Cryosectioning simultanée de plusieurs cerveaux de rongeurs
Summary
Nous présentons ici un protocole visant à geler et l’article de tissus cérébraux de plusieurs animaux comme une alternative de gagner du temps aux cerveaux unique de transformation. Cela réduit la variabilité coloration en immunohistochimie et réduit d’imagerie et de temps cryosectioning.
Abstract
L’histologie et l’immunohistochimie sont des méthodes de routine d’analyse afin de visualiser l’anatomie microscopique et de localiser des protéines dans les tissus biologiques. En neurosciences, comme une pléthore d’autres domaines scientifiques, ces techniques sont utilisées. Immunohistochemistry peut être fait sur le tissu de diapositives montées ou sections flottantes. Préparation des échantillons montés sur glissière est un processus intensif de temps. Le protocole suivant pour une technique, appelée le Megabrain, réduit le temps nécessaire aux tissus du cerveau cryosection et Mont jusqu’à 90 % en combinant plusieurs cerveaux en un seul bloc congelé. En outre, cette technique réduit la variabilité observée entre tours, dans une vaste étude histochimique de coloration. La technique actuelle a été optimisée pour l’utilisation de tissus cérébraux de rongeurs dans les analyses immunohistochimique en aval ; Toutefois, il peut être appliqué à différents champs scientifiques qui utilisent cryosectioning.
Introduction
Nous présentons ici le protocole pour une nouvelle méthode, que nous appelons Megabrain, mis au point pour cryosection plusieurs rongeurs brains simultanément de méthodes immunohistochimiques en aval. Un Megabrain permet la production de diapositives individuelles contenant des tissus de plusieurs animaux. Cette technique a été optimisée pour des coupes coronales de 9 hémisphères de rat adulte ou 5 adultes cerveau complet, en même temps. Par conséquent, cette technique est plus applicable dans les études immunohistochimiques grand ou autres analyses effectuées sur les tissus cérébraux monté sur glissière d’une importante cohorte d’animaux.
Immunohistochemistry implique l’utilisation d’anticorps spécifiques dirigés contre les protéines d’intérêt de comprendre et de caractériser leur expression et les changements cellulaires dans des tissus spécifiques1,2,3. L’utilisation de l’immunohistochimie est répandue dans la recherche en neurosciences, entre autres disciplines scientifiques, en aidant à la compréhension moléculaire et cellulaire du cerveau4. Des études à grande échelle impliquant de nombreux animaux et sections du cerveau peuvent être les ressources et le temps intensif. Par conséquent, il y a une justification aux multiples facettes du développement de la Megabrain : pour réduire le temps passé à cryosectioning, de montage et de coloration des tissus, lors de l’utilisation par conséquent moins réactifs. En outre, la possibilité de rationaliser le processus et tacher les cerveaux multiples dans le même tour contribue à alléger la variabilité entre les lots, une limitation de l’immunohistochimie3de coloration. En outre, un Megabrain de sectionnement est une alternative de gain de temps au sectionnement des cerveaux de rongeurs congelés individuels et permet une comparaison rapide des tissus entre animaux ou même des groupes de traitement par des techniques de microscopie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il devrait être considéré au cours de cette procédure que la température de la Megabrain et ses environs doit être constamment surveillée pour éviter la décongélation et la recongélation des tissus. Le cerveau seulement s’éliminent du congélateur-20 ° C vers le haut à 3 fois comme chaque fois qu’il est touché et gauche dans le cryostat, avec une température plus chaude fluctuant, le tissu dégèle et regèle, causant une gelée comme texture et tissu anormal intégrité10. Par…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Fonds de soutien de Mission PCH appuyé la recherche signalée dans ce manuscrit. Les auteurs tiennent à remercier Daniel Griffiths pour prendre les images utilisées dans les chiffres.
Materials
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Sucrose, poly bottle 2.5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up. |
| 2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Tall-Form Beakers | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50° to +50°C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Razor Blade | Grainger | 4A807 | |
| Edge-Rite Microtome blades | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Microscope slides (1" frost) – white | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Dilute to 1X before use |
| 15 piece fine paint brushes | Amazon | B079J12ZRV | |
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. | Electron Microscopy Sciences | EMS065 |
Riferimenti
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