Reconocimiento de objetos nuevos y ubicación del objeto conductual en ratones en un presupuesto

Este protocolo proporciona un método rentable para llevar a cabo la ubicación de objetos y reconocimiento de objeto novedoso comportamiento pruebas en ratones. Estas pruebas permiten la evaluación de la función hippocampal, así como función de otras regiones corticales, como la corteza prefrontal, implicada en el objeto reconocimiento¹⁰. OLT y norte tienen la ventaja de evitar estímulos con Valencia emocional fuerte que se requieren para el laberinto acuático de Morris, acondicionado de miedo contextual, laberinto de Barnes o laberinto de brazos radiales. También evitan la necesidad de privación de alimentos como para el laberinto de brazos radiales. Además, este protocolo describe un sencillo procedimiento de prueba de dos días que no requiere equipo extenso o complicado para ejecución o análisis. Una desventaja de estas tareas es que no permiten medidas de aprendizaje o adquisición. Una diferencia en la investigación de la novedad podría ser debido a la pobre aprendizaje acerca de los objetos durante el entrenamiento, pobre memoria de lo aprendido o ambos. Total tiempo investigando objetos es una medida importante para descartar diferencias inherentes en la unidad de exploración pero no es una medida del aprendizaje. Si las medidas del aprendizaje son importantes para una cuestión experimental, un laberinto de agua, el laberinto de Barnes, o laberinto de brazos radiales probablemente sería preferible.

Edificio aduana de comportamiento arenas tiene el potencial de ahorrar cientos de dólares y el objeto dentro del alcance de una gran variedad de laboratorios de prueba. Este protocolo elimina muchos obstáculos y optimiza el proceso de fabricación para hacer construcción de arena interno más accesible a los científicos sin formación especializada en acrílicos. Es importante tener en cuenta que comprar hojas de acrílico color que contrastan con los ratones, como el acrílico blanco para ratones negros y acrílico negro para ratones blancos, facilitará la adquisición de datos y análisis, especialmente cuando se utilizan comercialmente disponibles software de análisis. Ordenar hojas de corte a la medida con “enrutado bordes” elimina la necesidad de una mesa vio (cuadro 1), y el uso del cemento de acrílico elimina la necesidad de taladrar y avellanar los orificios piloto. Atornillar los sujetadores, perforación y acrílico de corte a menudo hace que se rompe, chip y crack debido a su naturaleza frágil. Porque el cemento es un solvente, fluirá en el área de la unió, disolver y ablandar cualquier acrílico que encuentra. Por lo tanto, no debería aplicarse a cada pieza por separado como si fuera un pegamento tradicional. A diferencia de la cola, el cemento no llenar espacios negativos o se adhieren a las superficies. Esta es la razón principal para “enrutados bordes” como esto asegurará un borde liso y plano, creando un enlace mucho mejor. Cuando el cemento se seca, habrán fusionado las dos hojas de acrílico en una sola pieza en un proceso denominado “soldadura solvente”. Como metal de soldadura, el producto final es una sola pieza, pero la zona soldada siempre seguirá siendo el lugar más débil. Como tal, una vez que las arenas están en uso, debe tener cuidado para evitar el impacto directo o una tensión extrema en esos momentos.

Este protocolo también muestra cómo configurar 4 arenas de prueba simultánea de hasta 4 ratones (figura 1 y figura 2). Las paredes opacas de las arenas impiden que los ratones ver uno con el otro durante las pruebas, pero todavía hay una posibilidad de que otros ratones en la habitación provoca olor o distracciones de ruido que pueden afectar la prueba. Ensayos de habituación como detallada aquí pueden ayudar a mitigar este problema, como ratones están expuestos a las condiciones de la sala varios animales antes de la prueba de comportamiento. Sin embargo, si las distracciones de otros ratones o experimentador ruido asociado con el manejo de otros ratones es una gran preocupación, una arena con un ratón puede ser utilizado, así, aunque aumentará el tiempo necesario para completar la OLT y la norte con varios ratones. Más de 4 arenas teóricamente podrían ser utilizados también, pero mayoría de las cámaras no tienen un ancho suficiente campo de visión para mostrar que muchas arenas con buena resolución.

Las dimensiones y distancias proporcionan aquí son pautas generales para las pruebas de comportamiento de ratón en un típico cuarto de prueba que es de 16 x 16 x 16 m³ en dimensiones (figura 1B y 1C). Puesta en marcha de señales ambientales apropiados, arenas y el equipo de grabación de vídeo deben ser optimizado para cada ambiente. Señales pueden consistir en grandes formas o patrones (normalmente en blanco y negro) que permiten a ratones para orientarse espacialmente en la OLT. En vez de poner señales en distintos lugares frente a la unos a otros, señales también puede montarse a la pared de la zona de pruebas. Este protocolo recomienda dividir el cuarto de prueba con una cortina para esconder el investigador y el equipo durante la prueba de comportamiento. Durante toda habituación, intervalos entre ensayos y ensayos activos investigadores deben cerrar la cortina para separarse del área de pruebas. Si esto no es práctico, el equipo puede permanecer a la vista de los ratones, pero el investigador debe moverse fuera de la vista durante la tarea. Si el investigador está presente, los ratones pueden intentar confiar en él o ella como una referencia espacial.

Todas las pruebas conductuales deben completarse en un ambiente controlado de temperatura y humedad con iluminación tenue, pero incluso en unos 310 lux y señales extrañas mínimo sonido o fuerte olor ambiental, tales como perfumes en experimentadores. Entre cada día de ensayo y pruebas, todas las arenas y los objetos deben limpiarse con Animalario recomendada métodos de esterilización tales como limpiar con etanol al 70% o blanqueador toallitas para reducir señales olfativas. Si se utilizan desinfectantes químicos, se recomienda un enjuague final con etanol al 70% porque muchos desinfectantes químicos pueden ser irritantes a los pies de los animales.  Como con cualquier tarea conductual, manejo de ratones durante varios días antes de la prueba es necesaria familiarizarse con las personas que estarán realizando la OLT y NORT y reducir el estrés durante la prueba de^20,22. Como ratones pueden experimentar estrés agudo por individuos desconocidos en las inmediaciones el área de pruebas, se recomienda también que toda la prueba conductual debe ser completada por el mismo individuo. Los parámetros de prueba y condiciones detalladas en el presente Protocolo se han optimizado para 6 a ratones C57Bl/6 adultos de 9 semanas de edad y serían más útiles en revelar debilitaciones de la memoria debido a una lesión en este grupo de edad o debilitaciones de la memoria por la edad sí mismo en los ratones más viejos. Si el objetivo es poner a prueba para mejorar la memoria en ratones jóvenes, sería más apropiado evitar efectos de techo sobre el rendimiento en la versión más fácil de ITI de 20 min un ITI ya que van desde 1 hora hasta 1 día. De hecho, es pueden ir desde 5 min (memoria inmediata) hasta varias horas o días (memoria remota), dependiendo de las necesidades específicas de la experiencia y las cepas y las edades de los ratones. Lo importante, independientemente de la longitud, es de todos deben ser coherentes entre sesiones en un experimento. Como variedades y edad de los ratones exhibe diferencias en el comportamiento y aprendizaje, el tiempo para cada ensayo y cada intervalo, arreglo de la zona, de prueba y objetos utilizados pueden ser modificados según la cepa de ratones, su edad y de la lesión específica particular / enfermedad e intervención modelo sometido a prueba^9,21,23,25.

Mientras que el hipocampo dependencia de las funciones de memoria espacial probada en la OLT están bien establecidos, el norte puede o no puede confiar en el hipocampo. Interpretación de los datos desde el norte debe tomar esta advertencia cuenta. Las variables determinantes, para si el hipocampo está implicado, en la memoria de reconocimiento de objeto no están de acuerdo en todo, pero podrían incluir longitud ITI o prominencia espacial señales¹⁸. En particular, el protocolo presentado utiliza OLT espacial antes de NORT, que puede sesgar los ratones hacia el uso de procesos de hippocampal en el norte. Por lo tanto, es importante tener en cuenta que el orden puede invertirse, o cada tarea puede ser funcionada independientemente, dependiendo de los experimentadores preguntas y necesidades.

Selección de objetos es un aspecto crítico de la OLT y norte^22,24. Objetos ideales son bastante pesados fácilmente desplazados por un ratón y de material, como vidrio o metal, que un ratón no se puede dañar por masticar o rasguño. Madera, espuma, u objetos plásticos blandos no son apropiados ya que se deforman fácilmente y son difíciles de mantener libres de olores. Además, los objetos utilizados en los ensayos deben todos ser relativamente similares en tamaño, textura, olor y material. Figura 1 muestra un ejemplo de un objeto adecuado que podría ser utilizado. Esta figurita de plástico naranja de un polluelo se llena con arena para darle peso suficiente y sellado para evitar la fuga de limpieza reactivos u otros agentes causantes del mal olor. Debido a la forma de la parte superior, los ratones son incapaces de subir encima ni se siente sobre este objeto. La OLT o norte, este objeto mejor se empareja con otro objeto de similar tamaño, peso, material, color y complejidad, como una figurita de plástico similar de un conejo. Para garantizar la investigación del objeto verdaderamente refleja la preferencia por la novedad, todos los objetos deben estar validados por valor intrínseco equivalente con un mínimo de 8 ratones en la misma cepa, sexo y edad del grupo experimental como se describen en sección 2.9 del protocolo. Además, los objetos deben ser al azar en términos de qué objeto es el objeto novedoso o movido entre ratones en el mismo estudio para asegurar que las características inherentes de los objetos no afecta a preferencia. Colocación del objeto también puede afectar el éxito o fracaso de la OLT y NORT. Objetos deben ser contrapesado en las arenas y no ser demasiado cerca de las paredes. Una esquina concurrida por un objeto es un lugar atractivo para los ratones esconderse y esto será confundir medidas de investigación.

Un requisito previo importante para la recolección de datos es definir “investigación activa”, que es cuando un ratón activa un objeto con su nariz apuntada hacia el objeto no más de 2 cm de distancia. Un ratón en movimiento sobre la parte superior del objeto o mirando más allá del objeto no califica como investigación activa. Además, desde la OLT y NORT dependen un ratón Recordando la ubicación espacial o las características reales del objeto, debe haber suficiente estudio de éstos durante los ensayos de entrenamiento. Así, el investigador debe definir un tiempo mínimo de investigación y excluir a cualquier temas que no cumplen con ese nivel de referencia de investigación, tradicionalmente fijado en 20 segundos²¹.

Cuantificación del tiempo de investigación del objeto se puede lograr de varias maneras ya sea con o sin software de análisis costosos. Si se utiliza puntuación manual, como se describe aquí, la más completa colección de datos se logra registrando la fecha y hora en el video cuando el ratón está investigando el objeto. Los tiempos de arranque y parada de investigación del objeto en los tres ensayos individuales crea un registro permanente de marcas de tiempo imparcial y facilita el cálculo preciso manual de datos en comparación con métodos alternativos como el uso de un cronómetro para aditiva, registrar el tiempo total que un ratón investiga cada objeto.

También hay paquetes de software comerciales de investigación objeto de recuento. Software disponible en el mercado puede proporcionar una gran cantidad de datos más allá de la mano anotando datos descritos aquí, incluyendo distancia total viajó, cantidad de tiempo empleado en ciertas áreas de la arena y la velocidad de movimiento de^16,23. Software, una vez correctamente calibrado y confirmado para detectar confiablemente la investigación del objeto, también puede producir datos mucho más rápidos que manual de puntuación. Este rendimiento de datos más rápido a la larga, puede, producir ahorros netos en comparación con las humanos-horas requeridas para la puntuación manual. Sin embargo, más paquetes de software para el análisis conductual tienen altos costos iniciales que pueden ser prohibitivos para muchos laboratorios y puntuación manual a menudo puede ser realizada por los investigadores del estudiante, haciendo que los costos por hora de scoring de comportamiento mínimo. Software comercial viene también con frecuencia con restricciones sobre cuántos usuarios pueden acceder al software al mismo tiempo, limitar los ahorros de tiempo y rendimiento de procesamiento de datos. Aunque hay muchas ventajas a estos paquetes de software, no son necesarios para reunir la información esencial de tiempo investigando objetos de OLT y NORT. La habilidad de adquirir manualmente estos datos hace tareas de novela financieramente más accesibles a una variedad más amplia de los investigadores.

Una característica adicional de este protocolo es que el primer período de sesiones de habituación es esencialmente un ensayo en campo abierto, que permite obtener datos sobre la actividad y los niveles de ansiedad. Niveles de actividad pueden ser cuantificados usando la distancia total recorrida o velocidad, de media, si se dispone de software de seguimiento. Del mismo modo, con software de seguimiento, las medidas de ansiedad pueden derivar tiempo de permanencia en el centro de la arena o la distancia recorrida en el centro. Estos datos también pueden ser adquiridos manualmente por superponer el vídeo de la arena con una cuadrícula y cuantificación de cruces. Estos datos de campo abierto pueden ayudar a descartar un déficit motor grave o ansiedad excesiva que pudiera interferir con la investigación del objeto más tarde.

Las pruebas estadísticas utilizadas en este protocolo son representativos de los métodos tradicionales de análisis. Cuando se comparan 2 grupos de ratones, se recomienda una prueba t de dos muestras, dos colas para probar la significación de la diferencia en porcentaje tiempo investigando el objeto movido o novela entre grupos. Si los tamaños de muestra son desiguales, excepcionalmente alta variabilidad o mostrar variabilidad desigual entre los grupos, que una prueba no paramétrica es recomendada por el contrario, como muchos de los supuestos subyacentes de la prueba de t se violó en estas condiciones. Al comparar 3 o más grupos de ratones, ANOVAs se recomiendan para probar si el grupo tiene un efecto significativo en porcentaje tiempo investigando el objeto movido o novela. Pruebas de corrección de error post hoc, como la prueba de Tukey o corrección de Bonferroni comparaciones pares, puede entonces aplicarse para probar la diferencia de tiempo de investigación por ciento entre cada par de grupos. Con la OLT, una manera adicional para analizar los datos es probar un cambio significativo en porcentaje tiempo investigando el objeto movido de formación a los ensayos de la OLT. Con solamente un grupo de ratones, esta prueba tendría la forma de una pares, dos colas prueba t, prueba de cambios significativos en el tiempo por ciento con el objeto movido de formación OLT en cada ratón (teniendo en cuenta que estas son emparejados los análisis y no independiente medidas, ya que cada ratón cede dos puntos de datos). Con dos grupos de ratones, un medidas repetidas ANOVA de dos vías se utilizará, la medida repetida siendo el juicio (entrenamiento versus OLT) y el segundo factor de asignación de grupo. Pruebas post-hoc para las diferencias entre grupos de tratamiento deben comparar los grupos entre sí dentro de los ensayos.

Por otra parte, si pruebas de memoria en la OLT o NORT sean todo lo que está siendo probado, puede utilizarse un one-sample t-test porcentaje tiempo investigando un objeto versus el valor fijo de 50%. Un tiempo porcentaje significativamente superior al 50% sugiere memoria para el objeto. Uno por ciento, significativamente por debajo del 50% sugiere aversión (por alguna razón), y opciones de objeto deben ser reevaluados. Sin embargo, la prueba de t de una muestra no puede revelar si dos o más grupos difieren unos de otros. Por ejemplo, en un experimento con dos grupos de ratones, si grupo A pasaron el 60% del tiempo con el objeto de la novela para p = 0.049 a una muestra de la prueba t comparación al 50% y el grupo B sólo gastó 59% del tiempo con el objeto de la novela para p = 0,051 , Grupo A es significativamente diferente del 50% (y no es grupo B). Sin embargo, es erróneo concluir que estos dos grupos son significativamente diferentes entre sí. Un A comparación de dos muestras t-test y B pueden revelar fácilmente que estos dos grupos son estadísticamente indistinguibles. Si el objetivo final es comparar el rendimiento de la memoria de dos o más grupos, los grupos deben compararse estadísticamente entre sí, no sólo en comparación con un estándar externo. Una pauta similar se aplica para una comparación de tiempo con un objeto se movió entre la formación y el OLT. En este caso, encontrar una diferencia significativa en el tiempo por ciento con un objeto movido entre OLT y el entrenamiento en un grupo y no en otro no muestran que estos grupos son estadísticamente diferentes. Los grupos deben post-hoc comparada entre sí dentro de cada ensayo, no sólo a través de los ensayos en grupo.

Es importante tener en cuenta que el tiempo de investigación de cualquier ratón individual no puede utilizarse como evidencia para o contra la memoria. Más bien, memoria para el objeto ubicación o identidad en estas tareas sólo se deduce basándose en datos agregados que estadísticamente se compararon a datos agregados de otro grupo o a los niveles de probabilidad fijo (50% de tiempo, 0 relación de discriminación). El tamaño de muestra necesario dependerá en gran medida el tamaño del efecto de una particular manipulación y variabilidad en el comportamiento, los cuales a su vez dependerá de los ratones que se utilizan. Edad, sexo y manipulaciones de todo impacto de la variabilidad. En los datos del ejemplo presentados en la Figura 3A y 3B, n = 14 sujetos fueron utilizados, dando un tamaño de efecto de 0,68 y potencia de 0.65 para una prueba de t pareada con α = 0.05. Si una potencia de 0,8 fueron deseada para esta comparación, se requiere un tamaño de muestra de 18.

Esta discusión está enmarcada en los valores de p y cortes de importancia porque estas suelen ser las medidas y análisis más registrados datos OLT y norte y por lo tanto probablemente familiar para los experimentadores y los revisores. Esta dependencia de los valores de p ha sido fuertemente criticado como estadísticamente válido²⁶. Sin embargo, aunque los métodos de análisis alternativos existen y son apoyados en algunas revistas²⁷, ninguno han sido ampliamente adoptada por los campos biomédicos y conductuales estándar²⁶.

En Resumen, este protocolo con eficacia pruebas de memoria en ratones a costes mínimos. Recomendaciones para modificaciones apropiadas en el protocolo se incluyen para asegurar la implementación exitosa con cualquier modelo de roedor pequeños. Aplicación de este protocolo de lesiones específicas o modelos de intervención terapéutica puede revelar valiosa relevancia funcional que complementa los mecanismos celulares y moleculares estudiados.