Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Imen Bouchnak; Lucas Moyet; Daniel Salvi; Marcel Kuntz; Norbert Rolland

doi:10.3791/58581

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Biochimica

Vorbereitung der Chloroplasten Sub Fächer von Arabidopsis für die Analyse von Protein-Lokalisierung durch Immunoblotting oder Proteomics

Published: October 19, 2018

doi:

10.3791/58581

Imen Bouchnak¹, Lucas Moyet¹, Daniel Salvi¹, Marcel Kuntz¹, Norbert Rolland¹

¹Université Grenoble Alpes, INRA, CNRS, CEA

Summary

Hier beschreiben wir eine Methode, um intakte Chloroplasten aus Arabidopsis Blättern und ihre drei Sub-Hauptfächer (Umschlag, Stroma und Thylakoids), reinigen mit einer Kombination von differenziellen Centrifugations, kontinuierliche Percoll Gradienten und diskontinuierliche Saccharose Steigungen. Die Methode ist wertvoll für Subplastidial und subzelluläre Lokalisierung der Proteine durch Immunoblotting und Proteomik.

Abstract

Chloroplasten sind wesentliche Bestandteile der Pflanzenzellen. Diese Plastiden erfüllen viele wichtige Funktionen, wie Assimilation von Kohlenstoff, Schwefel und Stickstoff sowie Synthese von wesentlichen Metaboliten. Diese Organellen bestehen aus den folgenden drei wichtigsten Sub-Fächer. Der Umschlag, gekennzeichnet durch zwei Membranen, umgibt die Organellen und steuert die Kommunikation von Plastiden mit anderen Fächern der Zelle. Das Stroma ist die lösliche Phase der Chloroplasten und der Haupt-Website wo Kohlendioxid in Kohlenhydrate umgewandelt wird. Die Thylakoidmembran Membran ist die innere Membran-Netzwerk bestehend aus Grana (flache komprimierte Sacs) und Lamellen (weniger dichten Strukturen), wo sauerstoffhaltige Photosynthese stattfindet. Dieses Protokoll beschreibt Schritt für Schritt Verfahren für die Reinigung, mit differenzierten Centrifugations und Percoll Gradienten, der intakten Chloroplasten aus Arabidopsisund deren Fraktionierung, mit Saccharose Steigungen, in drei Sub-Fächer (z. B. Umschlag, Stroma und Thylakoids). Dieses Protokoll beschreibt auch, wie die Reinheit dieser Fraktionen mit Marker, die auf die verschiedenen Chloroplasten Sub Fächer zu bewerten. Die hier beschriebene Methode ist wertvoll für die Lokalisierung der Subplastidial von Proteinen mit Immunoblotting, sondern auch für subzellulären und Subplastidial Proteomics und andere Studien.

Introduction

Chloroplasten sind wesentliche Bestandteile der Pflanzenzellen. Sie stammen aus einem Cyanobakterien Vorfahren, der eine Endosymbiose unterzogen und schließlich entwickelte sich als eine Organelle Evolution¹^,². Solche Organellen enthalten drei Hauptfächer (Abbildung 1). Envelope-Systems besteht aus einer inneren und einer äußeren Membranen umgeben die Organellen. Diese Doppelmembran-System enthält verschiedene Enzyme im Stoffwechsel der Fette und Pigmente und widmet sich vor allem um die Kontrolle über die Kommunikation zwischen Plastiden und die Zellflüssigkeit. Es enthält verschiedene Verkehrssysteme, mit denen die Einfuhr von nuklearen-kodierten Proteine und den Austausch von Ionen und Metaboliten zwischen dem Cytosol und die Chloroplasten so regulieren wichtige Stoffwechselfunktionen der pflanzlichen Zelle³^,⁴. Das Stroma der lösliche Phase der Chloroplasten, enthält Enzyme des Calvin-Zyklus (CO₂ Assimilation), die Synthese von verschiedenen Metaboliten wie Aminosäuren und Vitamine und die Transkription und Translation Maschinen von der Plastiden. Die Thylakoidmembran Membran ist ein weithin organisierte interne Membran-Netzwerk wo die leichte Phase der Photosynthese stattfindet. Chloroplasten sind dabei der Ort, wo wichtige Stoffwechselwege⁵auftreten.

Um neue Regulierungsmechanismen zu entschlüsseln, die Chloroplasten Dynamik und Physiologie steuern, deshalb definieren die Sub-plastidial Lokalisierung der Chloroplasten Proteine entscheidend für gezielte Untersuchungen mit dem Ziel, besser zu verstehen, Proteine Funktionen unterstützen im Modell Organismen⁶. Um Zugang zu den echten Subplastidial Lokalisierung dieser Proteine bekommen, gilt es somit von hochreinen Subplastidial Fraktionen (Umschlag Membranen, Stroma und Thylakoids) beginnen. In diesem Zusammenhang ist das Ziel dieses Protokolls intakte Chloroplasten von Arabidopsis Blätter mit differenzierten Centrifugations und kontinuierliche Percoll Steigungen zu reinigen und zu ihnen fraktionieren mit diskontinuierlichen Saccharose Steigungen, in drei Sub-Fächer (z. B. Umschlag, Stroma und Thylakoids). Die hier beschriebene Methode bietet auch Anweisungen, um die Reinheit des gereinigten Sub-Organellen Brüche mit Hilfe von Markern, die verschiedenen Chloroplasten Sub Fächer zugeordnet zu beurteilen. Dieses Protokoll ist wertvoll für die Lokalisierung der Subplastidial von Proteinen mit Immunoblotting und zur weiteren Analyse des gereinigten Fraktionen mittels Massenspektrometrie (MS)-basierte Proteomik-Studien.

Protocol

1. Vorbereitung der Puffer, Stammlösungen und Steigungen Bereiten Sie die folgenden Stammlösungen, die bis zu 6 Monate bei 4 ° c gelagert werden können Bereiten Sie 1 L Tricine Puffer (1 M, pH 8,4) und Tricine Buffer (1 M, pH 7.6). Stellen Sie pH-Wert durch Zugabe von KOH Pellets. Bereiten Sie 1 L der Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA, 0,5 M, pH 8) und 3-(N-morpholino) Propan sulfonsäure (MOPS) Puffer (1 M, pH 7,8). Stellen Sie pH-Wert durch Zugabe von NaOH Pellets. Bereiten Sie 50 mL von MgCl2 (1 M). 50 mL der Protease Inhibitoren Lösungen vorbereiten: Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PMSF eingerichtet in Isopropanol, 100 mM), Benzamidine-Hydrochlorid-Hydrat (100 mM), und ε-Caproic Aminosäure (50 mM).Hinweis: Während PMSF und Aminosäure Caproic monatelang bei 4 ° C in Lösung stabil sind, sollte Benzamidine Lösung bei-20 ° c gelagert werden Bereiten Sie die folgenden Lösungen am Vortag das Experiment und speichern Sie alle Lösungen bei 4 ° c Bereiten Sie 4 L Schleifen mittlerer pH 8.4 enthält Tricine-KOH (20 mM, pH 8,4), Sorbit (0,4 M), EDTA (10 mM, pH 8) und Nahco33 (10 mM). Stellen Sie pH-Wert durch Zugabe von NaOH Pellets. Rinderserumalbumin (BSA) bei 0,1 % (w/V) kurz vor dem Einsatz hinzufügen und gut verrühren. Bereiten Sie 500 mL waschen Medium (2 X) pH 7.6 mit Tricine-KOH (20 mM, pH 7,6), Sorbit (0,8 M), MgCl2 (5 mM) und EDTA (2,5 mM). Stellen Sie pH-Wert durch Zugabe von NaOH Pellets. Verdünnen Sie solche Lösung nach der Zubereitung des Percoll gradient Lösung waschmedium (1 X) zu erhalten. Bereiten Sie 200 mL Percoll-gradient-Lösung zur Reinigung von Chloroplasten durch Mischen Percoll mit waschmedium (2 X) auf ein gleiches Volumen zu einer endgültigen Lösung bei 50 % (V/V) Percoll / 0,4 M Sorbit. Chloroplasten Fraktionierung bereiten Sie 50 mL Saccharose-Lösungen durch Mischen von MOPS (10 mM, pH 7,8), MgCl2 (4 mM) und unterschiedlichen Konzentrationen von Saccharose (0,3 M, 0,6 M und 0,93 M vor). Bereiten Sie die folgenden Steigungen und Puffer vor Beginn des Experiments. Bereiten Sie sechs Röhren Percoll Gradienten (jeweils enthaltend 30 mL einer 50 % Percoll / 0,4 M Sorbit) durch Zentrifugation bei 38.700 x g 55 min bei 4 ° C. Halten Sie die Bremse aus Mischung von den Steigungen zu verhindern. Nach Zentrifugation speichern Sie die Röhrchen mit den vorgeformten Gradienten in einem kalten Raum bis zur Verwendung. Bereiten Sie vier Röhren von Saccharose Steigungen, mit jeder Verlauf der drei folgenden Saccharose Schichten gebildet: 3 mL von 0,93 M, 2,5 mL von 0,6 M und 2 mL von 0,3 M Saccharose. Überlagern Sie sorgfältig jede Schicht mit einer peristaltischen Pumpe mit 0,93 M unten beginnend und endend mit 0,3 M an der Spitze. Chloroplasten Lyse mit MOPS (10 mM, pH 7,8), MgCl2 (4 mM), PMSF (1 mM, eingerichtet in Isopropanol), Benzamidine-Hydrochlorid-Hydrat (1 mM) und ε-Caproic Aminosäure (0,5 mM) bereiten Sie 50 mL hypotone Medium vor. Speichern Sie den Puffer auf dem Eis bis zur Verwendung. Bereiten Sie 50 mL Waschpuffer mit MOPS (10 mM, pH 7,8), PMSF (1 mM), Benzamidine-Hydrochlorid-Hydrat (1 mM) und ε-Caproic Aminosäure (0,5 mM) Membran. Speichern Sie den Puffer auf dem Eis bis zur Verwendung. 2. Wachstum und die Ernte von Arabidopsis Blätter Wachstum der Arabidopsis -Pflanzen Vorbereitung 4 große Kunststoff-Töpfe (für eine Gesamtfläche von 0,5 bis 1 m2) von Arabidopsis -Pflanzen durch Aussaat der Samen in jeder Pfanne 30 mg. Arabidopsis -Pflanzen mit einer Lichtintensität von 150 μM m-2 s-1für 5 Wochen bei 12-h-Licht-Zyklus bei 23 ° C (Tag) / 18 ° C (Nacht) wachsen. Inkubieren Sie Pflanzen in einem Raum dunkel und kalt (4 ° C) über Nacht vor dem Experiment (zur Reduzierung der Stärkekörner in Chloroplasten). Vorher wiegen Sie 1 L Becher und dann legen Sie es auf dem Eis vor Beginn der Ernte von Blattmaterial. Ernten Sie Arabidopsis Blätter durch die Vermeidung von Boden (Kompost). Erneut wiegen Sie das Becherglas und nehmen Sie das Gewebe Gewicht.Hinweis: 400 bis 500 g des Blattmaterials dürften aus vier Pfannen. Blätter in einem kalten Zimmer mit 2 L Puffer Schleifen zu homogenisieren (Hinzufügen von BSA vor Gebrauch) dreimal / 2 s jedes Mal in einem Mixer mit hoher Geschwindigkeit. Filtern Sie das Homogenat in einem kalten Zimmer mit 4 Schichten aus Musselin und eine Schicht aus Nylon-Blutex. Drücken Sie vorsichtig die Homogenat Blätter in Musselin/Nylon-Blutex, die Flüssigkeit zu extrahieren. Das restliche Gewebe in den Mixbecher für einen zweiten Extraktion zu erholen. Wiederholen Sie die Schritte, 2.5 und 2.6 mit 2 L des Schleifens Mittel- und neue 4-5 Schichten aus Musselin (in einem kalten Zimmer). 3. Reinigung des rohen Chloroplasten mit Differentielle Zentrifugation Ebenso verteilen Sie den groben Zelle Extrakt in sechs 500 mL Flaschen und stellen Sie die Flaschen auf dem Eis vor Zentrifugation. Zentrifuge für 2 min, sobald die maximale Geschwindigkeit (2.070 x g) (maximale Beschleunigung und Bremse auf 4 ° C) erreicht ist. Den überstand sanft zu verwerfen. Aspirieren des restlichen Überstands mit einer Wasserpumpe und die Pellets mit konzentrierter Rohöl Chloroplasten auf Eis. Sanft Aufschwemmen Pellets durch Hinzufügen von einen minimalen Volumen waschmedium (1 X) (Endvolumen von kombinierten Chloroplasten Suspensionen = 36 mL) mit einem Pinsel oder einem gebogenen Kunststoffspachtel. Verwenden Sie ein 10 mL pipettieren, 3 mL waschmedium in jeder Flasche hinzuzufügen.Hinweis: Verwenden Sie pipettieren nicht mit sehr feinen Spitzen, um Bruch der Chloroplasten zu vermeiden. Alternativ schneiden Sie die blaue Spitze von einem Pipettieren mit einer Rasierklinge, ein größeres Loch zu generieren. Sammeln Sie die resuspendierte Chloroplasten in eine Röhre mit einer 10 mL pipettieren. Mischen Sie vorsichtig durch invertieren die Röhre um eine homogene Suspension vor der Verladung auf Percoll Gradienten zu erhalten. 4. Reinigung des intakten Chloroplasten auf kontinuierliche Percoll Steigung Laden Sie langsam 6 mL der Suspension Chloroplasten übereinander die sechs Percoll-Gradienten mit einer 10 mL pipettieren, um Bruch der Chloroplasten zu vermeiden. Zentrifugieren der Gradienten für 10 min bei 13.300 x g, 4 ° C mit einem schwingen-Eimer-Rotor.Hinweis: Die Beschleunigung sollte langsam sein, und die Bremse sollte getrennt werden (Bremse ausgeschaltet oder langsam Abbremsen), um zu verhindern, mischen die Percoll-Gradienten. Aspirieren Sie die obere Phase, die gebrochenen Chloroplasten und intakte Mitochondrien mit einem Wasserpumpe enthält, und rufen Sie dann intakte Chloroplasten vorhanden in der unteren phase (die breitere dunkelgrünen Band) mit einer 10 mL pipettieren. Achten Sie darauf, dass Sie keine Kerne und zellenrückstand (gefunden an der Unterseite des Rohres) mit den intakten Chloroplasten (Abbildung 2A) abzusaugen. Verdünnen Sie 3-4-fach das intakte Chloroplasten-Fahrwerk mit waschen Puffer (1 X). Zentrifuge für 2 min, sobald die maximale Geschwindigkeit (2.070 x g, 4 ° C) erreicht ist (maximale Beschleunigung und Bremsen). Den überstand sorgfältig zu verwerfen. Völlig Aspirieren des restlichen Überstands mit einer Wasserpumpe und halten das Pellet konzentrierte intakt Chloroplasten auf Eis. Halten Sie vor der Chloroplasten Lyse eine Aliquote intakt Chloroplasten Bruchteil in etwa 1 mL waschmedium (1 X) für weitere Analysen mit Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) und westliche Beflecken. Halten Sie eine kleine aliquoten von diese intakten Chloroplasten zur Bestimmung der Proteinkonzentration. Speichern Sie die intakte Chloroplasten Bruchteil in flüssigem Stickstoff für weitere Experimente. 5. Lyse der intakten Chloroplasten mit eine hypotone Puffer und Reinigung der Chloroplasten Sub Fächer auf diskontinuierliche Saccharose Steigungen Lösen Sie die gereinigten intakten Chloroplasten durch resuspending das Pellet in hypotone Medium, die Protease-Inhibitoren (das endgültige Volumen sollten nicht mehr als 12 mL) enthält.Hinweis: Von diesem Schritt ist die Verwendung von Pipettieren mit feinen Spitzen (blaue Tipps) möglich da Unversehrtheit der Chloroplasten nicht mehr erforderlich ist (pipettieren Chloroplasten rauf und runter, solange Pellet nicht ganz Nukleinsäuretablette ist). Arabidopsis Chloroplasten sind sehr zerbrechlich (im Vergleich zu Erbse Chloroplasten, zum Beispiel) und ihrer Lyse ist fast sofort nach der Inkubation in hypotone Medium. 3 mL lysierten Chloroplasten auf der Oberseite jedes vorgeformten Saccharose Steigungen mit einer peristaltischen Pumpe langsam zu laden. Ultrazentrifugen Gradienten für 1 h (70.000 x g, 4 ° C). Balance-Paare von Röhrchen mit hypotone mittlere Puffer vor der Zentrifugation. Sorgfältig die Stromale lösliche Proteine wiederherstellen, indem Sie pipettieren der oberen Phase des Verlaufs (3 mL aus jeder Verlauf) (Abb. 2 b). Nehmen Sie ein Aliquot zur Bestimmung von Protein-Konzentration-7. Speichern Sie das Stroma in flüssigem Stickstoff für weitere Experimente. Aspirieren der verbleibenden oberen Phase jeder Verlauf bis zu das gelbe Band mit einem Wasserpumpe. Rufen Sie das gelbe Band (Umschlag) mit einem pipettieren (ca. 1 mL aus jeder Verlauf). Bündeln Sie die Umschläge in einer Röhre. Entfernen Sie die restlichen Phase jeder Verlauf bis zu der Thylakoidmembran Pellet mit einem Wasserpumpe. 6. Waschen und Konzentration der Thylakoidmembran und Umschlag-Membran-Systeme Aufschwemmen der Thylakoidmembran Pellets (grüne Pellets) in ein Mindestvolumen (2 mL) der Membran Waschpuffer (1 X) (mit Protease-Inhibitoren). Verdünnen Sie die Umschlag und Thylakoidmembran Suspensionen 3-4-fach in Membran waschmedium (stellen Sie die Lautstärke auf 10 mL) und Ultrazentrifugen für 1 h (110.000 x g, 4 ° C). Gleichen Sie Paare von Röhrchen mit Waschpuffer vor Zentrifugation Membran aus. Aspirieren Sie sorgfältig die Überstände mit einem Wasserpumpe. Fügen Sie ca. 100 µL Waschpuffer (mit Proteaseinhibitoren) zum Umschlag Pellet Membran. Nehmen Sie ein Aliquot zur Bestimmung von Protein-Konzentration-7. Speichern Sie die gereinigten Umschlag Membran Vorbereitung in flüssigem Stickstoff. Aufschwemmen Sie Thylakoids Pellet in 3 mL Waschpuffer (mit Proteaseinhibitoren) Membran. Nehmen Sie ein Aliquot zur Bestimmung von Protein-Konzentration-7. Thylakoidmembran Membran Bruchteil in flüssigem Stickstoff zu speichern.

Representative Results

Aufeinander folgenden Schritten des Verfahrens was gereinigten Chloroplasten und ihre Sub-Fächer sind in Abbildung 2wieder aufgenommen. Die Percoll-Verlauf (Abbildung 2A) ermöglicht intakte Chloroplasten von gebrochenen Chloroplasten und Mitochondrien (oben des Farbverlaufs) oder Kerne und zellenrückstand (Ende des Farbverlaufs) zu unterscheiden. Nach Bruch durch die Percoll-gereinigte Organellen durch einen osmotischen Schock sind die daraus resultierenden Brüche auf einer Steigung von Saccharose (Abb. 2 b) getrennt. Das Stroma (lösliche Bestandteil der Chloroplasten) schwimmt an der Oberfläche des Farbverlaufs Saccharose. Die leichten Umschlag membranvesikel werden als diskrete gelbe Band an der 0,6/0,93 M Saccharose Schnittstelle wiederhergestellt. Die schwersten Thylakoidmembran Membranen Vesikel sind konzentriert an der Unterseite des Rohres. Nach Erholung, Wasch- und Konzentration der zwei Membran-Fraktionen Proteine werden quantifiziert und die Zusammensetzung aller vier Fraktionen auf eine SDS-PAGE (Abbildung 2) analysiert. Die Bahnen sind auf eine gleiche Protein-Basis (20 µg der einzelnen gereinigten Fraktionen) geladen. Wissend, dass Chloroplasten nur 1 % des Umschlags Proteine und 50 % der Proteine aus dem Stroma oder die Thylakoids enthalten, tendenziell dies Kreuzkontamination von gereinigten Umschlag Zubereitungen mit anderen Chloroplasten Sub Fächern zu überschätzen. Allerdings kann diese Methode um winzige Mengen von Proteinen, die Kreuz-Kontamination den Umschlag Bruch zu erkennen. Marker aus jedem Fach (z.B. reichlich Proteine) sind sehr hilfreich bei der Bewertung der Kontamination der Fraktionen. In der Tat dürften die Thylakoidmembran und Umschlag Membran Brüche enthalten geringe Mengen an die große Untereinheit der RuBisCO (RBCL), das am häufigsten vorkommende Protein aus dem Stroma (50 kDa). Gebrochene Chloroplasten können leicht von intakten Chloroplasten durch den Verlust dieser Stromazellen Protein8unterschieden werden. Das Licht, die Ernte komplexe Proteine (LHCP) sind 25 kDa reichlich Thylakoidmembran Komponenten, die kaum sollte Umschlag Membranen9(weniger als 3 %) zu verunreinigen. Zu guter Letzt die Phosphat-Triose-Phosphat Nyrianer (TPT) ist ein 30-kDa-Protein, das nur in den gereinigten Umschlag Bruch aufgrund seiner starken Anreicherung sichtbar ist (d. h. 50 bis 100 X) in den Umschlag Bruchteil im Vergleich zu ganzen Chloroplasten extrahiert. Mit der beschriebenen Methode hier, Chloroplasten Sub Fächer sind in der Regel schlecht Kreuz verunreinigt, wie mit Western-Blot Analysen (Bild 2D) unter Berufung auf Antikörper gegen bekannte Marker für alle drei Sub-Fächer bestätigt: die löslichen Ketol-Säure Reductoisomerase (KARI) aus dem Stroma, die Chloroplasten Umschlag Kupfer ATPase (HMA1) und das Licht, die Ernte komplexe Proteine (LHCP) aus der Thylakoidmembran Membranen. Cross-Kontamination der drei Sub-Fächer kann mit Immunoblotting und Mass Spectrometry Analysen9quantifiziert werden. Während das Stroma von Umschlag oder Thylakoidmembran Fraktionen in der Regel nicht kontaminiert ist, enthalten die gereinigten Umschlag Brüche 3 % der Thylakoidmembran Proteine und bis zu 10 % der Proteine aus dem Stroma. Thylakoids enthalten bis zu 3 % der Membranproteine, Umschlag aber Proteine aus dem Stroma schlecht verunreinigen die Thylakoidmembran Membranen (weniger als 1 %). Mehr als mit eine entscheidende Rolle bei der Ermittlung der echten Subplastidial Lage der Chloroplasten Proteine, das vorliegende Verfahren somit begrenzt auch falsche Rückschlüsse auf Subplastidial Lokalisierung von Proteinen aus überqueren Sie Verunreinigungen. Abbildung 1: Repräsentative Schema der Chloroplasten Sub Fächer. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: Reinigung des intakten Chloroplasten und ihre drei wichtigsten Sub-Abteile mit Percoll und Saccharose Steigungen. A. Percoll Farbverlauf ermöglicht die Trennung von gebrochenen und intakte Chloroplasten. B. Saccharose Gefälle ermöglicht die Trennung von Stroma, Umschlag und Thylakoidmembran Brüche. C. Vertreter SDS-PAGE von Proteinen aus intakten Chloroplasten und ihre drei Sub-Hauptfächer ermöglichen, um reichlich Marker aus jedem Sub-Fach zu visualisieren. Jede Spur enthält 10 µg von Proteinen. Molekulargewicht Marker: RBCL, große Untereinheit der RuBisCO (Marker für das Stroma); TPT, Phosphat/Triose-Phosphat Nyrianer (Marker für den Umschlag); LHCP, leichte Ernte komplexe Proteine (Marker für die Thylakoidmembran). D. Western-Blot-Experimente, sodass von jedem Sub-Fach um spezifischer Marker (mit spezifischen Antikörpern) zu erkennen: die Chloroplasten Umschlag Kupfer ATPase HMA110, das Licht, die komplexe Proteine LHCP aus der Thylakoidmembran Ernte Membranen-11und der Ketol-Säure Reductoisomerase KARI aus dem Stroma-9. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Der vorliegende Artikel soll die Schritt-für-Schritt-Protokoll verwendet zur Reinigung von Chloroplasten (und ihre Sub-Fächer) detail aus Arabidopsis Thaliana. Da die Verfügbarkeit von seine vollständige Genomsequenz vor fast zwei Jahrzehnten und große Sammlungen von Einfügung Mutanten der Community zur Verfügung gestellt ist Arabidopsis als Modellpflanze jetzt allgemein akzeptiert. Während diese Pflanze für gentechnische Ansätze perfekt angepasst wurde, mussten jedoch Pflanzenforscher Biochemische und physiologische Werkzeuge, um dieses neue Modell anzupassen. Protokolle ermöglichen photosynthetisch aktive Chloroplasten aus Blättern der etablierten biochemische Modelle wie Spinat¹² oder Erbse¹³ so reinigen mussten angepasst werden. Die erste Methode beschreiben, Reinigung von Arabidopsis Chloroplasten erschien 1998¹⁴, kurz vor der Veröffentlichung die Arabidopsis Genom-Sequenz. Mehrere Jahre erfolgten spätere, einfache Methoden zur Isolierung von Arabidopsis Chloroplasten mit Studien zur in-vitro- Import von Proteinen in gereinigten Organellen analysieren kompatibel zur Verfügung¹⁵^,¹⁶. Jedoch erlaubte diese Methoden nicht, um hohe Reinheit und Erhaltung der photosynthetischen Aktivität des gereinigten Chloroplasten zu kombinieren. Vor kurzem war¹⁷, eine schnelle Methode festgestellt, die beruht auf der Verwendung von Percoll Gradienten ermöglicht, um fast 90 % der Photosynthese-Rate gemessen in den starten Blättern von Arabidopsis zu behalten.

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht, um Arabidopsis Chloroplasten auf ein hervorragendes Niveau der Reinheit zu reinigen. In der Tat, immunologische Erkennung von Verunreinigungen aus anderen Abteilungen der Zelle gezeigt, dass die gereinigten Organellen frei von mitochondrialen sind und Plasmamembran Marker⁹^,¹⁰. Dieses Protokoll war auch effizient zu reinigen Chloroplasten aus mehreren Arabidopsis Ökotypen¹⁸, wie Columbia (Col) oder Wassilewskija (WS), d. h. die Ökotypen, die für Genom verwendet oder zum Ausdruck gebracht wurden-Sequenz Tags (ESTs) Sequenzierung Projekten aber auch zu generieren T-DNA Einfügung Mutanten in Arabidopsis. Das heißt, wenn Proteomics Studien werden durchgeführt müssen, ist dieses Protokolls kompatibel mit diesen zwei Referenz-Ökotypen von Arabidopsis. Schließlich ist die Ausbeute an Chloroplasten unter Verwendung dieses Protokolls ähnlich dem erhält man, wenn ausgehend von Spinat oder Erbsen Blätter (z.B. 3 %, gemessen von der Chlorophyllgehalt in die Percoll-gereinigte Chloroplasten im Vergleich zu den insgesamt Chlorophyll Menge Blätter ab). In Bezug auf Proteine ergibt sich in der Nähe von 50 mg der Chloroplasten Proteine, wenn Organellen von 500 g 5 Wochen altes Baby Arabidopsis Blätter gereinigt werden.

Zu solchen guten Ertrag (und Chloroplasten Integrität), man sollte jedoch besonderes Augenmerk auf mehrere Schritte bei der Verwendung dieses Protokolls. Die Chloroplasten in Arabidopsis ist eine extrem fragilen Struktur (Dies gilt nicht für Erbse Chloroplasten, zum Beispiel). Besondere Aufmerksamkeit ist daher erforderlich, um große Bruch der Organellen während der Reinigung zu vermeiden. Die Anzahl und Größe der Stärkekörner in Chloroplasten vorhanden sind entscheidend für die Zubereitung von intakten Chloroplasten. In der Tat werden Chloroplasten mit großer Stärke Getreide während der anfänglichen differentielle Centrifugations Schritte mit dem Ziel, die grobe Chloroplasten Brüche¹²konzentrieren im allgemeinen gebrochen werden. Daher sollten die Pflanzen über Nacht in einem Zimmer dunkel und kalt (4 ° C) vor dem Experiment, um die Stärke zu verringern gehalten werden.

Neue Benutzer dieses Protokolls könnte versucht sein, von größeren Mengen an Blattmaterial (riesige Rosetten aus alten Arabidopsis -Pflanzen mit großen Blättern) zu starten versucht, die Wiederherstellung der gereinigten Chloroplasten zu verbessern. Jedoch in unseren Händen ausgehend von jungen Blätter (5 Wochen alten) ist der beste Kompromiss, Ertrag, Reinheit und Integrität des gereinigten Organellen zu kombinieren. In der Tat sind auch alte Blätter in Phenolverbindungen hochangereichertes, die gezeigt wurden, und Chloroplasten Integrität¹⁹negativ beeinflussen.

Schließlich ist die erste Extraktionsschritt (Schleifen des Gewebes) ein weiterer wichtiger Schritt. Der Mischprozess muss auf wenige Sekunden beschränkt. Wie bereits erwähnt, könnte neue Benutzer versucht sein, verwenden Sie länger zu mischen, so erwartet, um den Ertrag der gereinigten Organellen stark zu verbessern. Wenn längere mischen effektiv mehr Material aus den Blättern veröffentlicht, scheint es jedoch, dass der Anteil der gebrochenen Chloroplasten in den groben Zelle Extrakt rapide zunimmt. Aufgrund dieses hohen Verhältnis von gebrochen, um intakte Chloroplasten im Medium weitere Reinigungsschritte (Trennung Percoll Gefälle) werden stark beeinflusst und die Ausbeute der Reinigung ist unerwartet niedriger.

Verfügbarkeit von speziellen Protokollen Organellen zu reinigen haben eine Reihe von hohen Durchsatz erlaubt Proteomics-basierten Experimente an Chloroplasten Proben durchgeführt werden. Diese Daten wurden in mehreren öffentlichen Datenbanken⁶, wodurch für die Biologen im Bereich eine genaue Lokalisierung der subzelluläre (und Subplastidial) für viele Chloroplasten Proteine zur Verfügung gestellt. Dies galt vor allem für Umschlag Proteine deren Identität und Lage blieb weitgehend unbekannt vor dieser Analysen, da Umschlag Membranen eine kleine Chloroplasten-Komponente (1-2 % der Chloroplasten Proteine) darstellen, während Sie spielen eine Schlüsselrolle in Chloroplasten Stoffwechsel und Biogenese⁵^,²⁰. Mit dem beschriebenen Protokoll hier analysierten wir vor kurzem die Zusammensetzung der drei wichtigsten Chloroplasten Fächer von Arabidopsis (d. h. das Stroma, die Thylakoids und die Umschlag-Membran-System)⁹. Basierend auf einem semi-quantitative Proteomik-Ansatz (spektrale zählen), konnten wir beurteilen die Partitionierung von Hunderten von Proteinen in diesen drei Fächern Chloroplasten.

Während dieses Protokoll ermöglicht es, um die drei Hauptfächer der Chloroplasten von Arabidopsiszu reinigen, ist es auch möglich, zusätzliche Sub Fächer in den Chloroplasten zu unterscheiden. In der Tat besteht die Umschlag-Membran-System die innere und die äußere Hülle Membranen (Abbildung 1). Eine Methode, um innere und äußere Hülle Membranen aus Arabidopsis Chloroplasten reinigen bleibt jedoch nach bestem Wissen und gewissen hergestellt werden. Innere und äußere Hülle Membranen können aus Spinat²¹ oder Erbse²² Chloroplasten gereinigt werden. Die wichtigste Einschränkung der Arabidopsis ergibt sich meist aus der einschränkenden Mengen an Ausgangsmaterial. Ab 500 g Arabidopsis Blätter (die bereits 1 m² Fläche in einer Kammer Wachstum erfordert) kann nur 100 µg Umschlag Proteine zu reinigen. Auf der anderen Seite ist es einfach, mit zu beginnen, 5-10 kg Spinat aus dem Markt, um große Menge an Chloroplasten⁸ reinigen und am Ende mit einer Ausbeute von 3 bis 10 mg Umschlag Proteine aus diesem Material hinterlässt.

Das gleiche gilt für die Thylakoidmembran Sub-Fächer. In der Tat Thylakoids bestehen aus Licht membranvesikel (Lamellen) und dichten Strukturen (Grana) (Abbildung 1). Bestimmte Protokolle stehen diese beiden Fächer in Arabidopsis²³^,²⁴zu unterscheiden. Wieder, inventarisiert basierend auf eine quantitative Proteomik-Analyse, wir vor kurzem die Proteine in diesen zwei Sub-Fächer²⁴vorhanden. Diese Ansätze, zusammen mit einer eingehenden Untersuchung der Literatur, Validierung, oder Hypothesen für den Subplastidial Standort Hunderter Thylakoidmembran Proteine erlaubt. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass zusätzliche Membrane Microdomains an den gebogenen Rand der Thylakoids vorhanden sind. Diese Lipoprotein Sub Fächer oder Plastoglobules, sind dauerhaft zu Thylakoidmembran Membranen gekoppelt und enthalten eine bestimmte Gruppe von Proteinen²⁵. Unter Verwendung dieses Protokolls, ist es somit nicht möglich, diese spezifische Proteine aus anderen Thylakoidmembran Komponenten zu unterscheiden.

Einige echte (bekannten) Umschlag, Stroma oder Thylakoidmembran Komponenten fehlen noch aus der Liste der gefundenen Proteine. Die kontinuierliche Verbesserung der Empfindlichkeit der MS wird mit gezielten Biochemische und immunologische Analysen große Hilfe, den Chloroplasten-Inhalt auf ein komplettes Repertoire an die Zusammensetzung der verschiedenen Sub-Fächer zu überdenken sein.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch eine gemeinsame Promotionsstipendium an IB aus der INRA Pflanze Abteilung Biologie und Zucht und Labex GRAL (ANR-10-LABX-49-01) unterstützt. Wir würden auch gerne ANR Projekt ANR-15-IDEX-02, Dr. Olivier Vallon (IBPC Paris) auf Antikörper gegen lhcp- und Dr. Renaud Dumas (LPCV, Grenoble) anerkennen für Antikörper gegen KARI.

Materials

Percoll	GE Healthcare	17089101
Tricine	Roth	6977.2
Sorbitol	Roth	6213.1
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Promega	H5032
NaHCO₃	Roth	8551.1
Bovine serum albumin (BSA)	Roth	8076.5
MgCl₂	Roth	2189.1
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Benzamidine	Sigma	B6506
ε-amino caproic acid	Fluka	21530
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)	Roth	6979.3
Sucrose	Roth	9286.2
Acrylamide stock: 30% (w/v) acrylamide, 0.8% (w/v) bisacrylamide	Roth	3029.1
Tris	Fisher	BP152-5
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Roth	1057.1
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T-8133
Ammonium persulfate (APS)	Roth	9592.1
Glycerol	Roth	3783.1
Bromophenol blue	USB	US12370
Glycin	Roth	3908.3
Gel staining medium	Clini-sciences	GEN-QC-STAIN
Ethanol	CARLO ERBA	528151
NaCl	Euromedex	1112-A
Triton X-100	Promega	H5141
Fat-free milk powder	Régilait
HCl	Fisher	H/1150/PB15
KOH pellets	Sigma	1.05012
NaOH pellets	CARLO ERBA	480507
Anti-HMA1 antibody		Seigneurin-Berny et al, 2006	Used at a 1:1000 dilution
Anti-KARI antibody		Ferro et al, 2010	Used at a 1:1000 dilution
Anti-LHCP antibody		Vallon et al, 1991	Used at a 1:25,000 dilution
P-coumaric acid	Sigma	C-9008
Luminol (3-aminophalhydrazin)	Fluka	9253
Dimethyl sulfoxide (DMSO).	Sigma	D5879
Large (30 cm × 45 cm) plastic cases	Puteaux	162135
A. thaliana seeds			Around 30 mg of seeds for a whole case
Compost "Floragard"	Puteaux	16311770
Growth rooms			12-h light cycle, set at 23°C (day) / 18°C (night) with a light intensity of 150 μmol/m²/s.
Muslin or cheesecloth	Raffin	70116	80-cm-large
Nylon blutex 50 μm aperture	Tripette et Renaud, Sailly Saillisel		50 μm aperture
Motor-driven blender, three speeds, 1 gallon (4 L) capacity	Waring Blender
Fixed-angle rotors JLA-10.500 (6 × 500-mL plastic bottles)	Beckman Coulter
Beckman JA-20 rotor	Beckman Coulter
JA-20 (6 × 50 mL polypropylene tubes)	Sorvall instruments
Swinging-bucket rotor JS-13.1 (6 × 50 mL polycarbonate tubes)	Beckman Coulter
SW 41 Ti rotor (6 × 13.2 mL ultraclear tubes)	Beckman Coulter
SW 41 Ti rotor tubes (13.2 mL ultraclear tubes)	Beckman Coulter
Ultracentrifuge (Beckman L7)	Beckman Coulter
Centrifuge (Beckman JSE-06D18)	Beckman Coulter
Microcentrifuge	Eppendorf 5415D or equivalent
Water pump connected to a Pasteur pipette via a plastic tube.
Nitrocellulose membranes	BA85, Schleicher and Schuell
Filter paper	3MM, Whatman, Maidstone
Liquid nitrogen
Peristaltic pump	Gilson
Gel electrophoresis apparatus with the various accessories needed for protein separation by electrophoresis (combs, plates and casting apparatus).	Bio-Rad Protean 3 or equivalent
System for protein transfer to nitrocellulose membranes	Bio-Rad Protean 3 or equivalent

Riferimenti

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Citazione di questo articolo

Bouchnak, I., Moyet, L., Salvi, D., Kuntz, M., Rolland, N. Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics. J. Vis. Exp. (140), e58581, doi:10.3791/58581 (2018).