אופטימיזציה אינטרפרון-גמא ELISpot Assay מידה תגובות תא T במודל שפן לאחר החיסון

שפן הוא מודל בעלי חיים בעלי ערך להתפתחות ניסויים פרה-קליניים של חיסונים ואסטרטגיות intradermal משלוח. הפרוטוקול הנ ל מתאר את המתודולוגיה כדי למדוד את תא T אנטיגן ספציפי תגובות במודל זה מאוד רלוונטי. וזמינותו מספק ספירה ברורה של היקפי תאי-T לייצר אינטרפרון-גמא על גירוי עם פפטידים אנטיגן ספציפי. ניתן לנטר את קינטיקה של התגובה החיסונית על ידי לקיחת דמים הלא-מסוף.

אופטימיזציה הפרוטוקול ואנו לזהות היבטים קריטיים כדי להשיג תוצאות אופטימליות שימוש assay הזה. לדוגמה, היווצרות של קרישי דם בצינור אוסף תגרום שיוצרת שחזור PBMC ואת הכדאיות. שפן הדם ייקרש במהירות רבה¹⁸. זה חיוני לבצע את לקיחת הדם במהירות. Au-Birck et al. לספק מדריך מקיף דימום טכניקות ה הדגם שפן¹⁶. מאז האוסף דם דורש הרדמה כללית, מומלץ לסקור ישים נהלי של היבט זה של הליך¹⁹. דיו מרדימים שרקנים יגיב על-ידי הזזת הרגליים או ניקוד לאחר קמצוץ קצרה של הרקמה שלהם בין האצבעות שלהם. עם הציפורניים או על ידי מצמוץ אוזניהם ו הזזת שפם שלהם להעביר לאחר צובט את האוזן. העברה מיידית של הדם לתוך צינור עם נוגד קרישה, לערבב ביסודיות על ידי גלגול או היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים הוא צעד חיוני של פרוטוקול זה. עבור פרוטוקול המתואר כאן שימשו EDTA-צינורות, אין קרישה אחרים נבדקו. אנא שימו לב כי EDTA hypertonic, צינורות אידיאלי למילוי יותר מחצי מלא, ולכן גודל צינור המתאים עבור אמצעי האחסון מדגם צריך לשמש.

כאשר מבוצעת כהלכה, צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות בעקביות תוצאות כהכנה PBMC נקי. המדיום צפיפות-הדרגה חייב להיות בטמפרטורת החדר, כאשר שכבות המילוי ההדרגתי לפני צנטריפוגה, הבלמים לא צריכים לשמש שעצרת לצנטריפוגה בעת שימוש רגיל צינורות. שיפור משמעותי מבחינת המעשיות של PBMC-העיבוד היה השילוב של צפיפות צנטריפוגה מעבר צבע עם התקנים PBMC-בידוד. דבר זה מאפשר ירידה בזמן צנטריפוגה. צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות במכשירים PBMC-בידוד ותוצאות צינורות רגילים הכדאיות דומה, תא חי סופרת PBMCs מעובד, היווצרות ספוט. עצמאית של הסוג של צינור המשמש לצורך הקמת מכשול ההפרדה, הקציר המעיל באפי צריכה פעל מיד. על פני תקופה ארוכה של זמן מגע עם המדיום הדרגתיות צפיפות היא ציטוטוקסיות כדי PBMCs.

ספירה מדויקת של PBMCs קיימא חשוב זרע מספר שווה באופן עקבי של תאים לתוך הבארות assay-צלחת. צריך להיות מיושם שיטה האפליה חי/מת. במעבדה שלנו, אנו משתמשים וזמינותו trypan-כחול הדרה של התא אוטומטית על השיש.

איכות ספוט, כהגדרתו עם קצוות חדים וגבוהים בניגוד כתמים, תגרום שיפור דיוק וממשיכים עקבי ספוט, במיוחד בעת שימוש במערכת ספירה אוטומטית. בהתאם להמלצות היצרן, הבחנו אתנול טיפולי קדם של הלוחות ELISpot להיות שלב חיוני כדי להפחית את מספר המקומות רקע ולשפר את ההגדרה של המקומות. השימוש של קורא צלחת כדי תמונה ELISpot assay-הצלחות בסוף הפרוטוקול מומלץ מאוד. התמונות המקוריות של כל טוב יכול להיות בקלות וביעילות שהושג, מאוחסנים. באמצעות תוכנה ניתוח תמונה תמונות דיגיטליות גם לאפשר ניתוח אובייקטיבי וספירת ספוט בהשוואה ספירה ידנית על ידי מפעילי בודדים.

הכרח מוחלט לפיתוח וזמינותו המתוארים כאן היה הדור של מתאימים אנטי-שפן זוג נוגדן אינטרפרון-גמא. נוגדנים חד-שבטיים העכבר V-E4 ו N-G3 פותחו על ידי ליפידים-טכניקה עם B-cell שיבוטים של עכברים אשר היו חיסון עם שפן רקומביננטי-אינטרפרון-גמא-²⁰. V-E4, אשר IgG1 isotype, ו- N-G3, אשר IgG2a, מדווחים לאגד את שניהם אנטיגן רקומביננטי ומקוריות. הקצאת V-E4 וגם לכידת נוגדן biotinylated N-G3 כמו הנוגדן זיהוי הביא רגישות גבוהה של חלבון רקומביננטי וגם מקורית תוך שמירה על רקע נמוך אות בתבנית כריך-אליסה. שני נוגדנים זמינים עבור הקהילה המדעית באמצעות הסכם ייצור בראשות המעבדה של ד ר הובר שפר, מיהו מחבר שותף של פרסום זה. בקשות שהתקבלו על-ידי המעבדה של ד ר שפר ומיוצרים ואז על ידי שותף מסחרי.

אינטרפרון-גמא הוא דיווח לחוסר יציבות מאגרי או מדיה רגיל²¹. שפר et al.²⁰ דיווחו רק ירידה מתונה של קצב ההתאוששות בעת שימוש השפיל IFN-y, אשר איבד את פונקציונליות ביולוגי, בתבנית אליסה באמצעות נוגדנים V-E4 ו- N-G3. עם זאת, הגדלת זמן הדגירה של פפטיד גירוי של PBMCs מעל 18 h צריך בזהירות להיבדק.

. דובר על יתרונות השימוש PBMCs. עם זאת, וזמינותו שתואר כאן רק משקף את תגובות אנטיגן ספציפי של מחזורי תאי-T בפריפריה. הסתננות רקמת תאי-T או תאים מבודד איברים הלימפה, כגון הטחול ובלוטות הלימפה, ייתכן שיישומים מאפיינים שונים^22,23,24. אין הבדלים משמעותיים בתגובות הסלולר נצפו על השוואה של אינטרפרון-גמא כתמים של PBMCs splenocytes של שרקנים זה היו חיסון עם חיסון נגד שפעת מסוג pNP אותו¹⁴.

ב פרוטוקול זה, אנחנו תיאר שגרת החיסונים intradermal. מהווה הרציונל העיקרי עבור מזהה חיסון מכוון את צפיפות גבוהה של תאים דנדריטים נוכח העור²⁵. אנחנו ואחרים הראו כי ניתן לפלח במיוחד תאים אלה על-ידי התאמת שיטת מסירה²⁶, ניסוח²⁷או סמים-עיצוב²⁸. תאים אנטיגן מקצועיים מופעל יכול להגר לימפה המנקזים ולהפעיל את מערכת החיסון מסתגלת^29,30,31,32. תאים דנדריטים הם חיוניים אנטיגן מצגת התא-הסוג עבור הטרמה תגובות חיסוניות הסלולר פרודוקטיבי.

במחקר זה חיות היו חיסון עם פלסמיד DNA קידוד של נוקלאופרוטאין של שפעת H1N1 זן A/PuertoRico/8. העור מסירה של חיסון זה pDNA (pNP) בשילוב עם אלקטרופורציה הפגין שמעודדים אנטיגן ספציפי התגובות ההורמונאלית שרקנים³³, חמוסים ו^1,אנושיות פרימטים (NHPs)³⁴. בנוסף, חיסון זה elicited חזקים תגובות T-cell בעכברים לאחר הלידה לתוך האפידרמיס³⁵, אשר ניתן לייחס CD4 ו תאי-T CD8 על ידי גירוי עם פפטידים המייצגים epitopes ספציפיים עבור אוכלוסיות התאים אלה. החיסון pNP היה גם immunogenic לאחר הלידה הרירית כפי שמתואר על ידי הדור של התגובות ההורמונאלית ארנבונים, שרקנים, כמו גם תגובות הסלולר ו ההורמונאלית ב עכברים³⁶. לאחרונה, הקבוצה שלנו היה מסוגל להפגין את הדור של IFN-γT-תא תגובות ב הארנב לאחר הלידה התוך שרירי (נתונים שלא פורסמו).

כיום, המקומות אינטרפרון-גמא שנצפה החזיר גיניאה ELISpot לא ניתן להקצות לקבוצת משנה CD4 + או -CD8 + T-cell. במיוחד עבור העיצוב והפיתוח של טיפולים חיסוניים מיקוד על העור, זה יהיה מאוד שימושי לקבוע אם התדרים הספוט הנצפה אינטרפרון-גמא נגרמות על ידי הרחבת אחד משנה מסוימת או תגובה מאוזן של שניהם על מנת להעריך את היעילות של החיסון כדי לעורר קרוס-מצגת. ניתן יהיה להתגבר על מגבלה זו על-ידי שלילי-מיון תא CD4 או CD8 לפני זריעה התאים בצלחת או על-ידי זיהוי של MHC class II (עבור תגובות CD4) או מחלקה MHC אני (עבור תגובות CD8) מוגבלת epitopes.

וזמינותו אינטרפרון-גמא ELISpot מתואר כאן באמצעות שפן PBMCs כתובות צורך להעריך את הקורס של תגובות הסלולר במודל מעבדה שפן. זה למקד את התפתחות חיסונים, עור משלוח פרוטוקולים. אנו מאמינים שהוא מאפשר העסקתם של מודל זה בעל חיים רלוונטי ללמוד מחלות עם מרכיבים חשובים T-cell כגון שחפת³⁷, אבולה³⁸, HSV³⁹ואחרים. זה יקטין את השימוש במודלים פחות רלוונטי.