Estudiando la importación de la proteína en cloroplastos con protoplastos
Summary
Aquí se describe un protocolo para expresar proteínas en protoplastos mediante método de transformación mediada por PEG. El método proporciona fácil expresión de proteínas de interés y eficiente investigación de localización de la proteína y el proceso de importación para las varias condiciones experimentales en vivo.
Abstract
El cloroplasto es un organelo esencial que es responsable de varios procesos celulares en plantas, tales como la fotosíntesis y la producción de metabolitos secundarios y lípidos. Cloroplastos requieren una gran cantidad de proteínas para estos diversos procesos fisiológicos. Sobre el 95% de las proteínas del cloroplasto son codificadas por el núcleo e importado en cloroplastos desde el citosol después de traducción en los ribosomas citosólicas. Así, la correcta importación o focalización de estas proteínas codificadas por el núcleo cloroplasto cloroplastos es esencial para el buen funcionamiento de los cloroplastos y la célula de la planta. Las proteínas codificadas por el núcleo cloroplasto contienen secuencias de la señal para el objetivo específico a cloroplastos. Maquinaria molecular localizada en el cloroplasto o citosol reconocer estas señales y llevar a cabo el proceso de importación. Para investigar los mecanismos de importación de proteínas o targeting a cloroplastos en vivo, se desarrolló un método rápido y eficiente basado en el protoplasto para analizar proteínas importación en cloroplastos de Arabidopsis. En este método, utilizamos protoplastos aislados de tejidos de la hoja de Arabidopsis. Presentamos un protocolo detallado para que el uso de protoplastos para investigar el mecanismo por el cual las proteínas son importadas en cloroplastos.
Introduction
El cloroplasto es uno de los orgánulos más importantes en las plantas. Una de las principales funciones de los cloroplastos es llevar a cabo fotosíntesis1. Cloroplastos también realizan muchas otras reacciones bioquímicas para la producción de ácidos grasos, aminoácidos, nucleótidos y numerosos metabolitos secundarios1,2. Por todas estas reacciones, cloroplastos requieren un gran número de diferentes tipos de proteínas. Sin embargo, el genoma del cloroplasto contiene sólo aproximadamente 100 genes3,4. Por lo tanto, cloroplastos deben importar la mayoría de sus proteínas desde el citosol. De hecho, la mayoría las proteínas del cloroplasto fueron demostradas para ser importadas desde el citosol después traducción4,5,6. Las células vegetales requieren mecanismos específicos para importar proteínas desde el citosol a cloroplastos. Sin embargo, aunque estos mecanismos de importación de proteínas han sido investigados durante las últimas décadas, todavía no completamente entendemos a nivel molecular. Aquí, ofrecemos un método detallado para la preparación de protoplastos y exógeno expresar genes en protoplastos. Este método podría ser útil para dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes la importación de la proteína en cloroplastos en detalle.
Importación de proteínas se puede estudiar con muchos enfoques diferentes. Uno de estos métodos implica el uso de un in vitro proteína importación sistema7,8. Usando este acercamiento, en vitro-precursores de la proteína traducida se incuban con cloroplastos purificados en vitro, y se analiza la importación de proteínas por SDS-PAGE seguido por análisis de western blot. La ventaja de este enfoque es que se puede estudiar en detalle cada paso de la importación de la proteína en cloroplastos. Por lo tanto, este método ha sido ampliamente utilizado para definir los componentes de la maquinaria molecular de la proteína importación y diseccionar la información de la secuencia de péptidos de tránsito. Más recientemente, otro enfoque que implica el uso de protoplastos de tejidos de la hoja fue desarrollado y ha convertido en ampliamente utilizado para el estudio de importación de la proteína en cloroplastos9,10. La ventaja de este enfoque es que los protoplastos proporcionan un entorno celular que está más cercano de la de las células intactas que el sistema in vitro . Así, el sistema de protoplasto nos permite abordar muchos aspectos de este proceso, tales como los eventos asociados citosólicas y cómo se determina la especificidad de las señales de orientación. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el uso de protoplastos para estudiar proteínas importación en cloroplastos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Proporcionamos un protocolo detallado para el uso de protoplastos de Arabidopsis para estudiar proteínas importación en cloroplastos. Este método es de gran alcance para investigar el proceso de importación de proteínas. Esta técnica simple y versátil es útil para examinar la focalización de las proteínas de carga previsto a cloroplastos. Usando este método, protoplastos están preparados de tejidos de hojas de Arabidopsis11,12 que pu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo se llevó a cabo con los apoyos del programa de investigación cooperativo para la agricultura ciencia y tecnología de desarrollo (proyecto no. PJ010953012018), administración de Desarrollo Rural y la beca de la Fundación Nacional de investigación (Corea) financiado por el Ministerio de ciencia y las TIC (Nº 2016R1E1A1A02922014), República de Corea.
Materials
| GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
| SUCROSE | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
| MES MONOHYDRATE | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
| Agar, powder | JUNSEI | 24440S1201 | |
| Micropore Surgical tape | 3M | 1530-0 | |
| Surgical blade stainless No.10 | FEATHER | Unavailable | |
| Conical Tube, 50ml | SPL LIFE SCIENCES | 50050 | |
| Macerozyme R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| Cellulase ONOZUKA R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| ALBUMIN, BOVINE (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| D-Mannitol | SIGMA | M1902-1KG | |
| CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE | MP BIOMEDICALS | 0219463505-5KG | |
| Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
| Screen cup for CD-1 | SIGMA | S1145 | |
| Screens for CD-1 | SIGMA | S3895 | |
| Petri Dish | SPL LIFE SCIENCES | 10090 | |
| Pasteur pipette | HILGENBERG | 3150102 | |
| LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP | VISION SCIENTIFIC | VS-5500N | |
| Sodium chloride | JUNSEI | 19015S0350 | |
| Potassium chloride | SIGMA | P3911-1KG | |
| D-GLUCOSE, ANHYDROUS | BIO BASIC | GB0219 | |
| Potassium Hydroxide | DUKSAN | 40 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | SIGMA | C2786-500G | |
| Poly(ethylene glycol) | SIGMA | P2139-2KG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA | M2393-500G | |
| Tube 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
| Microscope slides | MARIENFELD | 1000412 | |
| Microscope Cover Glasses | MARIENFELD | 101030 | |
| Counting Chamber | MARIENFELD | 650030 | |
| Axioplan 2 Imaging Microscope | Carl Zeiss | Unavailable | |
| Micro tube 1.5ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-250ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade | VWR | M107-500G | |
| TRIS, Ultra Pure Grade | VWR | 0497-5KG | |
| DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade | VWR | 0281-25G | |
| Bromophenol blue sodium salt ACS | VWR | 0312-50G | |
| Glycerol | JUNSEI | 27210S0350 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | TAKARA | 632381 |
Riferimenti
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