在暴露于臭氧的小鼠的弹性周期中的肺微 rna 分析
Summary
在这里, 我们描述了一种方法来评估肺部表达 mirna, 预测调节炎症基因使用小鼠暴露在臭氧或过滤空气在不同阶段的雌周期。
Abstract
微 rna (mirna) 分析已成为研究人员对生物学和医学研究领域的兴趣。目前的研究表明, 在肺部疾病的诊断和护理中使用 mirna 是一个有希望的前景。在这里, 我们定义了一个 mirna 分析的协议, 以测量一组 mirna 的相对丰度, 预测从一个臭氧引起的气道炎症小鼠模型调节肺组织中的炎症基因。因为已经证明, 循环性激素水平会影响女性肺先天免疫的调节, 这种方法的目的是描述在雌性小鼠体内的炎症性 mirna 特征分析协议, 同时考虑到发情周期在臭氧暴露时, 每种动物的阶段。我们还讨论了适用于 mirna 发现的生物信息学方法, 并使用limma、r/bit导体软件和功能分析软件进行目标识别, 以了解与之相关的生物背景和途径。差异 mirna 表达。
Introduction
微 rna (mirna) 是短的 (19 到25个核苷酸), 自然存在的, 非编码 rna 分子。mirna 的序列在物种间是进化守变的, 这表明 mirna 在调节生理功能方面的重要性1。微 rna 表达谱已被证明有助于识别在调节各种过程中非常重要的 mirna, 包括免疫反应、细胞分化、发育过程和凋亡2。最近, mirna 因其在疾病诊断和治疗中的潜在用途而被认为是公认的。对于研究基因调控机制的研究人员来说, 测量 mirna 表达可以启发系统级调控过程模型, 特别是当 mirna 信息与 mrna 特征分析和其他基因组规模数据合并时3。另一方面, mirna 在一系列标本类型中也被证明比 mirna 更稳定, 并且也比蛋白质4具有更大的灵敏度。这引起了人们对 mirna 作为包括肺部疾病在内的各种分子诊断应用的生物标志物的开发的极大兴趣。
在肺中, mirna 在发育过程中起着重要作用, 维持稳态。此外, 它们的异常表达与各种肺病的发展和进展有关5。空气污染引起的炎症性肺病在女性中表现出更大的严重程度和更差的预后, 这表明激素和雌激素循环可以调节肺先天免疫和 mirna 的表达, 以应对环境挑战6. 在本议定书中, 我们利用臭氧接触—-空气污染的一个主要组成部分—-在没有适应性免疫力的情况下, 在雌性小鼠中诱发某种形式的肺部炎症。通过使用臭氧, 我们正在诱导气道高反应性的发展, 这与气道上皮细胞损伤和增加中性粒细胞和炎症介质在近端气道 7.目前, 还没有描述良好的协议来描述和分析整个有光泽的周期的 mirna 暴露在臭氧暴露的小鼠。
下面, 我们描述了一个简单的方法来识别有偏离周期阶段和 mirna 表达的女性小鼠的肺组织暴露臭氧。我们还讨论了 mirna 发现和目标识别的有效生物信息学方法, 重点是计算生物学。我们使用limma分析微阵列数据, limma 是一个 r/bicom导体软件, 它为分析基因表达实验8中的数据提供了一个集成的解决方案.在使用少量 arrays2 样本比较表达时, 对limma pcr 阵列数据的分析在功率优于基于 t 检验的程序方面具有优势。为了理解 mirna 表达结果的生物学背景, 我们使用了功能分析软件。为了了解调节转录变化的机制并预测可能的结果, 该软件结合了 mirna 表达集和文献9中的知识。与只在与 mirna 集合重叠的情况下寻求统计丰富的软件相比, 这是一个优势。
Protocol
这里描述的所有方法都得到了宾州立大学动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准。 1. 对激烈循环阶段的评估 使用 machholz 等人描述的单手小鼠约束技术, 适当约束雌性 c57bl6 小鼠 (8-9周大). 用10μl 的超纯水填充无菌塑料移液器。 将塑料移液器的尖端引入阴道。 轻轻冲洗液体4-5 以收集样品。 将含有阴道液的最后冲洗放在…
Representative Results
在涂片中观察到的不同细胞类型用于识别小鼠的有嗅觉周期阶段 (图 1)。这些都是通过细胞形态来识别的。在前体过程中, 细胞几乎完全是圆形、形成良好的有核上皮细胞 (图 1a)。当小鼠处于雌激素阶段时, 细胞是有组织的鳞状上皮细胞, 存在于密集的集群中 (图 1 b)。在流星层, 有组织的上皮细胞和多态核?…
Discussion
微 rna 分析是疾病诊断和机械研究的有利技术。在这篇手稿中, 我们定义了一个评估 mirna 表达的协议, 预测它将调节在不同发情周期阶段暴露在臭氧下的雌性小鼠肺部的炎症基因。介绍了对强度周期的测定方法, 如视觉检测方法, 共16种.但是, 这些数据依赖于一次性测量, 因此是不可靠的。为了准确地识别女性定期周期中的所有有缺陷的周期阶段, 建议采用此处描述的方法。此外, 这…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了 nih k01hl133520 (ps) 和 k12hd055882 (ps) 的资助。作者感谢乔安娜·弗洛罗斯博士在臭氧暴露实验方面的帮助。
Materials
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | 8 weeks old |
| UltraPure Water | Thermo Fisher Scientific | 10813012 | |
| Sterile plastic pipette | Fisher Scientific | 13-711-25 | Capacity: 1.7mL |
| Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 2951TS | |
| Light microscope | Microscope World | MW3-H5 | 10X and 20X objective |
| Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP | Henry Schein Animal Health | 55853 | 90 mg/kg. Controlled drug. |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Laboratories | 139-236 | 10mg/kg. Controlled Drug. |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dilute to 70% ethanol with water. |
| 21G gauge needle | BD Biosciences | 305165 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 329654 | 1mL |
| Operating Scissors | World Precision Instruments | 501221, 504613 | 14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip |
| Tweezer Kit | World Precision Instruments | 504616 | |
| -80 ˚C freezer | Forma | 7240 | |
| Spectrum Bessman Tissue Pulverizers | Fisher Scientific | 08-418-1 | Capacity: 10 to 50mg |
| RNase-free Microfuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12400 | 1.5 mL |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep Plus | Zymo Research | R2071 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | |
| Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array | Qiagen | MIMM-105Z | |
| Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12225 | for 20 μl reactions |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation | https://office.microsoft.com/excel/ | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/ | |
| R Software | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
| Thermal cycler or chilling/heating block | General Lab Supplier | ||
| Microcentrifuge | General Lab Supplier | ||
| Real-time PCR cycler | General Lab Supplier | ||
| Multichannel pipettor | General Lab Supplier | ||
| RNA wash buffer | Zymo Research | R1003-3-48 | 48 mL |
| DNA digestion buffer | Zymo Research | E1010-1-4 | 4 mL |
| RNA pre-wash buffer | Zymo Research | R1020-2-25 | 25 mL |
| Ultraviolet ozone analyzer | Teledyne API | Model T400 | http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 |
| Mass flow controllers | Sierra Instruments Inc | Flobox 951/954 | http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html |
Riferimenti
- Rebane, A., Akdis, C. A. MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).
- Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. How do microRNAs regulate gene expression?. Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).
- Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases. Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).
- Sessa, R., Hata, A. Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases. Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).
- Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation. Biology of Sex Differences. 9 (1), 18 (2018).
- Aris, R. M., et al. Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy. American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
- Krämer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis. Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. In vitro exposure of proteins to ozone. Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression. Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).
- Smyth, G. K., et al. Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User’s Guide. Bioconductor. , (2002).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538 (2012).
- Alves, M. G., et al. Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology. Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).
- Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Walker, S. E., Lorsch, J. RNA purification- precipitation methods. Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).
- Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).
- Smyth, G. K. Limma: linear models for microarray data. Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).
- Griffiths-Jones, S. miRBase: the microRNA sequence database. Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).
- Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets. RNA. 12 (2), 192-197 (2006).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions. Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).
- Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression. Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).
Citazione di questo articolo
Fuentes, N., Silveyra, P. Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice. J. Vis. Exp. (143), e58664, doi:10.3791/58664 (2019).