Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

Katherine Schultheis; Hubert Schaefer; Holly M. Pugh; Bryan S. Yung; Janet Oh; Jacklyn Nguyen; Laurent Humeau; Kate E. Broderick; Trevor R.F. Smith

doi:10.3791/58595

JoVE Journal > Immunology and Infection

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Immunologia e infezioni

Optimierte Interferon-Gamma ELISpot Assay zur Maßnahme T-Zell-Antworten im Meerschweinchen-Modell nach der Impfung

Published: January 20, 2019

doi:

10.3791/58595

Katherine Schultheis¹, Hubert Schaefer², Holly M. Pugh¹, Bryan S. Yung¹, Janet Oh¹, Jacklyn Nguyen¹, Laurent Humeau¹, Kate E. Broderick¹, Trevor R.F. Smith¹

¹Inovio Pharmaceuticals, Inc, ²Mycotic and Parasitic Agents and Mycobacteria,Robert Koch Institute

Summary

Die Entwicklung der Interferon-Gamma ELISpot Assay für Meerschweinchen PBMCs ermöglicht die Charakterisierung der T-Zell-Reaktionen in diesem hochaktuellen Modell für die Untersuchung von Infektionskrankheiten. Wir haben den Test zur Messung der T-Zell-Antworten intradermale Bereitstellung von DNA-Impfstoffen angewandt.

Abstract

Das Meerschweinchen hat eine Schlüsselrolle als eine relevante kleine Tiermodell in der Entwicklung von Impfstoffen gegen Infektionskrankheiten wie Tuberkulose, Diphtherie, Grippe und virale hämorrhagische Fieber gespielt. Wir haben bewiesen, dass Plasmid-DNA (pDNA) Impfstoff-Lieferung in die Haut robuste humorale Reaktionen in das Meerschweinchen entlockt. Jedoch war die Verwendung dieses Tieres, Modell Immunantworten etwas begrenzt, in der Vergangenheit wegen Mangel an verfügbaren Reagenzien und Protokolle, T-Zell-Reaktionen zu studieren. T-Zellen spielen eine Schlüsselrolle bei immunprophylaktische und immunotherapeutic Mechanismen. T-Zell-Reaktionen zu verstehen ist entscheidend für die Entwicklung von Infektionskrankheiten und Onkologie Impfstoffen und zuvorkommend Applikationshilfen. Hier beschreiben wir einen Interferon-Gamma (IFN-γ) Enzym-linked Immunospot (ELISpot) Assay für Meerschweinchen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs). Der Test ermöglicht Forschern Impfstoff-spezifische T-Zell-Reaktionen in diesem wichtigen Nagetier Modell zu charakterisieren. Die Fähigkeit, Zellen isoliert aus dem peripheren Blut Test bietet die Möglichkeit, Immunogenität bei einzelnen Tieren zu verfolgen.

Introduction

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Erkennung von Interferon-Gamma (IFN-γ) insulinproduzierenden Zellen nach Antigen Rückruf in einer peripheren mononukleären Zellen (PBMC) Bevölkerung geerntet von Hartley Meerschweinchen. Wir haben die Probe zur Charakterisierung der Kinetik und Größen der Antigen-spezifische T-Zell-Reaktionen auf eine Influenza-Impfung-Therapie in das Meerschweinchen angewandt. Wir glauben, dass dieses Protokoll deutlich die präklinische Entwicklung von Impfprogrammen in diesem hochaktuellen Tiermodell treiben.

T-Zellen, hervorgerufen durch Impfstoffe spielen eine wesentliche Rolle beim Schutz gegen Krankheitserreger und immunotherapeutic Wege mit anderen Krankheiten verbunden. Die Bedeutung der T-Zellen wurde in mehreren Impfstoff-Studien unterstrichen. Impfung von Frettchen und Mäuse mit einem Plasmid-DNA (pDNA) Codierung für H5 Hämagglutinin und N1-Neuraminidase zur Verfügung gestellt-Schutz von Morbidität und Mortalität in eine Grippe-Virus-Herausforderung in der Abwesenheit von neutralisierenden Antikörpern, was die Bedeutung von T-Zell-Immunität-¹. Zusätzlich zu starken neutralisierenden humoralen Antwort, T-Zellen spielen eine entscheidende Rolle für nicht nur virale Clearance² , sondern auch Schutz vor Ansteckung mit respiratory syncytial Virus (RSV) in Mäuse³. Beim Menschen wurden bereits vorhandene CD8 + T-Zellen während der H1N1-Pandemie 2009⁴verringerte Krankheitschwierigkeit zugeordnet. CD4 + T Zelle zählt zusammen mit bestimmten Zytokin-Plasmakonzentration korrelieren mit Krankheitschwierigkeit RSV-infizierte Kinder⁵.

Das Meerschweinchen hat Bedeutung als einem Labormodell für Forschung und Entwicklung in verschiedenen Bereichen der Medizin wie Haut Sensibilisierung, Ernährungsforschung, Studien des auditorischen Systems und relevantesten für diese Arbeit, Infektionskrankheiten gewonnen. Es war entscheidend für die Entdeckung von Impfstoffen gegen Tuberkulose und Diphtherie. Vor kurzem ist das Meerschweinchen als Modell für Influenza⁶ und Ebola-⁷verwendet. Darüber hinaus bietet das Meerschweinchen physiologischen Ähnlichkeiten mit der menschlichen Haut⁸besitzen, zugänglich kleinen Tiermodell für dermal Medikament Lieferarten. Im Gegensatz zu seiner Bedeutung als einem Labormodell bleibt die Verfügbarkeit von bestimmten Assays Meerschweinchen und Sonden zu charakterisieren Immunantworten begrenzt⁹. Grundlegende zelluläre Assays wie der IFN-γ Enzym-linked Immunospot (ELISpot-Assay), die routinemäßig in der präklinischen und klinischen Forschung verwendet wird, um die T-Zell-Antworten aufgelistet wurden nicht zur Verfügung.

Die ersten Festphasen-Enzym-linked Immunospot Assays wurden verwendet, um die Anzahl der spezifischen Antikörper-sezernierenden Zellen in einem unterschiedlichen B-Zellpopulation¹⁰^,¹¹bestimmen. Das Format hat avancierte zum erkennen Zellen sezernieren Zytokine einschließlich IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, GM-CSF, TNF-Alpha, TNF-Beta, Granzym B und IFN-γ. Der ELISpot Assay besitzt hohen Empfindlichkeit; potenziell kann jede Zytokin-produzierenden Zelle erkannt werden. Nachweisgrenze für ELISpot Assays wurde niedriger als 10 Plätze pro 100.000 PBMCs¹²berichtet. Vor kurzem wurde ein Meerschweinchen IFN-γ spezifische Antikörper paar verfügbar¹³, und dies eröffnet die Möglichkeit, diesen Mangel im Bereich zu beheben.

IFN-γ gilt als ein wichtiger Effektor-Molekül in der adaptiven Immunantwort; Es werden produziert und CD4 und CD8 T-Zellen nach Aktivierung sezerniert. IFN-γ hat eine breite Palette von biologischen Funktionen im Rahmen einer Immunantwort auf eine Virus-Infektion, wie die Aktivierung von Makrophagen und die neuesten Regulierung der großen Histocompatibility complex (MHC) ich und ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG Ausdruck. Auch B-Zell-Differenzierung fördert, hemmt Wachstum von T-Helfer-2-Zellen und natürliche Killerzellen aktiviert. IFN-γ blockiert Virusreplikation in infizierte Körperzellen und reguliert Expression von MHC-Moleküle. Die Produktion von IFN-γ ist somit ein sehr wichtiges Indiz für die Qualität der T-Zell-Reaktion auf einen Impfstoff oder Erreger.

Ein wichtiger Aspekt der hier vorgestellten IFN-γ ELISpot ist die Verwendung von PBMCs anstatt Splenocyten¹³. PBMCs erhalten Sie durch die Verarbeitung einer nichtterminal gesammelten Blutprobe, die Sammlung von Splenocyten Tier Euthanization vor der Ernte der Milz erfordert. Die Verwendung von PBMCs ermöglicht IFN-γ T-Zell-Reaktionen über einen bestimmten Zeitraum hinweg und Bewertung der Auswirkungen auf die T-Zell-Reaktionen wie Prime-Boost Regimen¹⁴überwacht werden.

Für Forscher, die gerade das Meerschweinchen als Tiermodell verwendest, wird die IFN-γ ELISpot-Methode der wissenschaftlichen Daten erweitern, die sie gewinnen können. Seine Verfügbarkeit kann nun reduzieren die Notwendigkeit zur Durchführung von Studien mit weniger relevanten Tiermodellen für die Ziel-Krankheit, die zuvor aufgrund der Verfügbarkeit von Reagenz zur Untersuchung der zellulären Antworten ausgewählt wurden. Die Verwendung von PBMCs anstatt Milz oder Lymphknoten ermöglicht nichtterminal Experimente und kontinuierliche Überwachung einzelner Tiere.

Im folgenden stellen wir eine detaillierte Beschreibung der Arbeitsschritte bei der Erkennung einer IFN-γ zelluläre Antwort bei Meerschweinchen auf pDNA Impfstoff. Wir erläutern unsere spezifischen Lieferverfahren und beschreiben der allgemeinen ELISpot Assay umfasst die Blutabnahme, Blut Verarbeitung PBMC Ernte, Testverfahren und Datenanalyse. Eine schematische Darstellung des ELISpot Assay ist in Abbildung 1dargestellt.

Abbildung 1 : Schematische Übersicht des Meerschweinchens ELISpot Protokoll. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden von Animal Care und Nutzung Ausschuss (ACUC) von Acculab genehmigt. Hinweis: Das Protokoll erfordert die Verwendung von möglichen gefährlichen Materialien. Bitte lesen Sie des Herstellers Muskel-und Skeletterkrankungen und tragen Sie richtigen persönliche Ausrüstung (PSA) während des Verfahrens zu. 1. Vorbereitung der Meerschweinchen Immunisierung Website, intradermale Mantoux-Einspritzung und CELLECTRA-3P-EP-Verfahren Vorbereitung des Standortes Behandlung auf das Meerschweinchen. Meerschweinchen in einer Kammer Induktion und betäuben mit 5 % Isofluran-Dampf. Entfernen Sie Tier aus der Kammer zu und Prüfkopf in Position, Bereitstellung von 2 % Isofluran Dampf um Anästhesie während des Verfahrens zu erhalten. Fläche von ca. 4 cm2 auf Abdominal-Flanke zu rasieren. Desinfizieren Sie rasierten Bereich mit Ethanol-Tupfer. Injektion von pDNA-Formulierung und Elektroporation Verfahren. Verwenden Sie eine Insulin-Spritze 100 µl Formulierung in die Dermis von der Mantoux-Technik zu injizieren. Nadel eingeführt Abschrägung oben in einem Winkel von 10 Grad mit Körper des Tieres. Entfernen Sie die Nadel und sofort legen Sie die CELLECTRA® – 3P-Elektroden-Array über die Injektion-Quaddel und elektrisches Feld. Tier aus der Narkose zu entfernen und seine Genesung zu überwachen. 2. nicht-Terminal bluten Blutentnahme aus Halsschlagader narkotisierter Meerschweinchen. Meerschweinchen in einer Kammer Induktion und betäuben Sie Tier zu, wie beschrieben in 1.1.1 Mit einer 3 ml Spritze mit einer Nadel 27 1/2 Zoll, unterstreichen Sie die Halsschlagader der narkotisierter Tiere und sammeln Sie 3 ml Blut. Übertragen Sie sofort Blut in K2EDTA Blutsammelröhrchen, invertieren Sie Rohr mehrmals Blut mit Antigerinnungsmittel und Platz auf dem Eis zu mischen.Hinweis: Vermeidung der Blutgerinnung ist entscheidend für erfolgreiche Weiterverarbeitung der Blutprobe. Überwachen des Tieres Erholung. 3. Blut Probenverarbeitung Trennung der PBMCs von Vollblut durch Dichtegradienten Zentrifugation Verdünnen Sie 1:1 mit Hank es ausgewogen Salz Lösung (HBSS) Blut.Hinweis: Um Kontaminationen zu vermeiden, alle von hier aus arbeiten, sollten in einem Biosafety Schrank Anwendung aseptischen Technik durchgeführt werden. Schicht verdünnt Blut allmählich über 4,5 ml Ficoll-Paque Plus in einem 15 ml konische Röhrchen. Vermeiden Sie Störungen der Schnittstelle. Hinweis: Um ordnungsgemäße Trennung zu gewährleisten, muss Ficoll-Paque Raumtemperatur haben. Zentrifugieren Sie Rohre bei 800 Rcf für 30 min mit Bremse ab.Hinweis: als Alternative SepMate™ Röhren (STAMMZELL-Technologie) für PBMC-Trennung verwendet werden kann. HBSS verdünnt Blut wird hinzugefügt, um 15 ml SepMate Rohr gefüllt mit 3,5 ml Ficoll-Paque Plus und dann zentrifugiert bei 1200 Rcf für 10 min (Bremse). Diese Steigung Zentrifugierung zeitsparende Technik führt zu gleicher Tragfähigkeit, Zellausbeute und Spot-Formation. Buffy-Coat-Schicht zu ernten und in R10 Medium verdünnt (10 % (V/V) Hitze-deaktiviert FBS und 1 % (V/V) Pen/Strep in RPMI1640 Medium) auf ein Gesamtvolumen von 15 ml. Pellet-Zellen durch Zentrifugieren bei 450 Rcf für 5 Minuten. Waschen Sie Zellen zweimal mit R10 Medium. Auszusetzen Sie Zellen in 1 ml R10 wieder und weitergeben Sie Zellsuspension durch 70 µm Zelle-Sieb in einen neuen Schlauch. Zellen zu zählen und Anzahl von lebenden Zellen durch Trypan blau-Färbung bestimmen. Verdünnen Sie Zellen mit R10 Medium zu einer Konzentration von 1 x 10 ^ 6 lebenden Zellen pro ml. 4. Vorbereitung der ELISpot-Platten und Zellstimulation Mantel und Block Brunnen einer 96-Well-ELISpot PVDF-Membran-Platte vor der Aussaat der PBMCs. Platten sollten für 60 Sekunden vorbehandelt werden. Ethanol-Vorbehandlung führt zu weniger unspezifische Spot-Formation und Flecken mit verbesserte Definition.Hinweis: Seien Sie besonders vorsichtig, um sicherzustellen, die komplette Membran kommt in Kontakt mit 15 µl 35 % Ethanol. Nach 60 Sekunden fügen Sie 150 µl 1 X PBS pro Bohrloch hinzu, und leeren Sie Quellen durch Umdrehen der Platten.Hinweis: Die Vorbehandlung von Ethanol ist sehr zeitkritisch. Inkubieren Sie die gut-Membrane länger als 60 Sekunden Membranen nicht während der folgenden Schritte des Verfahrens trocknen müssen nicht. Waschen Sie Platten dreimal mit 250 µl 1 X PBS pro Bohrloch. Mantel mit 100 µl/Well von 5 µg/ml Anti-Meerschweinchen-Capture IFN-γ Antikörper V-E4 mit PBS-Puffer. Inkubieren Sie Platten für mindestens 12 Stunden bei 4° C. Waschen Sie Platten durch Zugabe von 250 µl/Well PBS dreimal. Fügen Sie 200 µl/Well blockierende Puffer (10 % (w/V) Saccharose und 2 % (w/V) BSA mit PBS-Puffer) und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie Platten mit 250 µl/Well PBS dreimal. Platte PBMCs mit Antigen-spezifische Peptide, positive und negative Kontrollen. Protein-Peptid-Pool in R10 zum gewünschten endgültigen Peptid-Konzentration zu verdünnen. Die Probe PBMCs in Triplicates Assay.Hinweis: Medium mit Stimulanzien zu ELISpot-Platten zuerst und Hinzufügen der PBMC Suspension zweiter. Angegebenen Brunnen 50 µl der Peptid-R10 Medium hinzufügen. Fügen Sie für negative Kontrolle 50 µl leer Peptid Formulierung in R10 in angegebenen Vertiefungen hinzu. Fügen Sie für Positivkontrolle 5 µg/ml Concanavalin A (ConA hinzu) in R10 Medium in angegebenen Quellen. Alle Brunnen 100 µl Zellsuspension PBMC hinzufügen Inkubieren Sie Platten in befeuchtete 5 % CO2-Atmosphäre bei 37° Celsius für 18 Stunden.Hinweis: Statt ELISpot Platten auf einem sogar Oberfläche/Rack im Inkubator und vermeiden Sie jede Störung der Platten während der Inkubationszeit. 5. Erkennung der Interferon-Gamma positive spots Inkubation mit Abfragung Antikörper und Platte Entwicklung.Hinweis: Für alle Schritte in diesem Abschnitt ist keine aseptische Technik erforderlich. Entfernen Sie Platten aus Inkubator sorgfältig und leeren Sie sicher Brunnen. Waschen Sie Platten durch Zugabe von 250 µl/Well PBS dreimal. Fügen Sie 100 µl/Well von 2 µg/ml biotinylierte Anti-Meerschweinchen IFN-γ Detektionsantikörper, die N-G3 verdünnt in blocking-Puffer.Hinweis: Filter (22 µm) Antikörperlösung Hintergrund reduzieren. Inkubieren mit Detektionsantikörper für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Überstand und waschen Platten durch Zugabe von 250 µl/Well PBS dreimal zu verwerfen. Hinzufügen von 100 µl/Well der alkalischen Phosphatase (ALP)-konjugierten Streptavidin in blocking-Puffer verdünnt.Hinweis: Filter (22 µm) Lösung, Hintergrund zu reduzieren. Mit ALP-Streptavidin-Konjugat für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Verwerfen Sie ALP-Streptavidin Lösung zu und waschen Sie Platten durch Zugabe von 250 µl/Well PBS zweimal, und entfernen Sie überschüssige PBS durch Umdrehen der Plattenrandes und es gegen ein sauberes Papiertuch abtupfen. Waschen Sie Platten durch Zugabe von 250 µl/Well DI UltraPure Wasser einmal zu, und entfernen Sie überschüssiges Wasser durch die Platte umdrehen und gegen ein sauberes Papiertuch abtupfen. Fügen Sie 100 µl Substratlösung BCIP/NBT (Vorsicht) in jede Vertiefung. Achtung: BCIP/NBT ist leicht entzündlich und giftig, wenn, Berührung mit der Haut Verschlucken, oder eingeatmet. Finden Sie vor der Verwendung in der MSDS. Inkubieren Sie für 20 min bei Raumtemperatur vor Licht geschützt werden. Spülen Sie die Platte 4 Mal mit entionisiertem Wasser. Invertieren Sie Platte zu und tippen Sie, um überschüssiges Wasser zu entfernen. Unterseite des ELISpot-Platten entnehmen Sie aus Kunststoff Entwässerung und Platten Sie die trocken. Quantifizieren Sie Flecken, manuell oder mithilfe eines automatisierten ELISpot Leser, zum Beispiel dem CTL-Immunospot S6 Platte Leser.

Representative Results

Die hier vorgestellten Ergebnisse dienen als Referenz für die erwarteten Ergebnisse nach der Anwendung dieses Protokolls, betonend, wie wichtig die entscheidenden Schritte und bestätigen die Vorteile der beschriebenen Optimierungen. Nach Dichtegradienten Zentrifugation wird wie unter Schritt 3.1 des Protokolls, der roten viskose Flüssigkeit am Boden des Röhrchens ein Großteil der roten Blutkörperchen enthalten. Wie in Abbildung 2dargestellt istA, über die roten Blutkörperchen eine Schicht des Mediums Dichte. Zwischen einer Schicht klares oder gelbes Plasma an der Spitze und die Dichte ist gradient Medium der weißen oder hellen Braun buffy Coat-Schicht, die ein Großteil der weißen Blutkörperchen und Blutplättchen enthält. Unvollständige Trennung würde als das Vorhandensein von roten Blutkörperchen auf das Dichte-Gradienten-Medium manifestieren. Die rote Färbung des Plasmas in Abbildung 2A ist höchstwahrscheinlich durch Hämolyse, wie diese Blutprobe in dem Sammelrohr 1,5 h vor der Verarbeitung gespeichert wurde. Abbildung 2 B zeigt die Steigung vor (links) und nach (rechts) Zentrifugation in PBMC-Isolation Gerät. Blutprobe in Abbildung 2B wurde nach Blutentnahme und die Plasma-Färbung ist gelb mit minimaler Verzögerung verarbeitet. Die Wirkung von Vornässen der Membranen mit Ethanol (siehe Punkt 4.1 des Protokolls) auf Spot-Entwicklung ist in Abbildung 3dargestellt. Flecken in vorbehandelten Brunnen zeigen verbesserte Definition, und es gibt eine Verringerung der Zahl der Plätze in Medium/DMSO-negativen Kontroll-Vertiefungen(Abbildung 3). Typische Lebensfähigkeit der verarbeiteten Meerschweinchen PBMCs reicht rund 90 % und ist ähnlich wie beim regulären 15 mL-Tuben und PBMC-Isolierung Geräte (Abbildung 3B). Ertrag der lebensfähigen Zellen aus einer Blutprobe 3 mL beträgt in der Regel zwischen 3 x 106 und 5 x 106. Tiere wurden geimpft mit Plasmid DNA Kodierung Nucleoprotein (NP) der H1N1-Influenza-Stamm A/PuertoRico8. Abbildung 4 zeigt Aufzählung der T-Zellen IFN-γ Antworten vorgestellt wie Spot-bildenden Einheiten (SFU) über die Dauer der Therapie eine Impfung erzeugt. ELISpot Assay mit PBMCs von nicht immunisierten Tiere Ergebnisse in vernachlässigbar vor Ort zählt (keine tx) geerntet. Vierzehn Tage nach der ersten Impfung (Prime), durchschnittlich 970 IFN-γ-Spots pro million PBMCs wurden gezählt, nach der immunogenen Stimulation. Sieben Tage nach der zweiten Impfung (Boost), wurden T-Zell-Reaktionen gegen alle drei Pools erweitert und erreichte einen Durchschnitt von 5020 IFN-γ SFUs/106 PBMCs. 46 Tage nach der zweiten Impfung (Speicher), eine durchschnittliche insgesamt 6310 IFN-γ SFUs/10, 6 PBMCs wurden im peripheren Blut gezählt. ABBILDUNG LEGENDEN: Abbildung 2 : Repräsentative Bilder der Schichten nach Dichtegradienten Zentrifugation. (A) Blut Probe vor (links) und nach (rechts) Zentrifugation in regelmäßigen Röhren. (B) Blut Probe vor (links) und nach (rechts) Zentrifugation in PBMC-Isolierung Geräte. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3 : Optimierung des Protokolls. (A) typische Auftreten von IFN-γ positive Flecken in einem ELISpot Assay Platte gut entwickelt, nach dem Protokoll. Dreifacher Brunnen Beispiel gezeigt nach Vorbehandlung mit Ethanol (rechts) oder ohne Vorbehandlung (links). Zellen inkubiert wurden über Nacht entweder mit DMSO (oben) als keine-Reiz-Steuerelement Antigen abgestimmt Peptide (Mitte) oder die Mitogen ConA (unten). PBMCs stammt aus dem gleichen Einzeltier. Brunnen wurden mit Hilfe einer automatisierten Plattenscanner abgebildet. (B) Vergleich der unterschiedlichen Dichtegradienten Röhren auf verarbeitete Zellen. 3 mL Blutproben aus 3 einzelnen Meerschweinchen wurden gesammelt. 1,5 mL jeder Probe wurden mit regelmäßigen Röhren (Dichte-Gradienten-Mittel) oder PBMC-Isolierung Geräte verarbeitet. Tragfähigkeit (links, % ± SEM) und Anzahl von lebenden Zellen (rechts, x 106 ± SEM) wurden über eine automatische Zelle zählen System und Trypan blau Ausgrenzung Assay ermittelt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4 : Erkennung von robust zellulären Immunantworten im Laufe einer Impfung Therapie. An den Tagen 1 und 15 wurde 30 µg der pDNA Codierung Influenza A Nucleoprotein (NP) Dermal Intra abdominale Flanke von Hartley Meerschweinchen unmittelbar gefolgt von Haut-Elektroporation geliefert. IFN-γ ELISpot Reaktion wurde nach der zweiten Impfung 14 Tage nach der ersten Impfung (Prime) und 7 Tage (Boost) und 46 Tage (Speicher) gemessen. Mittlere SFUs + SEM wurden für 5 behandelten Meerschweinchen und 2 unbehandelte Meerschweinchen (keine tx) aufgetragen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Das Meerschweinchen ist eine wertvolle Tiermodell für die präklinische Entwicklung von Impfstoffen und intradermale Bereitstellungsstrategien. Das obige Protokoll beschreibt die Methodik zur Messung der Antigen-spezifische T-Zell-Antworten in diesem hochaktuellen Modell. Der Test bietet eine klare Aufzählung der peripheren T-Zellen produzieren Interferon-Gamma nach Stimulation mit Antigen-spezifische Peptide. Die Kinetik der Immunantwort kann durch nicht-terminalen Blutentnahmen überwacht werden.

Wir das Protokoll optimiert und identifiziert kritische Aspekte, um optimale Ergebnisse mit diesem Test zu erhalten. Beispielsweise führt die Bildung von Blutgerinnseln in den Sammelröhrchen suboptimalen PBMC Erholung und Lebensfähigkeit. Guinea Pig Blut gerinnt sehr schnell¹⁸. Es ist entscheidend für die Blutentnahme schnell durchführen. Au-Birck Et Al. liefern einen umfassenden Leitfaden für Blutungen Techniken in den Meerschweinchen Modell¹⁶. Da die Blutentnahme Vollnarkose erforderlich ist, empfiehlt es sich, die geltenden Standardarbeitsanweisungen dieses Aspekts des Verfahrens¹⁹überprüfen. Nicht ausreichend betäubt Meerschweinchen reagieren durch bewegen ihre Beine oder Vokalisation nach einer kurzen Prise das Gewebe zwischen ihre Zehen mit den Fingernägeln oder durch ihre Ohren zucken und bewegen ihre Schnurrhaare nach vorne, nach ihrem Ohr kneifen. Die Sofortüberweisung des Blutes in ein Röhrchen mit Antikoagulanzien und Mischung gründlich durch Walzen oder Umkehrung der Röhre mehrere Male ist ein wesentlicher Schritt in diesem Protokoll. Für das hier beschriebene Protokoll EDTA-Röhrchen verwendet wurden, und keine andere Antikoagulantien getestet. Bitte beachten Sie, dass EDTA Hypertone, Rohre sollten im Idealfall gefüllt werden mehr als halb voll, und daher die geeignete Schlauchgröße für das Probenvolumen verwendet werden muss.

Wenn richtig durchgeführt, ergibt Dichte-Gradienten-Zentrifugierung konsequent saubere PBMC Vorbereitung. Dichtegradient Medium muss bei Zimmertemperatur sein, wenn die Steigung vor Zentrifugation Schichtung und Bremsen sollte nicht zum Anhalten der Zentrifuge bei normalen Röhren verwendet werden. Eine deutliche Verbesserung in Bezug auf die Praktikabilität der PBMC-Verarbeitung war die Kombination von Dichte Gradienten Zentrifugation mit PBMC-Isolierung Geräte. Dies ermöglicht eine Verkürzung Zentrifugation. Dichte Gradienten Zentrifugation in PBMC-Isolierung Geräte und regelmäßige Röhren Ergebnisse in ähnlichen Lebensfähigkeit, zählt live Zelle verarbeiteten PBMCs und Fleckenbildung. Unabhängig von der Art des Rohres für die Trennung verwendet, sollte die buffy Coat Ernte unmittelbar folgen. Über einen längeren Zeitraum hinweg ist Kontakt mit dem Dichte-Gradienten-Medium auf die PBMCs zytotoxischen.

Genaue Zählung der lebensfähigen PBMCs unbedingt Samen konsequent paritätisch von Zellen in die Vertiefungen der Assay-Platte. Eine Methode der lebenden/Toten Diskriminierung anzuwenden. In unserem Labor verwenden wir die Trypan blau-Ausschluss-Assay und eine automatisierte Zelle-Zähler.

Spot Qualität, definiert als scharfkantige und hohen kontrastreichen Flecken, führt zu verbesserter Genauigkeit und konsequent vor Ort zählen, insbesondere bei Verwendung eines automatisierten Zählsystem. Im Einklang mit den Empfehlungen des Herstellers beobachteten wir Ethanol Vorbehandlungen der ELISpot Platten werden ein entscheidender Schritt, reduzieren Sie die Anzahl der Hintergrund-Spots und die Definition der Spots zu verbessern. Die Verwendung eines Lesers Platte zum Bild der ELISpot Assay-Platten am Ende des Protokolls wird dringend empfohlen. Originale Bilder von jedem Bohrloch können einfach und effizient abgerufen und gespeichert werden. Mit Hilfe einer Bildanalyse-Software, die digitale Bilder auch für objektive Analyse und vor Ort zählen im Vergleich zu manuellen Zählung von einzelnen Betreibern ermöglichen.

Eine absolute Notwendigkeit für die Entwicklung des hier beschriebenen Tests war die Generation von einem geeigneten Anti-Meerschweinchen Interferon-Gamma-Antikörper-paar. Maus monoklonale Antikörper V-E4 und N-G3 wurden durch Hybridom-Technik mit B-Zell-Klonen von Mäusen entwickelt, die mit rekombinanten Meerschweinchen Interferon Gamma²⁰immunisiert wurden. V-E4, die IgG1 Isotype, und N-G3, die IgG2a ist, berichtet, sowohl für die rekombinanten und nativen Antigen binden. Zuweisen von V-E4 als Capture-Antikörper und biotinylierte N-G3, wie hohe Empfindlichkeit für rekombinanten und nativen Protein den Detektionsantikörper führte, unter Beibehaltung der niedrigen Hintergrundsignal in einem Sandwich-ELISA-Format. Beide Antikörper stehen der wissenschaftlichen Gemeinschaft durch eine Produktion Vereinbarung unter der Leitung von Labor von Dr. Hubert Schaefer, der Co-Autor dieser Publikation ist. Anfragen werden von Dr. Schaefer Lab empfangen und dann von einem Handelspartner hergestellt.

Interferon-Gamma wird berichtet, dass in regelmäßigen Puffer oder Medien²¹instabil werden. Schaefer Et Al.²⁰ berichtet nur einen moderaten Rückgang der Wiederfindungsrate bei der Verwendung von IFN-y, degradiert die biologischen Funktionen in einem ELISA-Format mit Antikörpern V-E4 und N-G3 verloren hatten. Allerdings sollte die Erhöhung der Inkubationszeit von Peptid-Stimulation der PBMCs über 18 h sorgfältig getestet werden.

Die Vorteile der Verwendung von PBMCs diskutiert worden. Der hier beschriebene Test spiegelt jedoch nur Antigen-spezifische Reaktionen des zirkulierenden T-Zellen in der Peripherie. Gewebe infiltrieren T-Zellen oder Zellen isoliert von lymphatischen Organe, wie Milz und Lymphknoten, können unterschiedliche Eigenschaften²²^,²³^,²⁴aufweisen. Keine signifikanten Unterschiede in den zellulären Antworten wurden beobachtet, beim Vergleich der Interferon-Gamma-Spots von PBMCs und Splenocyten von Meerschweinchen, die mit dem gleichen pNP Influenza-Impfstoff¹⁴immunisiert wurden.

In diesem Protokoll haben wir eine intrakutane Impfung Verfahren beschrieben. Eine wesentliche Begründung für ID Immunisierung zielt auf die hohe Dichte der dendritischen Zellen in der Haut²⁵. Wir und andere haben gezeigt, dass diese Zellen gezielt können durch Anpassung der Liefermethode²⁶, Formulierung²⁷oder Wirkstoffdesign²⁸. Aktivierte professionellen Antigen-präsentierenden Zellen können zu einer drainierenden Lymphknoten migrieren und aktivieren des adaptiven Immunsystems²⁹^,³⁰^,³¹^,³². Dendritische Zellen sind die wesentlichen Antigen-Präsentation Zelltyp für produktive zelluläre Immunantworten grundieren.

Für diese Studie, die Tiere mit Plasmid DNA Kodierung der Nucleoprotein der Influenza H1N1 geimpft wurden Stamm A/PuertoRico/8. Haut Auslieferung des Impfstoffes pDNA (pNP) in Kombination mit Elektroporation war gezeigt worden, um Antigen-spezifische humorale Reaktionen in Meerschweinchen³³, Frettchen und nicht-menschlichen Primaten (NHP)¹^,³⁴hervorrufen. Darüber hinaus löste dieser Impfstoff robuste T-Zell-Reaktionen bei Mäusen nach der Geburt in die Epidermis,³⁵, die auf CD4 und CD8 T-Zellen zurückzuführen sein könnten, durch die Stimulierung mit Peptiden, spezifische Epitope für diese Zellpopulationen darstellt. Die pNP-Impfstoff war auch immunogen Schleimhaut im Auslieferzustand humorale Reaktionen bei Kaninchen und Meerschweinchen sowie zelluläre und humorale Reaktionen in Mäusen³⁶-Generation beweist. Zuletzt war unsere Gruppe die Generation der IFN-γT-Zell-Reaktionen bei Kaninchen nach der intramuskulären Lieferung (unveröffentlichte Daten) nachweisen.

Derzeit werden nicht die beobachteten Interferon-Gamma-Spots in das Meerschweinchen ELISpot eine CD4 + oder CD8 + T-Zell-Untergruppe zugeordnet. Vor allem für die Gestaltung und Entwicklung von Immuntherapien Ausrichtung auf die Haut wäre es sehr nützlich, um festzustellen, ob vor Ort beobachteten Interferon-Gamma-Frequenzen durch Ausbau einer bestimmten Teilmenge oder eine ausgewogene Antwort der beiden zur verursacht werden die Wirksamkeit der Impfung, Kreuz-Präsentation auszulösen. Diese Einschränkung überwunden werden könnte, durch Negative Zellsortierung für CD4 oder CD8 vor der Aussaat der Zellen auf dem Teller oder durch Identifizierung von MHC-Klasse II (CD4 Antworten) oder MHC Klasse I (für CD8 Antworten) Epitope eingeschränkt.

Die hier beschriebenen Interferon-Gamma-ELISpot Assay mit Meerschweinchen PBMCs richtet sich die Notwendigkeit, den Verlauf der zellulären Reaktionen in den Meerschweinchen Labormodell zu beurteilen. Dies wird die Entwicklung von Impfstoffen zu verfeinern und Haut Übermittlungsprotokolle. Wir glauben, dass es für die Beschäftigung von diesem relevanten Tiermodell erlaubt, um Krankheiten mit wichtige T-Zell-Komponenten wie TB³⁷, Ebola-³⁸und HSV³⁹zu studieren. Es verringert die Verwendung von weniger relevanten Tiermodellen.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten die Mitglieder der Inovio Pharmaceuticals R & D-Abteilung für technische Hilfe und Mitarbeiter von Acculab für Exzellenz Tierhaltung Service danken. Insbesondere möchten wir danken für das Manuskript Korrektur Alysha Vu und Joe Agnes. Diese Arbeit wurde nicht von bestimmten Einräumung von Fördereinrichtungen in den öffentlichen, kommerziellen oder Non-Profit-Sektor finanziert.

Materials

Cellectra-3P	Inovio Pharmaceuticals		ID-Electroporatio device/ non-commercial, R&D-only
K₂EDTA blood collection tube	BD	367844
Hank’s Balanced Salt Solution	Gibco	14175-079
Ficoll-Paque Plus	GE Healthacre	17144003	density gradient medium
SepMate tube	STEMCELL Technologies	85415	PBMC-isolation device
RPMI	Thermo Fisher	11875-135
heat-deactivated FBS	VWR	97068-085
Pen/Strep	Gibco	15140-122
β-Mercaptoethanol	Gibco	21985-023
96-well ELISpot PVDF-membrane	Millipore	MSIPS4W10	ELISpot assay plate
Ethanol	Sigma	459844-1L
UPDI	Invitrogen	10977-015	Ultra-Pure DI water
Sucrose	Sigma	S7903
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
10x PBS	HyClone	SH30378.03
Concanavalin A (ConA)	Sigma	C5275-5MG
alkaline phosphatase (ALP)-conjugated streptavidin	R&D Systems Inc.	SEL002
BCIP/NBT	R&D Systems Inc.	SEL002
capture anti-guinea pig IFN-γ antibody V-E4	GenScript	Order #:U5472CE080-3	LOT # A217071153
biotinylated detection anti-guinea pig IFN-γ antibody N-G3	GenScript	Order #:U5472CE080-1	LOT # A21700598
CTL S6 Micro Analyzer	ImmunoSpot	#S6MIC12	automated ELISpot plate reader
Vi-CELL XR	Beckman-Coulter	731050	automated cell counter
ImmunoSpot 5.1	ImmunoSpot		assay analysis software
ESCO Class II Type A2	ESCO		Biosafety cabinet
Falcon cell strainer	Corning, Inc.	VWR cat# 21008-952
Exel Comfort Point Insulin syringe	MedLab Supply	26028
Rotanta 460R	Hettich		centrifuge
Vi-CELL XR Quad Pak Reagent Kit	Beckman Coulter	383722
Incu Safe	Panasonic-Healthcare		incubator
22µm Filter	ThermoScientific	VWR act# 597-4520	22µm Filter
KimWipes	Kimberly-Clark Professional	VWR cat# 21903-005	paper towels

Riferimenti

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Schultheis, K., Schaefer, H., Pugh, H. M., Yung, B. S., Oh, J., Nguyen, J., Humeau, L., Broderick, K. E., Smith, T. R. Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination. J. Vis. Exp. (143), e58595, doi:10.3791/58595 (2019).