BD Biosciences | 305165 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 329654 | 1mL |
| Operating Scissors | World Precision Instruments | 501221, 504613 | 14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip |
| Tweezer Kit | World Precision Instruments | 504616 | |
| -80 ˚C freezer | Forma | 7240 | |
| Spectrum Bessman Tissue Pulverizers | Fisher Scientific | 08-418-1 | Capacity: 10 to 50mg |
| RNase-free Microfuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12400 | 1.5 mL |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep Plus | Zymo Research | R2071 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | |
| Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array | Qiagen | MIMM-105Z | |
| Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12225 | for 20 μl reactions |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation | https://office.microsoft.com/excel/ | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/ | |
| R Software | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
| Thermal cycler or chilling/heating block | General Lab Supplier | ||
| Microcentrifuge | General Lab Supplier | ||
| Real-time PCR cycler | General Lab Supplier | ||
| Multichannel pipettor | General Lab Supplier | ||
| RNA wash buffer | Zymo Research | R1003-3-48 | 48 mL |
| DNA digestion buffer | Zymo Research | E1010-1-4 | 4 mL |
| RNA pre-wash buffer | Zymo Research | R1020-2-25 | 25 mL |
| Ultraviolet ozone analyzer | Teledyne API | Model T400 | http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 |
| Mass flow controllers | Sierra Instruments Inc | Flobox 951/954 | http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html |
Riferimenti
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