설립 및 종양 조각의 분석 Explants 진단 테스트에 대 한 전제 조건으로

이 연구에서 설명 하는 모든 마우스 실험에서 핀란드 국가 위원회의 동물 실험, 지침에 따라 수행 했다 그리고 헬싱키의 대학, 국가 지방의 실험 동물 위원회에 의해 승인 되었다 남쪽 핀란드 (면허 번호 ESAVI/9752/04.10.07/2015)의 사무실. 1입니다. 슬라이스 이전 준비 다음과 같은 자료를 준비 유지: vibratome 견본 홀더, vibratome 버퍼 트레이, 10 cm 배양 접시, 24-잘 접시, 10 mL 피 펫, 피 펫 보가, 쓰레기 봉투, 70% EtOH 50 mL 튜브에 악기, 그리고 조직 접착제를 소독. 준비는 vibratome: 70% 블레이드 홀더를 닦아 EtOH, 새로운 잎을 연결 하 고 vibrocheck (http://photos.labwrench.com/equipmentManuals/10103-3895.pdf) 설명서에 제공 된 지침에 따라 수행.참고: 그것은 칼 날의 수직 편향도 최소화 하 고 보장 좋은 품질 조각 vibrocheck 단계를 수행 하는 것이 중요. 각 채우기 1 mL의 행 크 스 균형 소금 솔루션 (HBSS) 100 U/mL 페니실린와 100 µ g/mL 스 (HBSS + P/S); 보충으로 24-잘 접시의 잘 얼음에 플레이트를 유지. F12 문화 매체와 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 2 m m glutamax, 22 mM 포도 당, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 보충을 준비 합니다.참고: 종양 조각 문화 매체와 성장 인자 보충 종양 조직25에 따라 달라질 수 있습니다. 약물 치료, 1.4, 단계에서 설명한 대로 동일한 구성을 사용 하 여 하지만 생략 하는 FBS F12 매체의 필요한 금액을 준비 합니다.참고: 성장 인자는 혈 청에서 종양 신호 교양된 조각에 영향을 미칠 수, 혈 청 자유로운 매체 것이 좋습니다 종양 조각에 단기 약 섭 동 연구. 장기적인 조각 문화를 분석 하는 경우 그것은 먼저 조직의 생존 및 치료 슬라이스 문화에 특정 종양 마커 식 혈 청 자유로운 매체의 효과 평가 하는 것이 중요. 2입니다. 폐 종양-베어링의 수집 보람된 호흡의 증상 및 체중의 손실을 보여줄 때 자 궁 경부 전위에 의해 종양 베어링 마우스를 안락사.참고: 공동2-중재 안락사 유도 슬라이스 생존 또는 hypoxic 응답 도출을 통해 종양 활동에 영향을 미칠 수 있습니다 폐에 hypoxic 조건으로 알려져 있다. 가슴 노출 되는 모든 4 개의 발에 30 G 바늘을 삽입 하 여 스티로폼 뚜껑에 안락사 마우스를 스트레칭. 피부를 잘라 오픈는 복 부에서 가슴 그리고 목 영역. 흉 곽 그리고 폐와 심장에 막 오픈 컷. 조직 손상을 방지 하기 위해 각된 위치에는 위를 유지. 마음 함께 종양 베어링 폐 해 부와 포함 하는 얼음 처럼 차가운 HBSS + P/S 30 mL 50 mL 튜브에 넣어 튜브를 차가운 유지 하 고 가능한 한 빨리 다음 단계를 수행 하십시오.참고: 폐 종양의 처리에 있는 지연을 변경할 수 있습니다 종양 기능, 예를 들면 신호 통로 활동. 3. 정밀 컷 폐 종양 조각 생성 층 류 후드 내부 보관 10cm 조직 문화 접시에 종양 베어링 폐 HBSS + P/S를 전송 합니다. 살 균가 위, 집게를 사용 하 여 폐 엽 고 종양 부 러 뜨 리 표면에 돌출부를 선택 합니다.참고: 종양 > 3 m m 크기에 부 러 뜨 리는. 삭제 된 종양 지역 얼굴 vibratome 블레이드는 정상 폐 조직을 둘러싼 큰 종양 타협 조직 경직 차이로 인해 슬라이스, 이후 종양 조직은 자르는 겪고 정상 조직에서 분리 한다. 플랫 조직 조각 표면 살 균 메스와 멀리 종양 주변 정상 폐 조직의 절단 부분에 의해 생성 하 고 cyanoacrylate 접착제의 방울에서 플랫 슬라이드를 찍어. 종양 얼굴 수직 위치에 블레이드를 vibratome의 견본 홀더에이 쪽을 탑재 합니다. 하자 2-3 분 동안 건조 접착제.참고: 견본 홀더에 붙어 정상적인 폐 조직 방해 하지 않는 종양 조직 슬라이스, 그리고 정상적인 조직에 도달 하기 전에 중지 슬라이스. 때로는 종양 조직 견본 홀더, 타협의 직 립 위치에 붙어 정상 폐 조직의 해 면 질감으로 인해 굴절. 이 경우, 추가 정상적인 폐 지원 조직 유지 수직 위치 (그림 1A iii)에 종양을 미리 탑재 된 정상 폐 조직 옆의 조각을 접착제. 금속 버퍼 쟁반으로 견본 홀더를 배치 하 고 버퍼에 조직 몰입은 때까지 차가운 HBSS + P/S 함께 그것을 채우십시오. 하얀 얼음 목욕에 금속 버퍼 트레이 놓고 얼음 그래서를 유지 하는 조직 멋진 슬라이스를 추가 합니다. 흰색 얼음 목욕은 vibratome에 연결 합니다. 적합 한 조각화 설정을 선택: 2.5-2.8, 0.10 0.14 사이 속도 자르는 사이 이르기까지 진폭 ms, 그리고 160-250 µ m 사이 배열 하는 절단 두께.참고: 조각화 설정을 조직의 경도 따라 조정 될 필요가 있다. 하드 티슈는 부드러운 조직 보다 슬라이스를 쉽게 하며 부드러운 조직 낮은 속도로 슬라이스 (0.1-0.12 ms) 및 더 높은 진폭 (2.6-2.8). 4-5 m m 큰 종양은 일반적으로 200 µ M 두께의 15-20 분할 영역을 제공합니다. 단기 재배 murine 종양 박판 모양 후드 밖에 서 반 무 균 조건 하에서 슬라이스 수 있다. 그러나, 임상 종양 항상 클래스 II biosafety 박판 모양 후드 인간의 조직에 가능한 전염 성 대리인에 노출을 피하기 위해 내부 슬라이스 한다. 소독 집게를 사용 하 여, HBSS, 얼음에 24-잘 접시의 별도 우물에 밀접 하 게 조각 슬라이스는 순서에의 추적 유지의 1 mL에 조각을 수집 합니다. 각을 표시 하는 것은 실험 계획에 따라 24-잘 접시의 잘. 예를 들어 마크 순차 웰 스 24-잘 접시의 문화 시간 포인트 또는 0 h, 차량 제어 (C), 마약 치료 (T) (그림 1B ii).참고: 하거나 방해 마십시오이 후속 조각의 두께에 불일치를 선도 하는 칼 날의 각도 대해 종양의 방향을 바꿀 것으로 한 조각을 수집 하는 동안 종양 조직을 당겨. 모든 조각을 수집 하는 때 잘 당 문화 매체의 2.5 mL를 포함 하는 6 잘 플레이트에 티타늄 격자 (그리드 당 2-3 조각)에 그들을 전송. 티타늄 격자와 매체 사이 아무 공기 방울 형성 되 다는 것을 확인 하십시오. 그리드 위에 슬라이스를 로드 하려면 매체의 부분 커버 눈금, 각도 위치에 6 잘 플레이트를 유지 하 고 그리드;에 매체에는 슬라이스를 배치 집게를 사용 하 여 그것 곱슬 경우 슬라이스를 확산. 95% 공기와 5% CO2, 37 ° C에서 유지 하는 습도 인큐베이터 안에 회전 외피 단위에 6 잘 플레이트를 로드 하 고 회전 주기 (그림 1C i-ii)를 시작 합니다.참고: 금속 격자와 6 잘 플레이트 무게 회전 장치를 켜기 전에 균형을 정확 하 게 되도록 해야 합니다. 격자의 한가운데에 분할 영역을 배치 하는 것이 중요 하다 그래서 그들은 완전히 공기 및 회전 주기 동안 액체 단계 사이의 대체. 너무 낮거나 높은 배치는 조각 산소 또는 양분 (그림 1C 나), 조직의 생존을 손상 시킬 수 있는 적절 하 게 노출 되지 않습니다. 그것은 조각을 아래로 슬라이드 때때로 수로 재배, 동안에 조각의 위치를 따르는 것이 중요입니다. 이 문화 발병 1-2 시간 내 경우, 그것의 위치를 수정 하 고이 샘플을 손상 될 수 있습니다 메모. 시간의 연장된 기간에 대 한 mispositioned는 분할 영역 조직 생존 능력은 크게 부적당 한 산소와 영양 공급에 의해 영향을 폐기 해야한다. 한 0-h, 뱀과, 참조 교양된 분할 영역에 인접 한 조직 조각을 수집 합니다. 위쪽, 중간 및 슬라이스 되는 직물의 센터를 3 개 이상 참조 조각 수집 합니다. 5.1에 설명 된 대로 즉시 0 h 슬라이스 및 프로세스를 수정.참고: 조각 수가 제한 된 경우, 예를 들어, 여러 복합 치료 또는 기술 복제를 할 수 있습니다, 만약 그것의 이웃 0 h 샘플 각 치료 샘플의 비교 어려울 수 있습니다. 이러한 경우에 문화 발병에 관련 마커의 식이나 상대 조직 생존 능력을 평가 하기 위해 가장 가까운 0 h 슬라이스 (적어도 400-600 µ m 간격)를 사용 합니다. 장기 재배에 대 한 문화 매체를 매일 보충. 격자 살 균 집게를 사용 하 여 조직 조각을 포함 하 고 6 잘 플레이트;의 빈 우물에 신선한 문화 매체와 매체의 70%를 교체 하 고 매체에서 다시 그리드를 배치. 3.6 단계에 설명 된 대로 회전 주기를 계속 합니다. 4. 치료 종양의 작은 분자 억제제와 조각 치료 중간에 화합물의 필요한 농도 준비 합니다. 일반적으로, 셀 문화에서 측정 하는 IC50s에 비해 10 높은 약물 농도 조직 조각에서 대상 억제를 달성 하기 위해 필요 합니다. 불특정 세포 독성을 방지 하려면 각 화합물에 대 한 최소 유효 농도를 농도의 범위를 테스트 합니다. 여기, 우리는 0.1-1 테스트 PI3K/mTOR 억제제 dactolisib 및 0.05-0.5 µ M의 murine NSCLC 슬라이스에 MEK 억제제 selumetinib µ M. 6 잘 플레이트에 희석된 약물 또는 DMSO 또는 다른 차량 제어와 미디어의 2.5 mL를 추가 합니다. 우물에 티타늄 격자를 놓습니다. 3.6 단계에서 설명한 대로 격자에 조직 조각을 놓습니다. 조직 고정 및 파라핀 블록 섹션 5에에서 설명 된 대로 조각 처리 24 h. 진행 차량 또는 약물 치료를 수행 합니다.참고: 약물 치료의 기간 최적화할 수 있습니다 실험의 목표에 따라 조직 기능 현장에 문화 기간 동안 분석 유지 조직 조각 수를 고려. 5. 고정 및 조직 조각 처리 요 0 h 참조 또는 PBS에 배어 필터 종이에 교양된 슬라이스를 조심 스럽게 들어올립니다. 이렇게 하려면 10 cm 접시에 PBS의 2-3 mL를 추가 하 고 PBS에 슬라이스 플 로트 보자 ‘생선’ 그것 밖으로 집게의 쌍을 가진 필터 종이에 슬라이스를 올려서. 필터 종이 histocassette로 전송 하 고 가시 후속 처리 단계 (그림 1D) 분할의 위치를 표시 하려면 조직 조각 위에 희석된 되며 (이온을 제거 된 물에 1:1)의 한 방울을 추가 합니다. 카세트, 닫고 4% 중립 버퍼링된 말린 솔루션으로 그것을 전송 합니다. 4 ° c.에 하룻밤 조직 수정참고: 필터 종이 위에 슬라이스를 삽입 하는 동안에 분할의 맨 위 섹션 위쪽; 직면 있는지 확인 이 단면 및 분석 단계 6.3에에서 설명 된 대로 위쪽, 중간, 및 조각의 아랫부분을 따라. 다음 날, 70%에 카세트를 전송 EtOH, 즉시 파라핀 포함 조직 처리 단계를 계속 진행. 조직 처리 전에 씻는 histocasettes 100% EtOH 2 각 10 분 x. 이 경우에, 전자 레인지의 역을 사용 하 여 조직 처리에 대 한. 1mm 조직 두께에 사용 되는 프로그램을 선택 하 고 설명서 (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf)에서 제공 하는 지침을 따릅니다.참고: 다른 조직 가공 기계를 사용 하 여 때 얇은 조직 샘플에 대 한 적합 한 프로그램을 사용 합니다. 파라핀 포함 한 histocassette 열고 메스를 사용 하 여 필터 종이에서 슬라이스를 조심 스럽게 들어올립니다. 필터 종이 삭제 하 고 액체 파라핀을 포함 하는 금형에는 슬라이스를 전송. 예를 들면 무게로 평면, 단면도 되도록 포함 형의 하단에 대 한 조직을 누릅니다. 금형의 위에 histocasette의 하단 부분, 30 분, 차가운 머리에 몰드 식 놓고 파라핀 블록에서 금형을 분리 합니다.참고: 수평 포함 하는 대신, 그것은 수직으로 직 립 위치에 조각을 배치 하 여 종양 슬라이스를 포함 수. 세로 섹션 쉽게 생존 또는 단일 섹션 25에 기능 마커 식에 기온 변화도의 분석을 허용합니다. 가로 포함 된 조각으로 그라데이션 분석 단계 6.2에서에서 설명한 단면 파라핀을 필요 합니다. 6. 처리 및 분석의 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직 톰을 사용 하 여 FFPE 직물 조각 구획의 4 µ m 얇은 섹션을 준비 합니다. 단면 때 조정 블록의 각 블록의 표면이 블레이드; 기준 가로 방향 이것은 조직에 걸쳐도 섹션을 얻을 필요가 있다. 교양된 분할 영역에 걸쳐 조각, 또는 바이오 마커 식에서 그라디언트 잠재적인 문화 유도 생존 그라데이션, 세포 이동의 캡처를 사용 하려면 섹션에서에서 수집 조직 조각의 각의 위쪽, 가운데 및 아래쪽 레이어 개체 슬라이드에 로 아래 설명 했다. 유리 슬라이드의 상단 부분에 먼저 파라핀 끼워 넣어진 조직 조각의 순차 조직 단면도 수집 합니다. 계속 중간 유리 슬라이드 (그림 1E)의 하단 부분 뒤에 더 깊은 조직 층의 섹션을 수집 합니다.참고: 3 개의 단면도 유리 슬라이드에 맞게 손질 멀리 임베디드 조직 조각을 둘러싼 파라핀의 초과. 37 ° C에서 건조 하룻밤 섹션을 허용 하 고 아래 설명 된 대로 H & E 염색 또는 immunohistochemistry 진행.참고: antigenicity의 손실 FFPE 섹션 시간의 연장된 기간에 대 한 높은 온도에서 저장 하는 경우 발생할 수 있습니다. 파라핀 섹션은 4 ° C에 저장 하는 것이 좋습니다 그리고 IHC 분석 단면 후 6 개월 이내에 실행 되어야 한다. H & E 염색, deparaffinize 및 파라핀 섹션을 다음과 같이 rehydrate: 크 실 렌 3 x 5 분, 100% EtOH 3 x 1 분, 96% EtOH 2 x 1 분, 70% EtOH 1 x 1 분, 그리고 이온된 수 2 1 분 x. 10 분, 갓 필터링된 되며 솔루션에서 섹션을 품 어 및 산 성 알코올에 수돗물 5 분 딥에 대 한 섹션을 실행 하는 아래 세척 (1% HCl 70 %EtOH에서) 2 번, 그리고 5 분 뒤에 2 분에 대 한 0.5% 오신 가진 외피에 대 한 수돗물을 실행 하는 아래 세척에 대 한 . 다음과 같이 알코올 및 자일 렌 솔루션에 슬라이드를 immersing 하 여 섹션을 탈수 오신 단계에 따라: 96% EtOH 2 x 15에 대 한 s, 100% EtOH 3 x 30에 대 한 s, 크 실 렌 3 x 1 분. 마지막으로, 크 실 렌 기반 설치 매체에 섹션을 포함 합니다. 7. 조직의 생존 및 Biomarker 식의 분석 H & E 스테인드 슬라이드 스캐너를 사용 하 여 전체 슬라이드 검사를 생성 하 여 높은 해상도 이미지를 취득 합니다. 조직 생존 능력을 평가 하는 조각의 위쪽, 가운데 및 아래쪽 섹션을 나타내는 조직 검사에서 스냅샷 촬영. 수동으로 사진 조작 소프트웨어를 사용 하 여 MATLAB를 사용 하 여 괴 사 성 영역의 정량화 다음 조직의 괴 사 성 영역에 마스크를 그립니다. 우리의 이전 연구 (Närhi 그 외 여러분, 그림 S2B 와 C)26일 가까운 0 h 조각에 비해 다른 시간 포인트 재배 조각의 상대 생존 능력을 계산 합니다. 마찬가지로, 잠재적인 내부 슬라이스 생존 그라디언트 교양 조각의 위쪽, 가운데 및 아래쪽 섹션에서 생존 능력을 측정 하 여 평가 하 고 가장 가까운 0 h 슬라이스에 각 섹션의 상대 생존 능력 계산.참고: 동안 murine NSCLC 조각의 단순한 재배 회 저 성 세포 죽음을 유도, 비보 전 문화 조건에 생물학 응답 종양 조직에 따라 다릅니다. 예를 들어 HIF1α, 응급실, 및 f 4/80에 의해 표시 하는 세포에서 그라디언트 유 방 암 모델25에서 파생 된 필터 지원 슬라이스 문화에서 발견 했다. 따라서, H & E-로 교양 조각의 IHC 기반 분석 각 조직의 유형에 대 한 고려 필요. IHC 파라핀 섹션에 수행 합니다. 다음 IHC 프로토콜 시작 지점 이며 다른 항 체에 대 한 최적화를 더 요구 한다. 짧게, deparaffinize 및 파라핀 섹션을 다음과 같이 rehydrate: 크 실 렌 3 x 5 분, 100% EtOH 3 x 1 분, 96% EtOH 2 1 분, 70% x EtoH 1 1 분 및 이온된 수 2 x x 1 분에 대 한. 항 원 epitopes를 노출, 10 m m 구 연산 산 성 pH 6 PT 모듈에서에서 사용 하 여 열 중재 항 원 검색을 수행 하려면 뒤 정상 염소 혈 청 (NGS) 주위 온도 (21-23 ° C)에서 30 분 동안 1 x PBS에서 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 10% 차단. BSA는 1%와 5% 희석 1 차적인 항 체를 품 어 NGS 주위 온도에 1-2 h에 대 한 1 x PBS에. 30 분 뒤에 3, 3 ‘-Diaminobenzidine (한 덩어리)를 사용 하 여 탐지 하는 주위 온도에 대 한 안티 토끼 2 차 항 체로 품 어. 섹션 30 s, 및 같이 알코올 및 자일 렌 솔루션에 슬라이드를 immersing 하 여 탈수 뒤 5 분 동안 수돗물에 세척 (이온을 제거 된 물에 1시 10분 희석) hematoxylin와 counterstained는: 70% EtOH 1 x, 96% EtOH 2 x, 100% EtOH 3 x, 크 실 렌 3 x ( 1 분 각 단계). 마지막으로, 크 실 렌 기반 설치 매체에 섹션을 포함 합니다. IHC 스테인드 슬라이드의 전체 슬라이드 검사를 취득 하 고 확대 비율 1: 4를 사용 하는 이미지 뷰어를 사용 하 여 이미지를 TIFF로 ImageJ를 사용 하 여 quantifications를 수행 합니다.참고:로 스캐너 대신, 20 X 40 X 확대에서 미세한 이미지 quantifications에 대 한 취득 될 수 있다. 이미지 확대; 측정할 수 표시에 따라 선택 될 수 있다 높은 확대 이미지는에 권장 핵 얼룩 세포질 또는 막 마커 20 X 이미지를 사용 하 여 양이 정해질 수 있다. 핵 감 적의 정량화,이 경우 NKX2-1 식, 각 이미지 피지 ImageJ를 사용 하 여 16 비트 이미지를 변환 및 이미지 분석에 대 한 이미지를 업로드. 이미지 분석 파이프라인 분석에 따라 사용자 지정 합니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 다음 파이프라인 NKX2-1 긍정적인 핵의 정량화에 대 한: 식별 기본 개체 | 개체 강도 측정 | 개체를 필터링 (최소 값 = 0.0025) | Math. 계산 결과 DAB 스테인드 핵 핵의 총 수의 백분율로 표현 됩니다.