Macropinocitosi, su larga scala non specifico di assorbimento fluido, sono importante in molti settori della biologia clinica tra cui immunologia, infezioni, cancro e nelle malattie neurodegenerative. Qui, le tecniche esistenti sono state adattate per consentire la risoluzione di alto-rendimento, cella singola misura di Macropinocitosi nel Macropinocitosi modello organismo Dictyostelium discoideum mediante citometria a flusso.
Su larga scala non specifico assorbimento fluido da Macropinocitosi è importante per la proliferazione delle cellule tumorali sicure, campionamento di antigene, invasione della cellula ospite e la diffusione delle malattie neurodegenerative. I ceppi di laboratorio comunemente usati dell’ameba Dictyostelium discoideum hanno tassi estremamente alto assorbimento fluido se coltivate in terreno di coltura, oltre il 90% dei quali è dovuto Macropinocitosi. Inoltre, molti dei componenti di base conosciuta di mammiferi Macropinocitosi sono anche presenti, rendendolo un sistema eccellente modello per studiare Macropinocitosi. Qui, la tecnica standard per misurare interiorizzato fluido utilizzando destrano fluorescente come un’etichetta è adattata a un formato di piastra a 96 pozzetti, con campioni analizzati tramite citofluorimetria usando un allegato di campionamento ad alta velocità (HTS).
Le cellule sono alimentate non estinguibile destrano fluorescente per un predeterminato periodo di tempo, lavati per immersione nel buffer ghiacciata e staccata utilizzando 5 mM sodio azide, che ferma anche esocitosi. Cellule in ciascun pozzetto vengono poi analizzate tramite flusso cytometry. Il metodo può anche essere adattato per misurare l’assorbimento della membrana e la fagocitosi dei batteri o perline fluorescenti.
Questo metodo è stato progettato per consentire la misurazione dell’assorbimento fluido di Dictyostelium in modo efficiente ad alta produttività, manodopera e risorse. Permette il confronto simultaneo di più ceppi (ad es. mutanti di knockout del gene) e condizioni (ad esempio cellule nei mezzi differenti o trattate con diverse concentrazioni dell’inibitore) in parallelo e semplifica corsi di time.
Su larga scala non specifico assorbimento fluido da Macropinocitosi è importante in diversi contesti biologici1, tra cui il campionamento di antigene di immunitario cellule2, entrata del patogeno in host celle3, cancro delle cellule di proliferazione4 e il diffusione di malattie da prioni5. In cellule di Dictyostelium e mammiferi, actina6,7, PI (3.4.5) P38,9,10 (anche se l’esatta natura del lipido differisce tra i due11), attivato RAS12,13e attivato Rac14,15 sono importanti per l’assorbimento fluido efficiente di Macropinocitosi, anche se restano molte domande senza risposta su come è la patch macropinocytic formato, organizzato e infine interiorizzato. Alla scoperta di altre proteine importanti per Macropinocitosi e la determinazione di come essi sono importanti nei diversi contesti biologici, darà una comprensione più completa della Macropinocitosi e potenzialmente consentire lo sviluppo di trattamenti mirati per una gamma di condizioni.
Dictyostelium è un sistema modello ideale per studiare Macropinocitosi. L’alto livello di Macropinocitosi costitutiva nei ceppi di laboratorio standard significa che l’assorbimento fluido è superiore al 90% dovuto Macropinocitosi6. In questo modo Macropinocitosi essere misurata esclusivamente determinando l’assorbimento fluido, a differenza delle cellule di mammiferi dove la percentuale di assorbimento fluido dovuto Macropinocitosi è molto più bassa. Che Macropinocitosi sono così ben definito e facilmente visualizzati12 in questo sistema allo stesso modo offre vantaggi distinti per indagare conservate componenti del macropinosome core rispetto ad altri sistemi dove ci possono essere più segnali regolatori 16 , 17.
La tecnica standard utilizzata per misurare Macropinocitosi dalle cellule di mammiferi coinvolge cellule di fissaggio dopo pulsare con destrano per un breve periodo di tempo seguita da microscopia per determinare l’area di una cella che è occupata da vescicole di destrano-positivi18. Questa tecnica non tiene tuttavia conto per la possibilità di macropinosomes restringimento entrando nella cellula, che è stata segnalata in Dictyostelium19e prende in considerazione solo singoli aerei della cella, che significa il volume interiorizzato non è chiaro. Una tecnica alternativa, di contare il numero di macropinosomes interiorizzato in un dato tempo, ha la stessa nota stonata20. L’utilizzo di Dictyostelium evita questi problemi; Tuttavia, tecniche esistenti per misurare l’assorbimento fluido di Dictyostelium sono relativamente laboriosa, utilizzando una grande quantità di cellule e di destrano21. Le cellule sono scossi ad alta densità in campioni rimossi a vari intervalli di tempo per la determinazione della fluorescenza interiorizzata utilizzando un fluorimetro e destrano fluorescente. Preparati in questo modo le cellule possono essere analizzate tramite flusso cytometry per ottenere la singola cella, piuttosto che il livello di popolazione, risoluzione22, anche se questo rimane basso-velocità di trasmissione.
Qui, la tecnica standard per misurare interiorizzato fluido utilizzando destrano fluorescente come un’etichetta è adattata a un formato di piastra a 96 pozzetti, con campioni analizzati tramite citofluorimetria usando un allegato di campionamento ad alta velocità (HTS). Le cellule sono alimentate non estinguibile destrano fluorescente per un predeterminato periodo di tempo, lavati per immersione nel buffer ghiacciata e staccata utilizzando 5 mM sodio azide, che ferma anche esocitosi. Cellule in ciascun pozzetto vengono poi analizzate tramite flusso cytometry. Questo metodo è stato progettato per superare i limiti dei metodi di cui sopra e consentire un confronto simultaneo dell’assorbimento fluido di un gran numero di ceppi/condizioni, utilizzando meno risorse e riducendo il lavoro coinvolti.
Considerando che altri metodi per valutare l’assorbimento fluido sono basso throughput, lavare le cellule in situ e l’uso di sodio azide per staccare le cellule sono i punti critici in questo metodo, che consentono la misurazione ad alta produttività di Macropinocitosi, l’assorbimento della membrana, o fagocitosi di Dictyostelium. Come le cellule sono attaccate ad una superficie e il mezzo non è, possono essere lasciati aderenti mentre il mezzo intorno a loro in primo luogo è stato gettato fuori e poi cambiati per immersione nel buffer e gettati fuori nuovamente. Sodio azide, che impoverisce ATP cellulare e depolarizza la membrana30, viene quindi utilizzato per staccare le cellule e previene anche esocitosi senza influire sulle cellule vitalità24.
Mentre mediante citometria a flusso per misurare Macropinocitosi di Dictyostelium dà una misura molto accurata dell’assorbimento fluido molto rapidamente, per stabilire il motivo perché un particolare ceppo o condizione ha alterato l’assorbimento fluido, ulteriore indagine utilizzando la microscopia è necessari24. Inoltre precisiamo che i risultati precedentemente pubblicati hanno, in alcuni casi, mostrato una differenza nell’assorbimento del fluido di ceppi mutanti coltivato sia su una superficie (come in questo caso), o in agitazione sospensione (come il protocollo standard)31. Utilizzando questo metodo può significare che, in rari casi, l’assorbimento fluido apparenti difetti sono mancanti. Inoltre, quando si misura la fagocitosi, possono essere utilizzate solo basse concentrazioni di particelle. Il tasso massimo di fagocitosi che può essere determinato con questa tecnica è molto inferiore a quella massima reale, anche se è ancora possibile misurare differenze rilevanti nella fagocitosi tra ceppi e condizioni24. Per determinare il tasso massimo di fagocitosi, l’assorbimento deve essere misurata in agitazione la sospensione di un protocollo alternativo27. Le cellule che hanno phagocytosed perline hanno aumentato la dispersione laterale, quindi questo dovrebbe essere corretto per conseguenza quando si imposta il citometro a flusso.
Citometria a flusso può essere utilizzato per misurare l’assorbimento fluido in cellule di mammifero32, tuttavia la percentuale più alta di liquido fase l’assorbimento di altre vie di endocitosi quanto visto in Dictyostelium è una preoccupazione. Inoltre, le cellule in genere sono staccate usando tripsina a 37 ° C, permettendo ulteriori endocitico progressione di destrano interiorizzato. Ghiacciata sodio azide non causa i macrofagi staccare da una superficie (Williams, inedito osservazione), rendendo questa tecnica non applicabile per cellule di mammifero senza ulteriore ottimizzazione.
Alta velocità effettiva misura di Macropinocitosi ha il potenziale per essere utilizzato per lo screening rapido ed economico per gli effetti degli inibitori, mutazione genetica o atterramento di gene in cellule di Dictyostelium . Mutanti devono sempre essere confrontati con loro padre diretto solo. Se il lettore non ha alcuna preferenza preventiva per ceppo di Dictyostelium , non axeniche ceppi come DdB o NC4 sono più “wild-type” rispetto a quelli axeniche e possono essere manipolati efficacemente come ceppi axeniche33. In caso contrario, sono l’axeniche Ax2 ceppi ceppi con il minor numero genoma duplicazioni34, mentre molti ceppi di Ax4 sono KO A Talin e dovrebbero essere evitato se possibile23. Più sforzi precedentemente pubblicati possono essere ordinati dal Dicty Stock Center35.
Questa tecnica permette maggiori possibilità d’indagine di quanto fosse possibile in precedenza sugli effetti delle diverse condizioni, inibitori e mutazioni su Macropinocitosi di Dictyostelium.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo il Medical Research Council UK per core (U105115237) di finanziamento per RRK.
LSR_II flow cytometer | BD Biosciences | – | Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD |
TRITC-dextran (155 kDa) | Sigma-Aldrich | T1287 | Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine |
HL5 medium | Formedium | HLGCFG | |
96-well tissue culture plate | Corning | 3596 | Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work |
Dihydrostreptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1517 | |
Ampicillin sodium | Formdium | AMP50 | |
Kanamycin monosulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
Sodium azide | VWR | 103694M | |
Magnesium sulfate hydrate | VWR | 25169.295 | |
Calcium chloride dihydrate | VWR | 1.02382.0250 | |
Potassium dihydrogen phopshate | VWR | 1.04877.1000 | |
Di-potassium hydrogen phosphate | VWR | 1.05104.1000 | |
Fluorimeter | Perkin-Elmer | LS 50 B | |
FM1-43 | Thermofisher | T35356 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 µm | Polysciences | 15702-10 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 µm | Polysciences | 09719-10 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 µm | Polysciences | 17687-5 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 µm | Polysciences | 09847-5 | |
Texas Red E. coli bioparticles | Thermofisher | E2863 | |
Flow-set fluorospheres | Beckman Coulter | 6607007 | Calibration Beads |
SM agar | Formedium | SMACFG | |
0.22 µm syringe filter | Elkay Laboratory Products | E25-PS22-50S | |
10 mL Syringe | Becton Dickinson | 302188 | |
Round-bottom polystyrene tubes | Corning | 352058 | Use a tube that will fit onto your flow cytometer. |
70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
50 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.547.004 | |
Repeating pipette | Eppendorf | M4-SK | |
5 mL repeating pipette tips | Eppendorf | 30089650 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
LY294002 | Cayman Chemical Company | 70920 | |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG |