استخدام الإلكترون الرنين باراماجنيتيك في العينات البيولوجية في درجة الحرارة المحيطة و 77 ك
Summary
مطيافية إلكترون الرنين باراماجنيتيك (EPR) أسلوب لا لبس فيها لقياس الجذور الحرة. يسمح استخدام المسابير تدور الانتقائي للكشف عن الجذور الحرة في الأقسام الخلوية المختلفة. نحن نقدم طريقة عملية وفعالة لجمع العينات البيولوجية التي تسهل معالجة وتخزين ونقل عينات للقياسات الجيش الشعبي الثوري.
Abstract
كشف دقيقة ومحددة للأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) في الأقسام المختلفة من الخلايا والأنسجة وضروري لدراسة تنظم الأكسدة والاختزال إشارة في إعدادات البيولوجية. مطيافية إلكترون الرنين باراماجنيتيك (EPR) هو الأسلوب المباشر الوحيد لتقييم الجذور الحرة لا لبس فيه. ميزته هي أن يكشف المستويات الفسيولوجية للأنواع المحددة مع خصوصية عالية، ولكنه يتطلب التكنولوجيا المتخصصة وإعداد نموذج دقيق وضوابط ملائمة لضمان التفسير الدقيق للبيانات. هيدروكسيلاميني دوري تدور تحقيقات تتفاعل بشكل انتقائي مع فائق أكسيد أو الجذور الأخرى لتوليد إشارة نيتروكسيدي التي يمكن قياسها كمياً بالتحليل الطيفي الجيش الشعبي الثوري. المسابر نفاذية الخلية تدور وتدور المسابر المصممة لتتراكم سريعاً في الميتوكوندريا تسمح لتحديد تركيز أكسيد فائق في الأقسام الخلوية المختلفة.
في الخلايا المستزرعة، واستخدام 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine نفاذية الخلية (غروهارلم) جنبا إلى جنب مع ودون الخلية كتيمة فائق أكسيد الفاءق (الأحمق) المعالجة المسبقة، أو استخدام الخلية نفاذية شماعة-الهيئة العامة للسدود، يسمح التفريق بين من خارج الخلية من فائق أكسيد سيتوسوليك. 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido المتقدرية] كلوريد بيبيريدينيوم (ميتو-الإيقاع-ح) تسمح بقياس روس المتقدرية (الغالب فائق أكسيد).
يمكن أيضا تطبيق المسابير تدور والتحليل الطيفي الجيش الشعبي الثوري في فيفو النماذج. يمكن الكشف عن أكسيد فائق في السوائل خارج الخلية مثل الدم والسوائل السنخية، فضلا عن الأنسجة مثل أنسجة الرئة. يتم عرض عدة أساليب لمعالجة وتخزين الأنسجة للقياسات الجيش الشعبي الثوري وتقديم زيادة ونقصان (CPH) 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine عن طريق الحقن الوريدي مسبار فيفو. بينما يمكن إجراء القياسات في درجة حرارة الغرفة، العينات التي تم الحصول عليها من نماذج في المختبر و في فيفو يمكن أيضا تخزين في-80 درجة مئوية وتحليلها من قبل الجيش الشعبي الثوري في 77 ك. يمكن تخزين مستقرة أنابيب المتخصصة في-80 درجة مئوية وتشغيل ك 77 لتمكين عملية، تتسم بكفاءة، واستنساخه بطريقة تسهل تخزين ونقل عينات العينات.
Introduction
بينما تكتسي تدابير للأنواع الأكسجين التفاعلية والأكسدة هامة لدراسة الأمراض المتنوعة عبر جميع نظم الجهاز، الكشف عن الأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) يمثل تحديا سبب نصف العمر القصير وتفاعلية عالية. أسلوب رنين باراماجنيتيك (EPR) إلكترون هو الأسلوب الأكثر لا لبس فيها للكشف عن الجذور الحرة. تحقيقات تدور لها مزايا أكثر من المسابر الفلورسنت الأكثر استخداماً. على الرغم من المسابر الفلورية غير مكلفة نسبيا وسهلة الاستخدام وتوفير الكشف السريع وحساسة من روس، لديهم قيود خطيرة بسبب إشارات artifactual، وعدم قدرة على حساب تركيزات روس، ونقص عام في خصوصية1 .
لتسهيل استخدام الجيش الشعبي الثوري للدراسات البيولوجية، دول متنوعة تدور قد تم توليفها المسابير التي يمكن قياس مجموعة من الأنواع ذات الصلة بيولوجيا الجزئيات الحرة، فضلا عن بو2ودرجة الحموضة والأكسدة والاختزال32،، 45،،،من67. كما تم وضع الفخاخ تدور لالتقاط الجذور لم تدم طويلاً و adducts النموذج الطويل غلاء المعيشة، مما يسهل الكشف عن الجيش الشعبي الثوري8. يكون كل من الفئات (تحقيقات تدور وتدور الفخاخ) مزايا وقيود. فئة استخداماً من المسابر تدور بدوري هيدروكسيلامينيس، وهي الجيش الشعبي الثوري-صامت وتتفاعل مع الجذور لم تدم طويلاً لتشكيل نيتروكسيدي مستقرة. هيدروكسيلامينيس دوري تتفاعل مع فائق أكسيد 100 مرة أسرع من الفخاخ تدور، وتمكينهم من التنافس مع المواد المضادة للأكسدة الخلوية، لكنها تفتقر إلى الدقة وتتطلب استخدام عناصر التحكم المناسبة ومثبطات التعرف على الأنواع المتطرفة أو مصدر مسؤولة عن إشارة نيتروكسيدي. بينما تدور الفخاخ خصوصية المعرض، مع مميزة الطيفية أنماط تبعاً للأنواع المحاصرين، لديهم حركية بطيئة لأكسيد فائق تدور محاصرة ومعرضة للتحلل الأحيائي الراديكالي adducts. وكانت طلبات تعويض تدور موثقة توثيقاً جيدا في البحوث الطبية الحيوية9،10،11،،من1213.
والهدف من هذا المشروع إظهار أساليب الجيش الشعبي الثوري العملي لتصميم التجارب وإعداد العينات للكشف عن فائق أكسيد استخدام تدور تحقيقات في مقصورات خلوية مختلفة في المختبر وفي أنسجة مختلفة المقصورات في فيفو. وقد نشر المخطوطات عدة البروتوكولات ذات الصلة لهذه الأهداف، باستخدام المسابر نفاذية الخلية والخلية كتيمة المتقدرية تدور المستهدفة للنسيج في المختبر وعملية مختلفة من المقصورات الخلوية المستهدف للتحليل في نماذج الماوس 14 , 15-نحن نبني على هذه الهيئة للأدب بالتحقق من نهج لقياس أكسيد فائق باستخدام مجس تدور (غروهارلم) 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine في مقصورات خلوية مختلفة في المختبر للتأكد من دقة القياسات، وتسليط الضوء على المشاكل التقنية المحتملة التي قد تحرف النتائج. نحن نقدم أيضا أساليب لإجراء قياسات الجيش الشعبي الثوري في الدم والسوائل الغسل للفيسيولوجيا وأنسجة الرئة باستخدام مسبار تدور غروهارلم. هذه الدراسات المقارنة بين أساليب مختلفة لمعالجة الأنسجة، فضلا عن تقديم أسلوب آخر تدور المسبار، CPH، بحقن الفئران قبل الحصاد الأنسجة. وأخيراً، يمكننا وضع طريقة عملية لتخزين العينات في أنابيب تترافلوروايثيلين (PTFE) للسماح بتخزين ونقل العينات قبل القياسات الجيش الشعبي الثوري في 77 ك.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقييم الإنتاج الحرة الراديكالية في إعدادات البيولوجية مهم في فهم الأكسدة ينظم الإشارات في الصحة والمرض، ولكن هذه الأنواع صعبة نظراً لأن نصف العمر القصير للأنواع الحرة الراديكالية والتقنية العالية قيود مع الأساليب استخداماً. الجيش الثوري الشعبي أداة قيمة وقوية في مجال البيولوجيا الأكسد…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل جامعة كولورادو مدرسة الطب عميد جائزة “الهياكل الأساسية للبحوث الاستراتيجية”، R01 HL086680-09 و 1R35HL139726-01، على جائزة الزمالة E.N.G. وكفريت كلية جامعة دبلن (أنه). يشكر المؤلفون الدكتورة ساندرا إيتون والدكتور جيرالد روزين الدكتور غاريث إيتون (جامعة دنفر)، والدكتور جوزيف ب. كاو (جامعة ميريلاند)، والدكتور المفارق إهداء (جامعة كولورادو دنفر) لإجراء مناقشات مفيدة وجوان مالتزاهن، أشلي ترومبي واللبلاب ماكدرموت (جامعة كولورادو دنفر) لتقديم الدعم التقني.
Materials
| DMEM | LifeTech | 10566-016 | cell culture media |
| Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) | Sigma Aldrich | D6518-5G | |
| sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate dibasic (HK2PO4 ) | Fisher Scientific | BP363-500 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate monobasic (KH2PO4 ) | Sigma Aldrich | P-5379 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| Krebs-Henseleit buffer (KHB) | (Alfa Aesar, Hill) | J67820 | |
| Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD) | Sigma Aldrich | S7571-30KU | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P1585-1MG | Dissolve in DMSO |
| Antimycin A (AA) | Sigma Aldrich | A8674-25MG | Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots) |
| 1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-117-M050 | |
| 1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-078-M250 | |
| 1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-171-M005 | |
| 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-131-M250 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Diphenyliodonium chloride | Sigma Aldrich | 43088 | |
| Deferoxamin mesylate salt | Sigma Aldrich | D9533-1G | |
| Critoseal | Leica | 39215003 | |
| BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMark | Sigma Aldrich | 708733 | Capillaries |
| PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 3/16” OD x 1/8” ID |
NORELL | 1598774A | Teflon tubing |
| SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR | NORELL | 94987 | |
| EMXnano Bench-Top EPR spectrometer | Bruker BioSpin GmbH | E7004002 | |
| EMX NANO TISSUE CELL | Bruker BioSpin GmbH | E7004542 |
Riferimenti
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
- Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).
- Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).
- Elajaili, H., et al. Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status. Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).
- Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).
- Epel, B., et al. Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc. Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).
- Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy. Biochimica. 54 (47), 6973-6982 (2015).
- Abbas, K., et al. Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps. Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).
- Dikalov, S. I., et al. Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production. Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).
- Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor’ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).
- Dikalova, A. E., et al. Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension. Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).
- Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes. Antioxidants & Redox Signaling. , (2017).
- Sharma, S., et al. L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow. Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).
- Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies. PloS One. 9 (3), (2014).
- Kozlov, A. V., et al. EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species. Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).
- Van Rheen, Z., et al. Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).
- Mouradian, G. C., et al. Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).
- Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay. Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).
- Kozuleva, M., et al. Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).
- Chen, K., Swartz, H. M. Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells. Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).
