ריאות microRNA פרופיל לרוחב ייחום בעכברים החשופים אוזון
Summary
כאן אנו מתארים שיטה להערכת ביטוי ריאות miRNAs זה הם חזו להסדיר גנים דלקתיים שימוש בעכברים נחשפים האוזון או סינון אוויר בשלבים שונים של ייחום.
Abstract
פרופיל MicroRNA (miRNA) הפך לעניין חוקרים עובדים בתחומים שונים מחקר בביולוגיה ורפואה. מחקרים הנוכחי מראים התחלה מבטיחה בעתיד הכרוכים miRNAs באבחון, טיפול של מחלות ריאה. . כאן, אנחנו להגדיר עבור miRNA פרופיל כדי למדוד את השפע היחסי של קבוצת miRNAs חזה להסדיר גנים דלקתיים רקמת הריאה של מודל העכבר דלקת דרכי הנשימה אוזון-induced פרוטוקול. כי הוכח כי במחזור רמות הורמון המין יכול להשפיע ברגולציה של הריאה מולדת חסינות אצל נקבות, מטרת שיטה זו היא לתאר את miRNA דלקתיות של פרופיל פרוטוקול בעכברים נקבה, אם לוקחים בחשבון את ייחום שלב של כל בעל חיים בזמן החשיפה האוזון. אנו הכתובת גם גישות ביואינפורמטיקה ישים miRNA של גילוי ושל יעד שיטות זיהוי באמצעות limma, תוכנה R/Bioconductor, ו אנליזה פונקציונלית תוכנה כדי להבין את ההקשר הביולוגי ואת מסלולים הקשורים ביטוי דיפרנציאלי miRNA.
Introduction
Rna (miRNAs) הם קצרים (19-25 נוקלאוטידים), המתרחשים באופן טבעי, ללא קידוד RNA מולקולות. רצפים של miRNAs הם אבולוציונית והתפאורה על פני מינים, רומז על חשיבות miRNAs בוויסות פונקציות פיזיולוגיים1. יצירת פרופיל ביטוי microRNA הוכח להיות מועיל לזיהוי miRNAs חשובים בוויסות מגוון רחב של תהליכים, כולל את התגובה החיסונית, התמיינות תאים, תהליכים פיתוחיים אפופטוזיס2. לאחרונה, miRNAs זוהו לשימוש שלהם פוטנציאל אבחון המחלה הרפוי. עבור החוקרים ללמוד מנגנונים של הכונה, מדידה miRNA ביטוי יכול להאיר את מערכות ברמת מודלים של תהליכים רגולטוריים, במיוחד כאשר miRNA המידע יאוחד עם פרופיל ה-mRNA, אחרים נתונים הגנום בקנה מידה3. מצד שני, miRNAs יש גם הוכח להיות יציבים יותר mRNAs במגוון סוגי הדגימה, גם הם מדידה עם רגישות גדולה יותר מאשר חלבונים4. זה הוביל עניין רב בהתפתחות miRNAs כמו סמנים ביולוגיים עבור יישומים אבחון מולקולרי שונים ומגוונים, לרבות מחלות ריאה.
הריאות, miRNAs משחק תפקידים חשובים תהליכים התפתחותיים, שמירה על הומאוסטזיס. יתר על כן, ביטוי לא תקין שלהם נמצא קשור פיתוח, ההתקדמות של מחלות שונות5. מחלות ריאה דלקתיות הנגרמת על ידי זיהום אוויר הוכיחה ביתר חומרה והפרוגנוזה עניים אצל נקבות, המציין הורמוני, את ייחום יכול לווסת את הריאה מולדת חסינות miRNA הבעה בתגובה אתגרים סביבתיים 6. ב פרוטוקול זה, אנו משתמשים באוזון חשיפה, המהווה מרכיב עיקרי של זיהום אוויר, לזירוז צורה של דלקת ריאות בעכברים הנשית המתרחשת בהעדר חסינות מסתגלת. באמצעות אוזון, אנחנו נמצאים גרימת הפיתוח של hyperresponsiveness דרכי הנשימה המשויך נזק תאי אפיתל דרכי הנשימה, עלייה נויטרופילים, מתווכים דלקתיים ב איירווייז proximal7. כיום, ישנם לא פרוטוקולים היטב תיאר לאפיין ולנתח miRNAs מעבר ייחום בעכברים החשופים האוזון.
להלן, אנו מתארים שיטה פשוטה כדי לזהות ייחום שלבים וביטוי miRNA ברקמת הריאה של עכברים הנשי נחשפים האוזון. אנו הכתובת גם גישות ביואינפורמטיקה יעיל זיהוי גילוי של היעד miRNA, עם דגש על ביולוגיה חישובית. אנחנו מנתחים את הנתונים microarray באמצעות limma, יש תוכנה R/Bioconductor אשר מספק פתרון משולב עבור ניתוח נתונים ניסויים של ביטוי גנים8. ניתוח של נתונים מערך ה-PCR limma יש יתרון מבחינת צריכת חשמל על הליכים לפי מבחן t כאשר באמצעות מספר קטן של מערכים/דוגמאות כדי להשוות את הביטוי. כדי להבין את ההקשר הביולוגי של תוצאות הביטוי miRNA, אז השתמשנו בתוכנה אנליזה פונקציונלית. על מנת להבין את מנגנוני ויסות שינויים תעתיק לחזות תוצאות סביר, התוכנה משלב miRNA-ביטוי datasets וידע הספרות9. זהו יתרון בהשוואה עם התוכנה פשוט תחפש העשרה סטטיסטי ב חופפים סטים של miRNAs.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרופיל MicroRNA היא טכניקה יתרון לאבחון המחלה והן מכניסטית מחקר. כתב יד זה, הגדרנו פרוטוקול להעריך את הביטוי של miRNAs זה הם חזו להסדיר גנים דלקתיים בריאות של עכברים הנשי נחשפים האוזון בשלבים שונים ייחום. שיטות לקביעת ייחום, כגון שיטת זיהוי חזותי, כבר מתואר16. עם זאת, אלה מסתמכים על מדי…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים NIH K01HL133520 (PS) ו K12HD055882 (PS). המחברים מודים ד ר ג’ואנה Floros על הסיוע עם האוזון חשיפה ניסויים.
Materials
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | 8 weeks old |
| UltraPure Water | Thermo Fisher Scientific | 10813012 | |
| Sterile plastic pipette | Fisher Scientific | 13-711-25 | Capacity: 1.7mL |
| Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 2951TS | |
| Light microscope | Microscope World | MW3-H5 | 10X and 20X objective |
| Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP | Henry Schein Animal Health | 55853 | 90 mg/kg. Controlled drug. |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Laboratories | 139-236 | 10mg/kg. Controlled Drug. |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dilute to 70% ethanol with water. |
| 21G gauge needle | BD Biosciences | 305165 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 329654 | 1mL |
| Operating Scissors | World Precision Instruments | 501221, 504613 | 14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip |
| Tweezer Kit | World Precision Instruments | 504616 | |
| -80 ˚C freezer | Forma | 7240 | |
| Spectrum Bessman Tissue Pulverizers | Fisher Scientific | 08-418-1 | Capacity: 10 to 50mg |
| RNase-free Microfuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12400 | 1.5 mL |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep Plus | Zymo Research | R2071 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | |
| Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array | Qiagen | MIMM-105Z | |
| Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12225 | for 20 μl reactions |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation | https://office.microsoft.com/excel/ | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/ | |
| R Software | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
| Thermal cycler or chilling/heating block | General Lab Supplier | ||
| Microcentrifuge | General Lab Supplier | ||
| Real-time PCR cycler | General Lab Supplier | ||
| Multichannel pipettor | General Lab Supplier | ||
| RNA wash buffer | Zymo Research | R1003-3-48 | 48 mL |
| DNA digestion buffer | Zymo Research | E1010-1-4 | 4 mL |
| RNA pre-wash buffer | Zymo Research | R1020-2-25 | 25 mL |
| Ultraviolet ozone analyzer | Teledyne API | Model T400 | http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 |
| Mass flow controllers | Sierra Instruments Inc | Flobox 951/954 | http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html |
Riferimenti
- Rebane, A., Akdis, C. A. MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).
- Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. How do microRNAs regulate gene expression?. Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).
- Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases. Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).
- Sessa, R., Hata, A. Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases. Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).
- Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation. Biology of Sex Differences. 9 (1), 18 (2018).
- Aris, R. M., et al. Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy. American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
- Krämer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis. Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. In vitro exposure of proteins to ozone. Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression. Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).
- Smyth, G. K., et al. Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User’s Guide. Bioconductor. , (2002).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538 (2012).
- Alves, M. G., et al. Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology. Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).
- Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Walker, S. E., Lorsch, J. RNA purification- precipitation methods. Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).
- Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).
- Smyth, G. K. Limma: linear models for microarray data. Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).
- Griffiths-Jones, S. miRBase: the microRNA sequence database. Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).
- Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets. RNA. 12 (2), 192-197 (2006).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions. Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).
- Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression. Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).
