Isolierung, Fixierung und Immunfluoreszenz Imaging der Maus Nebennieren

Immunohistochemistry ist eine Technik zur Erkennung von gewebeanteile mit dem Einsatz von Antikörpern gegen spezifische zelluläre Moleküle und anschließende befleckenden Techniken der konjugierten Antikörpern¹zu erkennen. Diese immunhistochemische Verfahren erfordert spezielle Fixierung und Verarbeitung von Geweben, die für das Antigen oft empirisch ermittelt werden, Gewebe und Antikörper verwendet². Die Fixierung ist entscheidend für den “ursprünglichen” Zustand des Gewebes und damit Erhaltung intakten zellulären und subzellulären Strukturen und Expressionsmuster beizubehalten. Weitere sind Verarbeitung und Einbettung Verfahren erforderlich, um das Gewebe vorbereiten, schneiden in dünne Scheiben schneiden, die histologische Studien mit Immunohistochemistry verwendet werden.

Immunostaining kann mit chromogenen oder fluoreszierende Erkennung durchgeführt werden. Chromogene Erkennung erfordert die Verwendung eines Enzyms zu einem löslichen Substrat in eine unlösliche farbige Produkt umzuwandeln. Während dieses Enzym an der Antikörper erkennt das Antigen (Primärantikörper) konjugiert werden kann, ist es immer öfter an den Antikörper erkennen den primären Antikörper (d.h. der Sekundärantikörper) konjugiert. Diese Technik ist sehr empfindlich; Das farbige Produkt aus der enzymatischen Reaktion ist Photostabil und erfordert nur ein Hellfeld-Mikroskop für die Bildgebung. Jedoch kann chromogenen Immunostaining nicht geeignet wenn Sie versuchen, zwei Proteine zu visualisieren, die Co lokalisieren, da die Abscheidung einer Farbe kann die Ablagerung des anderen Maske. Im Falle von Co Färbung, hat Immunfluoreszenz mehr als vorteilhaft erwiesen. Das Aufkommen der Immunfluoreszenz wird zugeschrieben Albert Coons und Kollegen, die ein System zur Identifizierung von Gewebe-Antigene mit Antikörpern mit Fluorescein gekennzeichnet und visualisieren im geschnittenen Gewebe unter ultraviolettem Licht³entwickelt. Fluoreszenz-Detektion basiert auf einem Antikörper konjugiert mit einem Fluorophore, die nach Anregung Licht ausstrahlt. Da gibt es mehrere Fluorophore mit Emissionen bei verschiedenen Wellenlängen (mit keine oder nur geringe Überlappung), eignet sich diese Nachweismethode für die Studien von mehreren Proteinen.

Die Nebenniere ist ein gekoppelten Organ befindet sich oberhalb der Niere und zeichnet sich durch zwei embryologically verschiedene Komponenten von mesenchymalen Kapsel umgeben. Die äußeren Nebennierenrinde, abgeleitet von der mesonephric mittlere Mesoderm sondert Steroidhormone während die inneren Medulla, abgeleitet aus der Neuralleiste Katecholamine wie Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin produziert. Die Nebennierenrinde histologisch und funktional gliedert sich in drei konzentrische Zonen mit jeder Zone sezernierenden verschiedene Klassen von Steroid-Hormone: die äußeren Zona Glomerulosa (zG) produziert Mineralocorticoids, die Elektrolyt-Homöostase zu regulieren und intravasale Volumen; die mittlere Zona Fasciculata (zF), sondert direkt unterhalb der zG, Glukokortikoide, die die Stress-Reaktion durch die Mobilisierung der Energiespeicher Erhöhung der Plasma-Glukose zu vermitteln; und der inneren Zona Reticularis (zR), die synthetisiert sex Steroid Vorläufer (d. h. Dehydroepiandrosteron (DHEAS))⁴.

Einige Variationen in NNR Zonierung ist zwischen den Arten vorhanden: z. B. Mus Musculus fehlt der zR. Die einzigartige postnatale X-Zone des M. Musculus ist ein Überrest des fetalen Kortex zeichnet sich durch kleine Lipid-Armen Zellen mit acidophilen Cytoplasma⁵. Die X-Zone verschwindet in der Pubertät bei männlichen Mäusen und nach der ersten Schwangerschaft bei weiblichen Mäusen oder allmählich verkommt nicht gezüchtete Weibchen^6,7. Darüber hinaus markiert die schlängelung und Dicke der zG Exponate Variation zwischen den Arten, wie Organisation von peripheren Stamm- und Vorläuferzellen in und neben der zG. Die Ratte, im Gegensatz zu anderen Nagetieren verfügt über eine sichtbare undifferenzierte Zone (zU) zwischen dem zG und zF funktioniert als eine Stammzell-Zone und/oder eine vorübergehende Verstärkung Stammväter-Zone. Ob die zU einzigartig für Ratten ist oder einfach mehr prominent Cluster von Zellen organisiert ist unbekannt^8,9.

Zellen der Nebennierenrinde enthalten Lipid-Tröpfchen, die Cholesterin-Ester zu speichern, die als Vorläufer der alle Steroidhormone^10,11dienen.  Der Begriff “steroidgenese” definiert den Prozess der Produktion von Steroidhormonen aus Cholesterin über eine Reihe von enzymatischen Reaktionen, bei denen die Aktivität von steroidogenic Factor 1 (SF1), deren Ausdruck ein Marker für steroidogenic Potenzial ist. In der Nebenniere ist Sf1 Ausdruck nur in den Zellen der Hirnrinde¹²vorhanden. Eine interessante Studie fand den Ausdruck der endogene Biotin in NNR Zellen mit steroidogenic potenzielle¹³. Während dies kann die Ursache für einen höheren Hintergrund in Biotin/Streptavidin-basierte Färbung Methoden, durch die Erkennung von endogenen Biotin durch Antikörper konjugiert mit Streptavidin, könnte dieses Merkmal auch eingesetzt werden, um den steroidogenic unterscheiden Zellen aus anderen Populationen innerhalb der Nebenniere, d. h., Endothelzellen, Kapsel und Medulla Zellen.

Sympathische neuroendokrine Neuronen innerviert, zeichnet sich das Nebennierenmark durch basophile Zellen mit einem körnigen Zytoplasma, Adrenalin und Noradrenalin enthalten. Medulla Zellen sind aufgrund des hohen Gehaltes an Katecholaminen, die braunes Pigment nach Oxidation^{14 bilden}“chromaffin” benannt. Tyrosin-Hydroxylase (TH) ist das Enzym das katalysiert die Bandbreitenbegrenzung Schritt in der Synthese der Katecholamine und in der Nebenniere, äußert sich nur in der Medulla¹⁵.

Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll für die Isolierung der Maus Nebennieren, deren Verarbeitung für die Einbettung in Paraffin-Schnitt und eine Methode durchzuführen Immunfluoreszenz-Färbung auf Nebennieren Abschnitte um die zelluläre Arten bilden die Nebennierenrinde und Medulla. Dieses Protokoll ist ein Standard in unserem Labor für Immunostaining mit mehreren Antikörpern routinemäßig in unserer Forschung verwendet.