Mise en place et l’analyse de la tumeur tranche Explants comme une condition préalable à des tests de Diagnostic

Toutes les expériences de souris décrits dans cette étude ont été réalisés en suivant les lignes directrices de la Conseil National finlandais de Animal Experimentation et ont été approuvés par le Comité des animaux expérimentaux de l’Université d’Helsinki et de l’État Provincial Bureau du sud de la Finlande (licence numéro ESAVI/9752/04.10.07/2015). 1. les préparations avant tranchage Préparez les matériaux suivants : vibratome porte-échantillon, vibratome tampon plaque de culture de 10 cm, plaque 24 puits, pipette 10 mL, plateau, garçon de pipette, sac à déchets, 70 % EtOH dans un tube de 50 mL pour désinfecter les instruments et la colle tissu. Préparer le vibratome : essuyer le porte-lame avec 70 % EtOH, fixez une lame neuve et réaliser un dispositif vibrocheck conformément aux instructions fournies dans le manuel (http://photos.labwrench.com/equipmentManuals/10103-3895.pdf).Remarque : Il est important d’effectuer l’étape du dispositif vibrocheck, car il réduit au minimum la déviation verticale de la lame et assure des tranches de bonne qualité. Remplir chaque puits de la plaque 24 puits avec 1 mL de Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) additionné de 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine (HBSS + P/S) ; maintenir la plaque sur la glace. Préparer le milieu de culture de F12 additionné de 100 U/mL la pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine, glutamax de 2 mM, 22 mM de glucose et 10 % sérum fœtal (SVF).NOTE : Tranche milieu de culture et de facteur de croissance des suppléments de tumeur peuvent varier selon le tissu de tumeur25. Préparer la quantité nécessaire de F12 moyen pour le traitement de la toxicomanie, à l’aide de la même composition, comme indiqué au point 1.4, mais en omettant la FBS.Remarque : Étant donné que les facteurs de croissance dans le sérum peut affecter la signalisation oncogènes dans les tranches, un milieu sans sérum est recommandé pour études de perturbation à court terme drogue sur des tranches de la tumeur. Si les cultures de tranche à long terme sont analysés, il est important d’abord évaluer l’effet du milieu sans sérum sur la viabilité des tissus et l’expression de marqueur tumoral spécifique dans les cultures non traitées tranche. 2. perception des poumons avec tumeur Euthanasier une souris de tumeur-roulement par dislocation cervicale quand il montre des symptômes de la respiration difficile et perte de poids.NOTE : CO2-médiation d’euthanasie est connue pour induire des conditions hypoxiques dans les poumons, qui peuvent avoir un effet sur la viabilité de la tranche ou oncogènes activités par le biais de susciter une réponse à l’hypoxie. Étirer la souris euthanasiée sur un couvercle de styromousse en insérant des aiguilles 30 G à 4 pattes, pour que la poitrine est exposée. Fend la peau de l’abdomen vers la poitrine et jusqu’à la région du cou. Ciel ouvert la cage thoracique et ensuite le diaphragme pour exposer les poumons et le cœur. Garder les ciseaux en position inclinée afin d’éviter des lésions tissulaires. Disséquer les poumons avec tumeur avec le coeur et les placer dans un tube de 50 mL contenant 30 mL de glacee HBSS + P/S ; maintenir le tube glacé et passer à l’étape suivante aussi rapidement que possible.NOTE : Retards dans le traitement des tumeurs du poumon peuvent modifier les fonctions oncogéniques, par exemple activités de la voie de signalisation. 3. génération de tranches de tumeur poumon de coupe de précision Transférer les poumons avec tumeur HBSS + P/S dans une plaque de culture de tissu de 10 cm gardée à l’intérieur d’une hotte laminaire. Séparer les lobes du poumon à l’aide de pinces et ciseaux stériles et sélectionnez les lobes avec des tumeurs sur la surface à couper.NOTE : Tumeurs > 3 mm de taille ne conviennent pas pour le tranchage. Depuis les tissus pulmonaires normales entourant les compromis de grosse tumeur le découpage en raison des différences de rigidité des tissus, tissu tumoral subissant le tranchage doit être séparé loin les tissus normaux, tels qu’une région de tumeur défrichées fait face à la lame vibratome. Générer une surface plate tissu de la pièce par une partie de la Coupe du tissu pulmonaire normale qui entoure la tumeur avec un scalpel stérile et plonger la lame plate dans une goutte de colle cyanoacrylate. Monter ce côté sur le porte-échantillon du vibratome sorte que la tumeur trouve la lame en position verticale. Laissez la colle sécher pendant 2 à 3 min.Remarque : Les tissus pulmonaires normales collées sur le porte-échantillon n’interfèrent pas avec la tumeur tissulaire tranchage et tranchage est arrêté avant d’atteindre le tissu normal. Le tissu tumoral se penche parfois à cause de la texture spongieuse du tissu pulmonaire normale collée sur le porte-échantillon, compromettre sa position verticale. Dans ce cas, coller un morceau de tissu de soutien supplémentaires pulmonaires normales à côté les tissus pulmonaires normales prémontés pour retenir la tumeur en position verticale (Figure 1 a iii). Placez le porte-échantillon dans la cuve à tampon métallique et remplissez-le avec froid HBSS + P/S jusqu’à ce que le tissu est plongé dans la mémoire tampon. Placez le bac tampon métallique sur le bain de glace blanche et ajoutez la glace afin de refroidir le tissu tout en découpage. Fixer la baignoire de glace blanche sur le vibratome. Sélectionnez les paramètres appropriés tranchage : amplitude allant de 2,5 à 2,8, découpage de vitesse entre 0,10-0,14 ms et une épaisseur de coupe allant de 160 – 250 µm.NOTE : Tranchage paramètres doivent être ajustés selon la dureté du tissu. Tissu dur est plus facile à trancher que les tissus plus doux et plus douces tissus nécessite trancher avec une vitesse plus faible (0,1 – 0,12 ms) et l’amplitude plus élevée (2,6-2,8). Une tumeur de grande 4 – 5 mm fournit généralement 15 à 20 tranches de 200 µM d’épaisseur. Pour la culture à court terme, les tumeurs murines peuvent être tranchés dans des conditions semi stériles à l’extérieur de la hotte laminaire. Cependant, tumeurs cliniques devraient toujours être tranchés à l’intérieur d’une classe II biosécurité laminaire des bois pour éviter l’exposition à des agents infectieux possibles dans le tissu humain. À l’aide d’une pince stérile, recueillir les tranches dans 1 mL de HBSS dans puits séparés d’une plaque de 24 puits qui s’est tenue sur la glace, étroitement suivi de l’ordre dans lequel les tranches sont découpés en tranches. Marquez chaque puits de la plaque 24 puits selon le plan expérimental. Par exemple, mark séquentielle puits d’une plaque 24 puits comme points de temps de culture ou 0 h, contrôle du véhicule (C), drogues traitée (T) (Figure 1 b ii).Remarque : Ne pas déranger ou tirer le tissu de la tumeur tout en collectant une tranche, car cela modifiera l’orientation de la tumeur par rapport à l’angle de la lame, conduisant à des incohérences dans l’épaisseur des tranches ultérieures. Lorsque toutes les tranches sont collectées, les transférer sur des grilles de titane (2-3 tranches par grille) placés dans la plaque de 6 puits contenant 2,5 mL de milieu de culture par puits. Veillez à ce qu’aucune bulle d’air ne se forment entre la grille de titane et le milieu. Pour charger une tranche sur la grille, garder la plaque 6 puits en position inclinée afin qu’une partie du milieu recouvre la grille et placer la tranche dans le milieu de la grille ; utiliser forceps pour répandre la tranche si elle boucles. Charger les plaques 6 puits sur l’unité d’incubation rotatif placé dans un incubateur humidifié maintenu à 37 ° C avec l’air de 95 % et 5 % de CO2et commencer le cycle de rotation (Figure 1 , i-ii).Remarque : Les grilles métalliques et les plaques 6 puits doivent être précisément poids équilibré avant d’allumer l’appareil rotatif. Il est important de placer les tranches dans le milieu de la grille afin qu’ils entièrement alternent entre l’air et les phases liquides pendant les cycles de rotation. Les tranches qui sont placés trop bas ou trop élevé ne sont pas convenablement exposés à l’oxygène ou de nutriments (Figure 1 j’ai), qui peuvent compromettre la viabilité des tissus. Il est important de suivre la position de la tranche sur la grille pendant la culture, comme la tranche peut parfois glisser vers le bas. Si cela se produit dans 1 à 2 h de l’apparition de la culture, corriger sa position et notez que cet exemple peut être endommagé. Les tranches qui sont mispositioned pour une longue période de temps devraient être jetés, comme la viabilité des tissus est significativement affectée par une mauvaise oxygénation et l’apport en nutriments. Recueillir une tranche de tissus adjacente pour les tranches cultivés comme une 0 h, inculte, référence. Recueillir des tranches de référence au moins trois pour représenter le haut, milieu et au centre du tissu étant tranché. Difficulté du processus et tranches de 0 h immédiatement comme décrit en 5.1.Remarque : Si le nombre de tranches est limité, par exemple, si plusieurs traitements composés ou répétitions techniques sont effectuées, les comparaisons de chaque échantillon traité avec ses voisins échantillon 0 h peuvent être difficiles. Dans ce cas, utilisez la tranche de 0 h le plus proche (au moins 400 – 600 µm apart) pour évaluer la viabilité des tissus relative ou l’expression de marqueurs pertinents au début de la culture. Pour la culture à long terme, reconstituer le milieu de culture tous les jours. Soulevez la grille contenant les tranches de tissu à l’aide d’une pince stérile et placez-le dans un puits vide de la plaque 6 puits ; remplacer 70 % de la moyenne avec milieu de culture frais et placez la grille dans le milieu. Continuer le cycle de rotation, comme l’a expliqué à l’étape 3.6. 4. traitement des tranches de tumeur de petites molécules inhibitrices Préparer les concentrations requises de composés dans le milieu de traitement. En règle générale, une plus forte concentration de drogue 10 fois par rapport à la IC50s mesurée dans des cultures cellulaires est nécessaire pour réaliser inhibition de cible dans des tranches de tissu. Pour éviter la cytotoxicité non-spécifique, tester une gamme de concentrations afin d’obtenir une concentration minimale efficace pour chaque composé. Ici, nous avons testé 0,1 – 1 µM de la dactolisib d’inhibiteurs du PI3K/mTOR et de 0,05 à 0,5 µM de la MEK inhibiteur selumetinib sur des tranches NSCLC murines. Ajouter 2,5 mL de médias avec le médicament dilué ou DMSO ou un autre contrôle de véhicule dans la plaque de 6 puits. Placer les plaques de titane dans les puits. Déposer les tranches de tissu sur les grilles comme indiqué au point 3.6. Effectuer des traitements de véhicule ou de la drogue pendant 24 h. Procédez avec fixation du tissu et du traitement des tranches dans des blocs de paraffine comme décrit à l’article 5.NOTE : Durée du traitement médicamenteux peut être optimisée selon l’objectif de l’expérience, en tenant compte de la capacité des tranches de tissu de conserver in situ des fonctions tissu analysées au cours de la période de culture. 5. fixation et transformation des tranches tissu Soulever délicatement la référence inculte 0 h ou cultivée tranche sur un papier filtre imbibé dans du PBS. Pour ce faire, ajouter 2 à 3 mL de PBS dans une plaque de 10 cm, laisser le flotteur tranche dans du PBS et « repêcher » il en soulevant la tranche sur le papier filtre avec une paire de pinces. Transférer le filtre en papier dans un histocassette et ajouter une goutte de l’hématoxyline dilué (1:1 dans l’eau désionisée) sur le dessus de la tranche de tissu pour marquer visiblement la position de la tranche au cours des étapes ultérieures de traitement (Figure 1). Fermez la cassette et transférer dans une solution de formol tamponné neutre de 4 %. Fixer les tissus pendant la nuit à 4 ° C.Remarque : En plaçant la tranche sur le dessus du papier filtre, assurez-vous que la partie supérieure de la tranche est vers le haut ; Cela est nécessaire pour suivre le haut, au milieu et la partie inférieure d’une tranche lors de coupes et de l’analyse comme indiqué au point 6.3. Le lendemain, transvaser les cassettes dans 70 % EtOH et immédiatement passer à l’étape de traitement de tissus enrobage de paraffine. Avant le traitement de tissus, laver la histocasettes à 100 % EtOH 2 x pour 10 min chacun. Dans ce cas, utilisez une station micro-ondes pour le traitement des tissus. Sélectionnez le programme utilisé pour 1 mm d’épaisseur tissulaire et suivez les instructions fournies dans le manuel (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf).Remarque : Lorsque vous utilisez d’autres machines de traitement des tissus, utilisez le programme approprié pour les échantillons de tissu mince. Pour l’enrobage de paraffine, ouvrir un histocassette et utiliser un scalpel pour soulever délicatement la tranche du papier filtre. Jeter le papier filtre et transférer la tranche dans un moule contenant de la paraffine liquide. Appuyez sur le tissu contre le fond du moule encastrement, par exemple avec un poids plat, afin d’assurer la même section. Placez la partie inférieure de la histocasette sur le dessus du moule, laissez refroidir le moule sur une pate froid pendant 30 min et séparer le moule dans le bloc de paraffine.Remarque : Comme alternative à l’intégration horizontale, il est possible d’incorporer la tranche de tumeur verticalement en positionnant la tranche en position verticale. Sections verticales permettent facilement analyse des gradients de viabilité ou l’expression fonctionnelle de marqueur sur un seul article 25. Analyse de gradient avec tranches horizontalement intégrée nécessite paraffine sectionnement comme indiqué au point 6.2. 6. traitement et analyse de fixés au formol et inclus en paraffine (FFIP) tissus Préparer 4 coupes minces µm des blocs FFIP tissu tranche à l’aide d’un microtome. Lorsque le sectionnement, régler l’angle du bloc pour que la surface du bloc est orientée horizontalement par rapport à la lame ; Cela est nécessaire pour obtenir la même des sections dans le tissu. Pour activer capture d’un gradient de potentiel viabilité induite par la culture, la migration cellulaire à travers les tranches, ou des dégradés dans l’expression de biomarqueurs dans l’ensemble des tranches, recueillir des sections des couches haut, Centre et au bas de chacun de la tranche de tissu sur les diapositives de l’objet tel qu’expliqué ci-dessous. Recueillir des sections de tissu séquentielle de la tranche de tissus inclus en paraffine tout d’abord sur la partie supérieure des lames de verre. Poursuivre la collecte les sections des couches tissulaires plus profondes au milieu suivi de la partie inférieure des lames de verre (Figure 1E).Remarque : Pour tenir compte de trois sections sur une lame de verre, couper l’excédent de paraffine qui entourent la tranche de tissu incorporé. Laisser les sections sécher pendant la nuit à 37 ° C et procéder à la coloration H & E ou immunohistochimie tel que décrit ci-dessous.NOTE : Perte d’antigénicité peut se produire lorsque les sections FFIP sont stockées à des températures élevées ou pendant de longues périodes de temps. Sections de paraffine sont recommandées doivent être conservés à 4 ° C, et IHC analyses doivent être effectuées dans les 6 mois après lamélisation. Pour une coloration H & E, Déparaffiner et réhydrater les sections de paraffine comme suit : xylène 3 x pendant 5 min, 100 % EtOH 3 x pendant 1 min, 96 % EtOH 2 x pendant 1 min, 70 % EtOH 1 x 1min et l’eau désionisée 2 x pendant 1 min. Incuber les sections dans une solution fraîchement filtrée hématoxyline pendant 10 min et laver sous eau courante pendant 5 min. Dip les sections dans l’alcool acide (1 % HCl dans 70 % EtOH) pour 2 heures et laver sous l’eau courante pendant 5 min, suivie d’une incubation avec 0,5 % éosine pour 2 m dans. Après l’étape de l’éosine, déshydrater les sections en immergeant les lames dans des solutions d’alcool et de xylène, comme suit : 96 % EtOH 2 x pendant 15 s, 100 % EtOH 3 x pour 30 s, xylène 3 x pendant 1 min. Enfin, incorporez les sections dans un milieu de montage à base de xylène. 7. analyse de la viabilité des tissus et l’Expression de biomarqueurs Acquérir des images à haute résolution en générant des scans de la diapositive entière de H & E-lames à l’aide d’un scanner. Pour évaluer la viabilité des tissus, prendre des instantanés des scans de tissu représentant les sections supérieur, moyen et inférieur des tranches. À l’aide du logiciel de photo manipulateur, dessiner manuellement de masques sur les zones nécrotiques des tissus, suivies par la quantification des régions nécrotiques à l’aide de MATLAB. Calculer la viabilité relative des tranches labourées destinées à différents moments par rapport à la tranche de 0 h le plus proche comme fait dans notre précédente étude (Närhi et al., Figure S2B et C)26. De même, évaluer les gradients de viabilité potentiel intra-tranche en quantifiant la viabilité dans la section supérieur, moyen et inférieur d’une tranche de culture et calculer la viabilité relative de chaque article à sa tranche plus proche de 0 h.Remarque : Alors que la simple culture de tranches NSCLC murins induit la mort des cellules nécrotiques, réponses biologiques à l’ex vivo des conditions de culture varient selon le tissu tumoral. Par exemple, gradients dans HIF1α, ER et les macrophages marqués par F4/80 ont été détectées dans la tranche de filtre pris en charge cultures dérivées d’un modèle de cancer du sein25. Par conséquent, H & E – ainsi que des analyses axées sur les IHC de tranches cultivées ont besoin à prendre en considération pour chaque type de tissu. Effectuer IHC sur les sections de paraffine. Le protocole suivant d’IHC est un point de départ et exige d’autres optimisation pour les autres anticorps. En bref, Déparaffiner et réhydrater les sections de paraffine comme suit : xylène 3 x pendant 5 min, 100 % EtOH 3 x pendant 1 min, 96 % EtOH 2 x pendant 1 min, 70 % EtoH 1 x pour 1 min et désionisée 2 x pendant 1 min. Pour exposer les épitopes antigéniques, effectuer la recherche d’antigène induite par la chaleur à l’aide d’acide citrique 10 mM à pH 6 dans un module de PT, suivi en bloquant avec 1 % Bovine Serum Albumin (BSA) et 10 % de sérum de chèvre Normal (NGS) dans du PBS 1 x pendant 30 minutes à température ambiante (21-23 ° C). Incuber l’anticorps primaire dilué dans BSA 1 % et 5 % NGS dans du PBS 1 x, soit pour 1 – 2 h à température ambiante. Incubation avec l’anticorps secondaire anti-lapin, pendant 30 min à température ambiante, suivie de détection à l’aide de 3, 3′-Diaminobenzidine (DAB). Sections sont Eosine avec l’hématoxyline (dilué dans l’eau désionisée à 01:10) pour 30 s et le laver sous l’eau courante pendant 5 min, puis par déshydratation en immergeant les lames dans des solutions d’alcool et de xylène, comme suit : 70 % EtOH 1 x, 96 % EtOH 2 x, 100 % EtOH 3 x, xylène 3 x ( 1 min de chaque étape). Enfin, incorporez les sections dans un milieu de montage à base de xylène. Acquérir des scans de la diapositive entière de lames IHC, exportez-les sous forme d’images à un rapport de grossissement de 1:4 en utilisant l’en utilisant une visionneuse d’images TIFF et effectuer les analyses quantitatives utilisant ImageJ.NOTE : comme une alternative au scanner, des images microscopiques à 20 X ou 40 X grossissement peut être acquis pour les analyses quantitatives. Grossissement de l’image peut être choisi selon le marqueur pour être quantifiés ; images de fort grossissement sont recommandés pour la coloration des noyaux, tandis que cytoplasmique ou marqueurs membranaires peuvent être quantifiées à l’aide de 20 images X. Dans ce cas pour la quantification de marqueurs nucléaires, NKX2-1 expression, convertissez chaque image images 16 bits à l’aide de Fidji-ImageJ et télécharger des images pour l’analyse de l’image. Personnaliser le pipeline de l’analyse d’image selon l’analyse. Dans ce protocole, utiliser le pipeline suivant pour la quantification des noyaux positifs NKX2-1 : identifier les principaux objectifs de | Mesurer l’intensité de l’objet | Filtrer les objets (valeur minimale = 0,0025) | Calculer les math. Les résultats sont représentés sous forme de pourcentages des noyaux colorés à DAB relatif au nombre total de noyaux.