Summary

利用机器人系统对结肠小鼠样本进行处理和嵌入进行组织学分析

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

与人体标本相比, 小鼠组织处理缺乏标准化, 降低了小鼠组织病理学分析的质量。在这里, 我们提出了一个方案, 以进行组织病理学检查小鼠发炎和非炎症结肠组织, 以显示机器人系统的可行性, 通常用于处理和嵌入人体样本。

Abstract

由于对动物模型的研究, 对人类疾病的了解大大扩展。尽管如此, 对实验模型的组织病理学评价需要像人类样本一样严格。事实上, 得出可靠和准确的结论是关键的影响组织切片准备的质量。在这里, 我们描述了一种小鼠组织组织病理学分析的协议, 该协议在过程中实现了几个自动化步骤, 从最初的准备工作到小鼠样本的石蜡嵌入。通过严格的协议标准化从自动化程序减少方法变量有助于提高小鼠病理分析的整体可靠性。具体而言, 该协议描述了利用自动处理和嵌入机器人系统, 通常用于组织处理和石蜡嵌入人体样本, 以处理肠道炎症的小鼠标本。我们的结论是, 在采用标准化和自动化技术后, 小鼠组织组织病理学检查的可靠性显著提高。

Introduction

在过去的几十年里, 已经开发了几个实验模型来剖析导致人类疾病致病机制 1,2。为了评估疾病的严重程度, 研究人员必须评估治疗的效果, 并研究细胞学和组织学建筑变化或炎症的数量 3。为了在这些实验模型上进行, 需要进行详细的组织病理学分析, 通常比较小鼠和人体样本 4,5

此外, 人类样本通常由组织病理学核心设施和经验丰富的人类病理学家通过标准化的组织病理学标准和方法进行处理和评分。相反, 小鼠组织通常是固定的, 嵌入和分析的研究人员有有限的经验, 组织病理学方案。组织病理学检查的质量和可靠性始于高质量组织切片的制备。有几个因素对提高或降低最终分析的质量有重要的作用, 包括固定、宏观切片、处理、石蜡嵌入和样本67 的嵌入。

所有这些涉及操作样品的段落都会出现手动错误, 包括手工嵌入样品, 以及在较小程度上进行人工微胶卷切片和染色。目前, 用于组织学评价的小鼠组织制备的整个过程依赖于从实验室到实验室和人工的规程。本研究的目的是实施标准化的自动化协议, 以减少小鼠组织病理学检查中的错误和变异性。

据我们所知, 我们在这里描述了用于全自动组织处理和嵌入的用于小鼠组织组织学评估的第一个协议;这些通常用于病理单位的人体标本的分析。作为该方法可行性的一个实例, 分析了肠道炎症的小鼠模型, 即饮用水中反复给药的硫酸右旋酯钠 (dss) 引起的慢性结肠炎模型8 ,9。这个实验设置非常类似于人类炎症性肠病 (ibd)10 , 因为 dss 治疗的动物表现出肠道炎症的迹象, 如体重减轻, 大便松动或腹泻, 结肠缩短, 以及纤维化8,9,11。正如对人类 ibd 患者所观察到的, dss 治疗会产生复杂的疾病过程。在此背景下, 需要进行详细的组织学评估, 以了解组织结构的深刻改变。因此, 实施所述提高样品制备质量的方案可能有利于研究人员依靠对小鼠实验设置的组织学和免疫组织化学分析的解释。小鼠疾病的实验模型涉及组织结构的改变、细胞组织浸润或不同组织和器官 (肠道、大脑、肝脏、皮肤) 中的炎症, 可以使用增加的质量。组织病理学检查的样品制备。

Protocol

动物程序得到意大利卫生部的批准 (auth. 127/15, 27/13), 并遵循了欧洲肿瘤学研究所 (机构动物护理和使用委员会) 的动物护理指南 1. 重复 dss 诱导慢性结肠炎 两组分别对小鼠进行年龄和性别匹配 (治疗 dss 与对照h2o, 每个实验组至少5只小鼠分类)。 在饮用水中对治疗组进行7天的2.5% 的 dss (40 kda), 并向对照组进行水分处理。请注意:这种模式诱?…

Representative Results

在饮用水中反复给药 dss 引起的实验性慢性结肠炎是一种与人类 ibd8,9非常相似的肠道炎症小鼠模型。图 1描述了 dss 治疗的效果, 包括结肠缩短 (图 1a), 这是一个广泛使用的参数, 用于评分 dss 引起的炎症的存在, 以及包括cxcl10 在内的促炎症基因的结肠表达, tnf和mcp-1 …

Discussion

我们在准备小鼠组织的过程中使用不同的自动化步骤进行组织病理学分析。该方案旨在提供技术提示, 以提高整个过程的重现性和标准化, 从而提高最终组织病理学评价的整体质量。我们实施了制备和嵌入组织的自动化仪器和方法, 这些仪器和方法通常用于病理核心设施中, 用于人体标本的研究。

为了证明这种方法的潜在适用性, 我们选择了一种慢性小鼠肠道炎症实验设置, 称?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们感谢米兰 irccs 警察医院病理学系的技术支持和 ieo 动物设施在畜牧业方面的援助。

Materials

Absolute Ethanol anhydrous Carlo Erba 414605 reagent
Absolute ETOH Honeywell 02860-1L reagent
Aluminium Potassium Sulfate SIGMA A6435 reagent
Aniline Blue SIGMA 415049 reagent
carbol Fuchsin SIGMA C4165 reagent
CD11b (clone M1/70) TONBO biosciences 35-0112-U100 antibody
CD20 IHC (clone SA275A11) Biolegend 150403 antibody
CD3 (17A2) TONBO biosciences 35-0032-U100 antibody
CD4 (GK1.5) BD Biosciences 552051 antibody
CD45.2 (clone 104) BioLegend 109837 antibody
CD8 (53-6.7) BD Biosciences 553031 antibody
Citrate Buffer pH 6 10X SIGMA C9999 reagent
Dab Vector Laboratories SK-4100 reagent
DPBS 1X Microgem L0615-500 reagent
DSS TdB Consultancy DB001 reagent
EDTA SIGMA E9884 reagent
EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex Substrate DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex/HRP DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex+ Rat Linker DAKO compreso in GV80011-2
Eosin VWR 1.09844 reagent
F4/80 (clone BM8) BioLegend 123108 antibody
Formalin PanReac 2,529,311,215 reagent
glacial acetic acid SIGMA 71251 reagent
Goat-anti-Rat-HRP Agilent DAKO P0448 antibody
Haematoxylin DIAPATH C0303 reagent
LEICA Rotary microtome (RM2255) Leica RM2255 equipment
Ly6g (clone 1A8) BD Biosciences 551459 antibody
Mercury II Oxide SIGMA 203793 reagent
Omnis Clearify Clearing Agent DAKO CACLEGAL reagent
Omnis EnVision Flex TRS DAKO GV80011-2 reagent
Orange G SIGMA O3756 reagent
Paraffin Sakura 7052 reagent
Peloris LEICA equipment
Percoll SIGMA P4937 reagent
RPMI 1640 without L-Glutamine Microgem L0501-500 reagent
STS020 Leica equipment
Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette SAKURA 7022 equipment
Tissue-Tek Automated paraffin embedder Sakura equipment
Xylene J.T.Baker 8080.1000 reagent

Riferimenti

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  2. Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
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  11. Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).

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Citazione di questo articolo
Cribiù, F. M., Burrello, C., Tacchi, R., Boggio, F., Ricca, D., Caprioli, F., Ferrero, S., Facciotti, F. Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. J. Vis. Exp. (143), e58654, doi:10.3791/58654 (2019).

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