原生质体在叶绿体中导入蛋白质的研究

叶绿体是植物中最重要的细胞器之一。叶绿体的主要功能之一是进行光合作用¹。叶绿体还为脂肪酸、氨基酸、核苷酸和许多次生代谢物^{1, 2 的}产生进行许多其他生化反应。对于所有这些反应, 叶绿体需要大量不同类型的蛋白质。然而, 叶绿体基因组只包含大约100个基因^3,4。因此, 叶绿体必须从细胞溶胶中导入大部分蛋白质。事实上, 大多数叶绿体蛋白被证明是在翻译^4,5,6后从细胞溶胶中导入的。植物细胞需要特定的机制来从细胞溶胶导入蛋白质到叶绿体。然而, 尽管这些蛋白质进口机制在过去几十年里一直在研究, 但我们仍然没有在分子层面上完全理解它们。在这里, 我们提供了一个详细的方法来制备原生质体和外生表达基因在原生质体。该方法可用于阐明蛋白质导入叶绿体的分子机制。

蛋白质的导入可以用许多不同的方法来研究。其中一种方法涉及使用体外蛋白质导入系统^7,8。利用该方法,体外转化蛋白前体体体培养纯化的叶绿体, 用 sds-page 对蛋白质导入进行分析, 然后进行西方印迹分析。这种方法的优点是可以详细研究蛋白质导入叶绿体的每一步。因此, 该方法已被广泛用于定义蛋白质导入分子机械的成分, 并对过境肽的序列信息进行剖析。最近, 开发了另一种涉及使用叶组织原生质体的方法, 并已被广泛用于研究蛋白质导入叶绿体^9,10.这种方法的优点是原生质体提供了一个比体外系统更接近完整细胞的细胞环境。因此, 原生质体系统使我们能够解决这一过程的许多其他方面, 如相关的细胞质事件, 以及如何确定靶向信号的特异性。在这里, 我们提出了一个详细的协议, 用于使用原生质体研究蛋白质的进口到叶绿体。