Flow Cytometry 여 Dictyostelium discoideum Macropinocytosis의 높은 처리량 측정

1입니다. 세포와 자료의 준비 설명된23으로 셀 Klebsiella aerogenes, 같은 박테리아와 함께에서 또는 HL5 같은 영양소 매체에 SM 한 천 배지에서 배양.참고: 성장 하는 박테리아에 macropinocytosis에 결함이 녹아웃 돌연변이 macropinocytosis의 속도 증가 시킬 수 있습니다 이차 돌연변이의 축적을 방지 하기 도움이 됩니다. 최적의 결과 대 한 주식에서 셀 도금 후 4 아래 통로 번호를 유지. 돌연변이 격리 후 즉시 냉동된 주식으로 저장 되어야 합니다. SM 한 천 배지에서 세포 배양을 SM 매체에 합류 K. aerogenes 성장. SM 한 천 격판덮개에 박테리아의 200-300 μ를 추가 하 고 확산. (다른 세균성 접시에서 전송) 하는 경우 셀의 메 마른 루프를가지고 고 접시의 한 가장자리에 확산. 주일에 22 ° C에서 품 어. 50 mg/ml 물에 Tetra-메 틸-rhodamine isothiocyanate (TRITC-) dextran을 분해, 1 mL aliquots로 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 필터링 및-20 ° c.에 저장 Aliquots는 무기한으로 보관 될 수 있습니다.참고: 155 kDa, 대량에서 싸게 구입할 수 있습니다 하지만 작은 dextrans 측정 macropinocytosis Dictyostelium24에 효과적으로이 방법으로 사용 되는 일반적인 크기입니다. 캐스케이드 또는 알 렉 사-647, 같은 다른 비-quenchable dextrans 다른 fluorophores 필요한 경우 대안이 있습니다. 2. (선택 사항)으로 양적 질적 측정 변환 현 탁 액 셀을 사용 하 여 액체 이해 분석 결과 수행 합니다. 300 x g 3 분에 axenically 성장 세포를 작은, 삭제는 상쾌한 고 1 x 107 셀/mL 영양소 중에 resuspend. TRITC-dextran 0.5 mg/mL을 추가 하 고 180 rpm, 22 ° c.에 흔들 희석 0.8 mL 샘플 얼음 주식2 0, 30, 60, 90, 120 분 세척에서 0.7 mL로 한 번 얼음 주식2 버퍼23 벤치탑 원심 분리기에서 1.5 ml, 같은 버퍼에 1 ml resuspend 및 얼음에 저장.참고: 동일한 결과 생성 즉시 또는 모든 샘플 수집 된 일단 세척. 액체는 세포에 의해 내 면의 볼륨을 결정 합니다. 574의 544 및 방출 파장의 여기 파장을 사용 하 여 형광을 측정 하기 위해 fluorimeter을 설정 10 nm 슬릿 nm. TRITC-dextran의 희석 일련을 설정 하 고 위해 주어진 형광을 측정 하는 데 사용할 dextran의 볼륨. 보정 곡선을 만듭니다. 섹션 2.1 세포 현 탁 액의 0.9 mL를 사용 하 여 셀에 의해 내 면 형광을 측정 합니다. 보정 곡선24를 사용 하 여 셀 당 내 액체의 볼륨을 계산 합니다. 0.5 mL 얼음 차가운 주식2에 별도로 각 시간 지점에서 세포의 나머지를 희석. 5 mL 폴리스 티 렌 흐름 cytometry 튜브 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터링. 각 시간 지점에서 세포는 서로 다릅니다 그리고 그들의 형광을 기록 교류 cytometer 설정 (섹션 3.4와 3.5 참조). 위의 설정을 사용 하 여 교류 cytometer에서 교정 구슬의 형광을 측정 하 고 그것을 기록 합니다.참고: 이것은 교류 cytometer에 모든 미래 형광 측정에 대 한 참조: 다시 사용 하기 전에 구슬을 실행 하 고 그래서 그들은 같은 형광 설정을 조정. 이 매우 좁은 정의 된 피크를 줄 것 이다. 주위에 형광 피크 게이트 퍼 팅 수 있습니다 쉽게이. 세 번을 반복 하 고 2.2 및 2.3 서로 대 한 섹션에서 얻은 세포 형광 데이터. 적합 선 플롯 하 고 방정식을 사용 하 여 양적 단위로 cytometry에서 질적 데이터를 변환. 3. 측정 유체 통풍 관 그림 1: macropinocytosis의 높은 처리량 측정의 도식. (A) SM 접시에 성장 Dictyostelium K. aerogenes 박테리아 (노란색)와 시드. 주식2 버퍼의 25 mL로 세포 먹이 앞 (오렌지), 이미 개발 된 셀 피 (녹색), 수확. 소용돌이, 해리를 300 x g에 3 분 원심 분리 하 여 펠 렛 다음 주식2 버퍼, 삭제는 상쾌한 때마다 50 mL에 3 번 세척. 1 x 105 셀/ml HL5 성장 매체에 resuspend 하 고 편평한 바닥 96 잘 접시의 샘플 당 3 개의 우물으로 50 µ L를 추가 합니다. (B) 희석 TRITC-dextran HL5 성장 매체에 1 mg/ml에서 50 mg/mL의 재고 솔루션 24 h. 22 ° C에서 품 어. (0 분 이해 컨트롤 웰 스 제외), 각 샘플에 50 µ L을 추가 하 고는 dextran 0 분 이해 컨트롤에 추가 하는 후 h 1에 대 한 22 ° C에서 품 어. (C)는 언론에 즉시 가만히 따르다, 초과 매체를 제거 하 고 씻어 웰 스 작성 얼음 주식2 버퍼의 목욕에 잠수함을 조직에 접시를 두 드려. 버퍼를 가만히 따르다 하 고 다시 건조 두 드려. 5mm 나트륨 아 지 드 주식2엠씨 셀을 분리 해체의 100 µ L를 추가 합니다. 내 면된 형광 측정 cytometer 흐름을. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 플랫 96-잘 조직 문화 접시 (그림 1A)를 설정 합니다. 분석 결과; 전에 24 h HL5 매체 (포함 100 µ g/mL의 dihydrostreptomycin, 100 µ g/mL 암 피 실린 및 50 µ g/mL 대)에 그들을 전송 하 고 박테리아에 성장 하는 세포를 사용 하 여 macropinocytosis를 박테리아24에 성장 하는 세포에서 낮은 레벨에서 upregulated 될 수 있습니다. 또는, 다른 밀도에서 희석되 셀 오류를 줄이기 위해 분석 결과 전에 24 h에 대 한 잠복기 axenic 문화에서 직접 셀을 희석. 25 mL 50 mL 원심 분리기 튜브에서 주식2 에 먹이 앞에서 베스트 셀. Vortexing와 3 분. 에 대 한 300 x g 에서 펠 릿 세포 분열 삭제는 상쾌한, resuspend 펠 릿 그리고 300 x g 주식2, 박테리아를 제거 하는 상쾌한 때마다 삭제의 50 mL에서 3 분에 3 번 세척. (는 hemacytometer 또는 다른 셀 카운트 시스템을 사용 하 여) 셀 밀도 결정 하 고 HL5 포함 항생제 1 x 105 셀/ml로 희석. 각 조건에 대 한 3 개의 우물을 사용 하 여 각 음에 50 μ를 플라스틱. 22 ° C 24 h. 0 분 이해 제어를 설정 하는 기억에서 품 어.참고:는 대체 매체, 예를 들면 SIH, VL6 대신 사용할 수 있습니다. TRITC-dextran (그림 1B)에 포함 된 셀을 로드 합니다. Dextran 사용 매체에 1 mg/mL를 희석 (이 증가 될 수 있다 2.5-5 m g/mL를 매우 낮은 통풍 관에 포함 된 셀을 평가할 때). 각 잘 (주는 TRITC-dextran 0.5 mg/mL의 최종 농도)을 50 μ를 추가 하 고 이로써 상당한 dextran 축적 하지만 dextran exocytosis 아직 시작 하지는 22 ° C 1 시간에 접시를 반환.참고: 리피터 피 펫이이 단계 더 빠르게 할 수 오류를 줄일 수 있습니다. Cytometry (그림 1C)에 대 한 셀을 준비 합니다. 세척, 직전 0 분 이해 컨트롤에 50 μ dextran 포함 된 미디어를 추가 합니다. 매체를 가만히 따르다와 조직에 건조 두 드려. 얼음 주식2, 플레이트를 잠수 하 여 세척 한 다음 가만히 따르다.참고: 준수 결함을 가진 일부 변종 예: 중부의 두 homologs의 녹아웃이이 단계 동안 분리 될 수 있습니다 (탈 라-/ talB-)25. 작업 셀 라인을 제대로 연결 하 고 필요한 경우 미디어를 발음을 할 때 주의 사용 합니다. 얼음 처럼 차가운 5mm 나트륨 아 지 드 주식2MC (주식2 + 2mm MgSO4 및 100 μ M CaCl2)에 용 해의 100 μ를 추가 합니다.주의: 나트륨 아 지 드는 매우 독성이 있습니다. 먼지가 면 및 안전 유리를 사용 하 여 분말을 작업할 때. 항상 착용 장갑 및 연구실 코트. 열을 방지 하 고 산으로 혼합 하지 마십시오.참고: 셀 빠르게 분리 하 고 exocytosis 방해24입니다. 이것을 확인 하는 현미경을 사용할 수 있습니다. Cytometry에 의해 측정 유체 통풍 관 값을 변환 상대적 절대 것 계획, 비즈를 사용 하 여 표준화 흐름 cytometer 설정 (섹션 2 참조). 사용 하 여 셀 (그림 2B) 섹션 2 앞으로 분산형 및 측면 분산형 설정 적절 하 게 셀 (그림 2A), 기계, 차단 되지 않습니다 보장을 dextran 함께 로드 하 고 매개 변수를 조정 하는 또는, (그림 2C) 내 면된 형광을 측정 합니다. 높은 처리량 샘플링 시스템을 연결 하 고 플레이트를 추가 합니다. (TRITC-dextran 노란색-녹색 레이저를 사용 하 여 자극 582 nm 채널 또는 유사한 측정을)에 대 한 형광을 측정 하는 프로토콜 설정 세포 현 탁 액 및 실행의 최대 65 μ의. 교류 cytometry 결과 분석 앞으로 분산형 및 사이드 분산형 (그림 2A)를 사용 하 여 셀에 게이트. 통계 옵션을 사용 하 여 셀의 메디아 형광을 계산 합니다. 하나의 샘플을 사용 하 여 이러한 매개 변수를 설정 하 고 모든 샘플에 적용.참고: 앞으로 분산형/사이드 분산형 프로필 다른 돌연변이 또는 억제제를 사용 하 여 샘플 사이의 달라질 수 있습니다. 각 조건에 대 한 3 개의 우물의 의미를 확인 하 고 빼기 0 분 이해 합니다. 중 2 절에서 결정 하는 수식을 사용 하 여 정량 값으로 변환 또는 컨트롤에 정상화. 4. 유체 이해 시간-과정 수행 섹션 3, 각 시간 점 및 스트레인/조건에 대 한 3 개의 우물에서 세포를 설정 합니다. 다른 우물에 dextran 이라는 매체를 순차적으로 추가 합니다. 전형적인 시간 과정 측정 유체 이해 0, 30, 60, 90, 120 및 180 분 180 분 시간 포인트 우물, 120 분 시간 지점에 대 한 우물에 그것을 추가 하 여 다음 60 분에 나중에 대 한 매체 dextran 포함 된 추가 등 (그림 3A). 0 분 50 μ dextran 포함의 추가 매체 즉시 가만히 따르다와 섹션 3.3에서 접시를 씻어. 3.5 섹션에 설명 된 대로 분석 합니다. 5. 복용량 응답 곡선 섹션 3, 각 스트레인 및 조건에 대 한 3 개의 우물에에서 설명 된 대로 세포를 설정 합니다. 포함 하는 화합물의 두 번 원하는 최대 최종 농도 에서 1 mg/mL dextran 매체로 관심의 화합물을 희석. 처음으로 자동차의 동일한 비율으로 dextran와 매체를 포함 하는 두 번째 튜브를 준비 합니다. 소용돌이를 섞어입니다. 샘플 (그림 4A) 당 매체를 포함 하는 200 μ dextran의 화합물의 희석 시리즈를 만듭니다. 소용돌이를 섞어입니다. 매체의 50 μ 1 h 위해 각 샘플에 추가 합니다. 세척 및 분석 섹션 3.3 이후에 설명 된 대로. 6. 식 균 작용 및 막 이해 막 이해 측정, 섹션 3에에서 설명 된 대로 셀을 준비 합니다. 10 μ M의 최종 농도 20 μ M FM 1-43를 포함 하는 매체의 50 μ를 추가 합니다. 후, 세척 하 고 섹션 3.3에서 cytometry에 대 한 셀을 준비 합니다. 585 nm 채널 또는 유사한, 흥분 시키기 위해 블루 레이저를 사용 하 여 측정 합니다.참고: 막 매매 하는 것은 액체 단계 보다 더 빠른, 10 분 1 h26보다 사용 하기 더 적절 한 시간 포인트입니다. 형광 막에 통합 하는 경우에 대체 염료 대신 사용할 수 있습니다. 붙일 이라는 구슬 또는 박테리아를 사용 하 여 측정 하는 식 균 작용. 그들은 앞으로 하 여 Dictyostelium 에서 사이드24분산형 형광 효 모를 사용할 수 없습니다. 섹션 3에서에서 설명한 대로 셀을 설정 하 고 설명된27분석. 측정을 먹어서 구슬의 노란-녹색 구슬 세척 하 고 같이 cytometry 준비 하기 전에 1 h 5 x 107 구슬/mL (1.75, 2 μ m) 또는 1 x 108 구슬/mL (1, 1.5 μ m)의 최종 농도에 섹션 3.2에에서 설명 된 대로 표시 추가 3.3 섹션입니다. 525 nm 채널 또는 유사한, 흥분 시키기 위해 블루 레이저를 사용 하 여 측정 합니다.참고: 높은 농도 세포 분리 이어질 것입니다. 박테리아의 식 균 작용을 측정, 텍사스-레드 분류 대장균 bioparticles 세척 하 고 섹션 3.3에서 cytometry 준비 하기 전에 섹션 3.2 ~ 1 x 108 박테리아/mL 1 h에에서 설명 된 대로 추가 합니다. 610 nm 채널 또는 유사한, 자극 하는 노란색-녹색 레이저를 사용 하 여 측정 합니다.