Structure cristalline du domaine N-terminal du récepteur à la Ryanodine de Plutella xylostella

Récepteurs de la ryanodine (RyRs) sont des canaux ioniques spécifiques qui négocient la pénétration des ions Ca^{2 +} à travers les membranes du réticulum sarcoplasmique (RS) dans les cellules musculaires. Par conséquent, ils jouent un rôle important dans l’excitation contraction processus de couplage. Dans sa forme fonctionnelle, RyR assemble comme un homo-tétramère ayant une masse moléculaire de > 2 MDa, avec chaque sous-unité comportant des résidus d’acides aminés ~ 5000. Chez les mammifères, il existe trois isoformes : RyR1 – type de muscle squelettique, le muscle cardiaque type de RyR2 – et RyR3-ubiquitaire exprimés dans différents tissus¹.

Chez les insectes, il y a qu’un seul type de RyR, qui s’exprime dans le tissu musculaire et nerveuse². RyR insecte est plus proche de mammifères RyR2 avec une identité de séquence d’environ 47 %³. Diamide insecticides ciblant RyR de lépidoptères et coléoptères ont été développés et commercialisés par grandes entreprises telles que Bayer (flubendiamide), DuPont (chlorantraniliprole) et Syngenta (cyantraniliprole). Depuis sa création relativement récente, diamide insecticides sont devenus un de la classe plus forte croissance d’insecticides. Actuellement, les ventes de ces trois insecticides par an ont franchi les 2 milliards de dollars avec un taux de croissance de plus de 50 % depuis 2009 (Agranova).

Des études récentes ont signalé l’apparition d’une résistance chez les insectes après quelques générations d’utilisation de ces insecticides^4,5,6,7,8. Les mutations de résistance dans le domaine transmembranaire de RyRs de la teigne des crucifères (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) et aux emplacements correspondants à la mineuse de la tomate, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) montrent que la région pourraient être impliqués dans la liaison de diamide insecticides comme cette région est connue pour être critique pour le processus de blocage du canal^4,8,9. Malgré des recherches approfondies dans ce domaine, les mécanismes moléculaires exacts de diamide insecticides demeurent insaisissables. En outre, on ignore si les mutations de résistance influent sur les interactions avec les diamides directement ou de façon allostérique.

Des études antérieures ont révélé la structure de plusieurs domaines de RyR d’espèces de mammifères et la structure de RyR1 mammifères pleine longueur et RyR2 par cristallographie aux rayons x et microscopie de cryo-électronique, respectivement^{10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21} . Mais jusqu’ici, aucune structure d’insecte RyR n’a été signalée, qui nous interdit de saisir la complexité moléculaire de la fonction des récepteurs ainsi que les mécanismes moléculaires d’action insecticide et le développement de la résistance aux insecticides.

Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole généralisé pour la caractérisation du domaine β-trefoil N-terminale du récepteur à la ryanodine de la teigne des crucifères, un ravageur qui infectent les crucifères cultivées dans le monde entier²². La construction a été conçue selon le lapin publiées RyR1 NTD crystal structures^23,24et la cryo-EM modèles structuraux^{16,17,18,19, 20 , 21}. il s’agit de la première structure à haute résolution pour insecte RyR, qui révèle le mécanisme de blocage du canal et fournit un modèle important pour le développement des insecticides spécifiques à l’aide de conception de médicaments basée sur la structure. Pour l’élucidation de la structure, nous avons utilisé la cristallographie aux rayons x, qui est considérée comme le « gold standard » pour la détermination de structure de protéine à près de résolution atomique. Bien que le processus de cristallisation est imprévisible et demande beaucoup de travail, le présent protocole étape par étape aidera les chercheurs à exprimer, de purifier et de caractériser les autres domaines d’insecte RyR ou tout autres protéines en général.