JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

מדידת תפוקה גבוהה Dictyostelium discoideum Macropinocytosis על ידי Cytometry זרימה

Published: September 10, 2018
doi:
10.3791/58434
,
1MRC-Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK

Summary

Macropinocytosis, בקנה מידה גדול ספיגת הנוזלים של שאינם ספציפיים, חשוב בתחומים רבים של ביולוגיה קליני כולל אימונולוגיה, זיהום, סרטן ומחלות ניווניות. . הנה, קיימות טכניקות הותאמו כדי לאפשר רזולוציה תפוקה גבוהה, תא בודד מדידה של macropinocytosis macropinocytosis דגם האורגניזם Dictyostelium discoideum באמצעות flow cytometry.

Abstract

בקנה מידה גדול ספיגת נוזלים שאינם ספציפיים על-ידי macropinocytosis חשוב ההתפשטות של תאים סרטניים מסוימים, אנטיגן דגימה, הפלישה התא המארח ואת ההתפשטות של מחלות ניווניות. זני מעבדה נפוץ אמבה Dictyostelium discoideum יש שיעור ספיגת נוזלים גבוהה מאוד כאשר גדל מזין בינוני, מעל 90% מהם נובע macropinocytosis. בנוסף, רבים של רכיבי ליבה ידוע macropinocytosis בתרבית של נוכחות גם הן, שהופך אותו מערכת מודל מצויין ללמוד macropinocytosis. כאן, טכניקה סטנדרטית למדידת נוזלים למביטה באמצעות לתוספי פלורסנט כתווית הוא להתאים לתבנית צלחת 96-ובכן, עם הדגימות נותחו על ידי cytometry זרימה באמצעות קובץ מצורף תפוקה גבוהה דגימה (HTS).

תאים ניזונים לתוספי פלורסנט-quenchable עבור אורך זמן, נשטף על ידי טבילה במאגר קר כקרח, מנותק תוך שימוש אזיד הנתרן 5 מ מ, אשר גם עוצר אקסוציטוזה שנקבע מראש. התאים היטב כל מנותחות ואז על ידי cytometry זרימה. השיטה גם ניתן להתאים כדי למדוד את ספיגת ממברנה של phagocytosis של חרוזים פלורסנט או חיידקים.

שיטה זו נועדה לאפשר מדידה של ספיגת הנוזלים על ידי Dictyostelium תפוקה גבוהה, דיני עבודה, משאבים באופן יעיל. היא מאפשרת השוואה בו זמנית של מספר זנים (למשל knockout מוטציות של גנים) ותנאים (למשל תאי מדיה שונים או מטופלים עם ריכוזים שונים של מעכב) במקביל ומפשט את הזמן-קורסים.

Introduction

בקנה מידה גדול ספיגת נוזלים שאינם ספציפיים על-ידי macropinocytosis חשוב בהקשרים ביולוגיים מספר1, כולל אנטיגן דגימה על-ידי החיסון תאים2, פתוגן כניסתו לתאים מארח3, סרטן התא התפשטות4 ו הפצת מחלות פריון5. מידע יונקים, תאים Dictyostelium , פאי אקטין6,7,9,8,P3 (3,4,5)10 (למרות טיב השומנים שונה בין שני11), מופעל ראס12,13ו-14,Rac מופעל15 חשובים עבור יעילות ספיגת הנוזלים על ידי macropinocytosis, למרות נותרו שאלות רבות ללא מענה על איך הוא התיקון macropinocytic נוצרו, מאורגן, למביטה בסופו של דבר. גילוי חלבונים יותר חשוב macropinocytosis ונחישות עוקבות של מה הם חשובים בהקשרים ביולוגיים שונים, לתת הבנה מקיפה יותר של macropinocytosis, העלול לאפשר התפתחות טיפולים יישוב למגוון רחב של מצבים.

Dictyostelium היא מערכת מודל אידיאלי ללמוד macropinocytosis. רמה גבוהה של macropinocytosis המכונן ב מעבדה סטנדרטיים זנים אומר שאת ספיגת הנוזלים הוא מעל 90% בשל macropinocytosis6. זה מאפשר macropinocytosis נמדד אך ורק על פי קביעת ספיגת נוזלים, בניגוד בתרבית של תאים כאשר שיעור ספיגת נוזלים עקב macropinocytosis הוא נמוך בהרבה. Macropinocytosis כל כך מוגדרת היטב, דמיינו בקלות12 במערכת זו דומה מציע יתרונות ברורים על חקירת ליבה שנשמרת מרכיבי macropinosome על פני מערכות אחרות שבהן עשוי להיות מספר אותות התקינה 16 , 17.

הטכניקה תקן המשמש למדידת macropinocytosis על ידי תאים בתרבית של כרוך בתיקון תאים לאחר הפועמים עם לתוספי לתקופה קצרה של זמן ואחריו מיקרוסקופ כדי לקבוע את האזור של תא מאוכלס על ידי לתוספי-חיוביות שלפוחית18. טכניקה זו אינו חשבון אולם לאפשרות של macropinosomes מתכווץ עם כניסתו התא, אשר דווחה Dictyostelium19, והיא רק לוקחת בחשבון מטוסים יחיד של התא, כלומר אמצעי האחסון הפנימו לא ברור. טכניקה חלופית, של ספירת מספר macropinosomes הפנימו בזמן נתון, יש חסרונות אותם20. השימוש Dictyostelium מונע בעיות אלה; עם זאת, קיימות טכניקות למדידת ספיגת הנוזלים על ידי Dictyostelium הם יחסית עמל רב, שימוש גדול כמות התאים והן לתוספי21. תאים שיש לחיצות על צפיפות גבוהה ב לתוספי פלורסנט ודוגמאות הוסר בנקודות שונות בזמן-לקביעת למביטה ידי קרינה פלואורסצנטית באמצעות fluorimeter. ניתן לנתח תאים שהוכנו בדרך זו על ידי cytometry זרימה כדי לזכות תא בודד, יותר מאשר האוכלוסייה ברמת, רזולוציה22, למרות שזה ישאר תפוקה נמוכה.

כאן, טכניקה סטנדרטית למדידת נוזלים למביטה באמצעות לתוספי פלורסנט כתווית הוא להתאים לתבנית צלחת 96-ובכן, עם הדגימות נותחו על ידי cytometry זרימה באמצעות קובץ מצורף תפוקה גבוהה דגימה (HTS). תאים ניזונים לתוספי פלורסנט-quenchable עבור אורך זמן, נשטף על ידי טבילה במאגר קר כקרח, מנותק תוך שימוש אזיד הנתרן 5 מ מ, אשר גם עוצר אקסוציטוזה שנקבע מראש. התאים היטב כל מנותחות ואז על ידי cytometry זרימה. שיטה זו נועדה להתגבר על המגבלות של השיטות שהוזכרו לעיל, לאפשר השוואה סימולטני של ספיגת הנוזלים של מספר גדול של זנים/תנאים תוך שימוש בפחות משאבים והקטנת העבודה מעורב.

Protocol

1. הכנת תאים וחומרים לטפח התאים או על פלטות אגר SM בשילוב עם חיידקים כגון קלבסיאלה aerogenes, או מזין בינוני כגון HL5 כפי שמתואר23.הערה: גידול מוטציות נוק אאוט זה הם פגומים ב macropinocytosis על חיידקים מסייע במניעת הצטברות מוטציות משני אשר עשוי להגדיל את קצב macropinocytosis. לשמור על מספר מעבר מתחת 4 לאחר ציפוי תאים מן המניות לקבלת תוצאות מיטביות. מוטציות יש לאחסנו מניות קפוא בהקדם האפשרי לאחר בידוד. לטפח תאים על פלטות אגר SM, לגדול ק’ aerogenes הנהרות SM בינוני. להוסיף 200 – 300 μL של חיידקים על גבי צלחת אגר SM, להפיץ. קח לולאה סטרילי של תאים (בעת העברת עוד צלחת חיידקי), מורחים בקצה אחד של הצלחת. דגירה ב 22 מעלות צלזיוס במשך שבוע. להמיס לתוספי טטרה-מתיל-rhodamine isothiocyanate (TRITC-) עד 50 מ”ג/מ”ל מים, סינון באמצעות מסננים μm 0.22 לתוך 1 מ”ל aliquots ולאחסן ב-20 ° C. Aliquots יכול להישמר ללא הגבלת זמן.הערה: 155 kDa הוא גודל אופייני בשימוש בשיטה זו, ניתן לרכוש בזול בכמויות, אבל dextrans קטנים יותר למדוד את macropinocytosis בצורה יעילה ב- Dictyostelium24. Dextrans quenchable שונים, כגון מפל כחול או אלקסה-647, הן חלופות אם fluorophores שונים נדרשים. 2. המרת איכותי המידות כמותית (אופציונלי) ביצוע וזמינותו של ספיגת נוזלים באמצעות תאים ההשעיה. גלולה תאים axenically גדל ב g 300 x למשך 3 דקות, למחוק את תגובת שיקוע, resuspend מזין בינוני 1 x 107 תאים/מ ל…. להוסיף TRITC-לתוספי 0.5 מ”ג/מ”ל, לנער-180 סל ד, 22 ° C. לדלל 0.8 מ לתוך 0.7 מ של KK כקרח2 -0, 30, 60, 90, 120 דקות לשטוף פעם ב- 1.5 מ של קרח KK2 מאגר23 צנטריפוגה benchtop, resuspend 1 מ ל מאגר באותו ודוגמאות לאחסן בקירור.הערה: לרחוץ באופן מיידי או לאחר שנאסף כל דוגמאות מניב תוצאות שוות ערך. קבע את עוצמת הקול של נוזל על ידי התאים. להגדיר את fluorimeter כדי למדוד קרינה פלואורסצנטית באמצעות אורך גל של עירור של גל nm ו פליטה 544 של 574 nm עם חתך nm 10. להגדיר סדרת דילול TRITC-לתוספי ולהשתמש בו כדי למדוד את קרינה פלואורסצנטית כי נתנו נפחי לתוספי. ליצור עקומת כיול. למדוד את זריחה על ידי התאים בסעיף 2.1 באמצעות 0.9 מ של התליה תא. חישוב הנפח של נוזלים הפנימו בכל תא באמצעות עקומת כיול24. לדלל את שאר התאים של כל נקודת זמן בנפרד לתוך 0.5 mL קרח קר KK2. לסנן דרך מסננת תא מיקרומטר 70 לתוך צינורות cytometry זרימה פוליסטירן מ. להגדיר את cytometer זרימה כך תאים לכל נקודת זמן נפרדים אחד מהשני ולהקליט שלהם קרינה פלואורסצנטית (ראו סעיפים 3.4 ו- 3.5). למדוד את זריחה של כיול חרוזים ב cytometer זרימה באמצעות ההגדרות לעיל, להקליט אותו.שימו לב: זאת ההתייחסות עבור כל המדידות פלורסצנטיות בעתיד על cytometer זרימה: לפני השימוש שוב להפעיל את החרוזים והתאם את ההגדרות אז הם צריכים את קרינה פלואורסצנטית אותו. זה ייתן לשיא מוגדר צר מאוד. לשים שער סביב הפסגה פלורסצנטיות יכול לעשות את זה יותר קל. אני חוזר שלוש פעמים, להתוות את הנתונים פלורסצנטיות תא שהתקבלו בסעיפים 2.2 ו- 2.3 אחד נגד השני. להתוות קו של מיטבית ולהשתמש המשוואה להמיר הנתונים האיכותיים cytometry זרימה ליחידות כמותית. 3. מדידת ספיגת נוזלים איור 1: סכימטי של מדידת תפוקה גבוהה macropinocytosis. (א) לגדול Dictyostelium בצלחת SM נזרע עם ק’ aerogenes חיידקים (צהוב). קציר תאים מהחזית האכלה (כתום), הימנעות התאים כבר מפותחים (ירוק), לתוך 25 מ של KK2 מאגר. מערבולת מביצועם, גלולה על ידי צנטריפוגה 3 דקות ב x 300 גרם, ולאחר מכן לשטוף 3 פעמים ב 50 מ ל מאגר2 KK, השמטת את תגובת שיקוע בכל פעם. Resuspend עונה 1 פרק 105 תאים/מ במדיום הגידול HL5 ולהוסיף 50 µL לתוך משלוש בארות לדגימה של צלחת 96-ובכן בתחתית שטוח. דגירה ב 22 ° C עבור ה 24 (B) שתדללו TRITC-לתוספי 1 מ ג/מ במדיום הגידול HL5 פתרון מניות של 50 מ”ג/מ”ל. להוסיף 50 µL כל דגימה (למעט הבארות שליטה ספיגת דקות 0), דגירה ב 22 ° C 1 h, אחרי אשר מוסיף את לתוספי לפקד ספיגת דקות 0. (ג) decant מיד את המדיה, לטפוח על הלוחית טישו כדי להסיר עודפי בינוני ויציפו באמבט קר כקרח מאגר2 KK, מילוי הבארות לשטוף. Decant המאגר, ומייבשים שוב. להוסיף 100 µL של 5 מ מ אזיד הנתרן מומס KK2MC כדי לנתק את התאים. לקחת לזרום cytometer למדידת קרינה פלואורסצנטית למביטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. להגדיר את צלחת שהונעו 96-ובכן-תרביות רקמה (איור 1 א’). להשתמש בתאים הגדלים על חיידקים, להעביר אותם לתוך HL5 בינוני (המכיל 100 µg/mL של dihydrostreptomycin, 100 µg/mL אמפיצילין µg 50/mL kanamycin) 24 שעות לפני וזמינותו; זה מאפשר macropinocytosis להיות upregulated של רמות נמוכות ראיתי בתאים גדל על חיידקים24. לחלופין, לדלל תאים ישירות מן התרבות axenic, המקננת במשך 24 שעות לפני וזמינותו, כדי להפחית שגיאות בגלל התאים להיות מדולל של צפיפויות שונות. קציר תאים מהחזית הזנה לתוך 25 מ של KK2 בשפופרת צנטרפוגה 50 מ. מביצועם תאים על-ידי vortexing צנפה ב x 300 גרם למשך 3 דקות. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ולשטוף 3 פעמים ב x 300 גרם במשך 3 דקות ב- 50 מ של KK2, השמטת את תגובת שיקוע בכל פעם כדי להסיר את החיידקים. לקבוע את צפיפות התאים (באמצעות hemacytometer או הפלאפון האחר ספירת מערכת), לדלל לתוך HL5 המכיל אנטיביוטיקה עונה 1 פרק 105 תאים/מ ל…. פיפטה 50 μL בכל טוב, באמצעות שלוש בארות עבור כל תנאי. דגירה ב 22 מעלות צלזיוס במשך 24 ה זכור להגדיר פקד ספיגת דקות 0.הערה: חלופה בינונית, למשל SIH, VL6 ניתן להשתמש במקום זאת. לטעון תאים עם TRITC-לתוספי (איור 1B). לדלל את לתוספי כדי 1 מ”ג/מ”ל ב אופן השימוש (זה יכול להיות עלה ל 2.5 – 5 מ”ג/מ”ל כאשר הערכת תאים עם ספיגה נמוכה מאוד). להוסיף 50 μL בכל טוב (ויתור ריכוז סופי של 0.5 מ”ג/מ”ל TRITC-לתוספי) ולהחזיר את הצלחת עד 22 מעלות צלסיוס לשעה זה מאפשר הצטברות לתוספי משמעותית אך אקסוציטוזה של לתוספי טרם החלה.הערה: פיפטה משחזר מאפשרת שלב זה צריך להיעשות במהירות רבה יותר, צמצום שגיאות. הכינו את התאים עבור cytometry זרימה (איור 1C). מייד לפני כביסה, להוסיף 50 μL המכילים לתוספי מדיה הפקדים ספיגת דקות 0. Decant של המדיום, ומייבשים על טישו. לשטוף מאת השוקע את הצלחת KK כקרח2ולאחר מכן decant.הערה: עלולים להתנתק זנים מסוימים עם הדבקות פגמים במהלך שלב זה, למשל פצצה של שני homologs של Talin (טאלה-/ אתר פרסום -)25. שימוש באזהרה בעת עבודה עם שורות תאים לקוי צרף, תשאף מדיה במידת הצורך. להוסיף 100 μL של 5 מ מ קרה כקרח אזיד הנתרן מומס KK2MC (KK2 + 2 מ מ MgSO4 ו- 100 μM CaCl2).התראה: אזיד הנתרן הוא רעיל מאוד. השתמש מסיכת אבק בטיחות משקפיים כשאתה עובד עם האבקה. תמיד ללבוש כפפות, חלוק המעבדה. להימנע חום, לא לערבב עם חומצה.הערה: תאים לנתק במהירות, אקסוציטוזה מנעו24. מיקרוסקופ ניתן לבדוק את זה. מדד ספיגת הנוזלים על ידי cytometry זרימה אם התכנון להמיר ערכי יחסית לאלה מוחלטת, השתמש חרוזים לתקנן את הזרימה cytometer הגדרות (ראה סעיף 2). לחלופין, השתמש תאים עמוסה לתוספי כמו סעיף 2 על מנת להבטיח פיזור קדימה ואת הצד פיזור מוגדרים כראוי כדי לבודד תאים (איור 2 א), המבטיח שהמכונה אינה חסומה, (איור 2B) ולהתאים את הפרמטרים כדי למדוד את קרינה פלואורסצנטית למביטה (איור 2C). הצמד דגימה תפוקה גבוהה מערכת והוסף את הצלחת. להגדיר את פרוטוקול כדי למדוד את קרינה פלואורסצנטית (עבור TRITC-לתוספי משתמשים בלייזר ירוק-צהוב כדי לרגש ולמדוד בערוץ nm 582 או דומה) של עד 65 μL של התא ההשעיה, ריצה. ניתוח תוצאות cytometry זרימה שער על תאים באמצעות פיזור קדימה ופיזור צד (איור 2 א). לחשב את קרינה פלואורסצנטית החציוני של התאים באמצעות האפשרות ‘ סטטיסטיקה ‘. הגדר פרמטרים אלה באמצעות דוגמא אחת ומוחלות על כל הדגימות.הערה: הפרופילים פיזור לצד פיזור קדימה יכול להשתנות בין מדגמים בעת שימוש מוטציות שונות או מעכבי. לקבוע הממוצע של הבארות שלושה עבור כל תנאי ולהחסיר את הפקד ספיגת דקות 0. גם להמיר לערכים כמותיים באמצעות המשוואה נקבע בסעיף 2 או לנרמל לפקד. 4. ביצוע זמן ספיגת נוזלים-קורסים להגדיר את התאים כמו בסעיף 3, עם שלוש בארות לכל נקודת זמן או מאמץ/תנאי. להוסיף בינוני עם תוויות ברורות לתוספי הבארות שונים ברצף. זמן-קורס טיפוסי מודד את ספיגת הנוזלים 0, 30, 60, 90, 120, 180 דקות להוסיף לתוספי המכילות בינוני וולס נקודת זמן 180 דקות, אחרי 60 דקות מאוחר יותר על-ידי הוספתו לפקודה הבארות עבור נקודת זמן מינימום 120, וכדומה (איור 3 א). ב 0 דקה, להוסיף 50 μL של לתוספי המכילות בינוני, מיד decant, לשטוף את הצלחת כמו סעיף 3.3. לנתח כמתואר בסעיף 3.5. 5. במינון התגובה עקומות הגדרת התאים כמתואר בסעיף 3, עם משלוש בארות לכל זן או תנאי. לדלל את המתחם עניין לתוך בינוני המכיל 1 מ”ג/מ”ל לתוספי- כפול הרצוי המרבי הסופי הריכוז של המתחם. הכן צינור השני המכיל בינוני עם לתוספי עם הפרופורציה של הרכב כמו הראשון. מערבולת לערבב. ליצור סדרה דילול של המתחם עניין ב- 200 μL לתוספי המכילות בינוני לכל דגימה (איור 4A). מערבולת לערבב. להוסיף 50 μL של המדיום כל מדגם טוב עבור 1 h. רוחצים את נתח כמתואר בסעיף 3.3 ואילך. 6. phagocytosis ואת ספיגת ממברנה כדי למדוד את ספיגת ממברנה, להכין את התאים כמתואר בסעיף 3. הוסף μL 50 בינוני המכיל FM μM 20 1-43 עבור ריכוז סופי של 10 μM. לאחר הטעינה, לשטוף ולהכין תאים עבור cytometry זרימה כמו סעיף 3.3. למדוד בתעלה 585 ננומטר או דומה, באמצעות לייזר כחול כדי לרגש.הערה: כמו קרום סחר היא מהירה יותר מאשר נוזל-פאזי, 10 דקות היא נקודת זמן מתאים יותר לשימוש מאשר 1 h26. צבעי חלופי לזרוח רק כאשר שולבו הקרום ניתן להשתמש במקום זאת. להשתמש fluorescently שכותרתה חרוזים או חיידקים כדי למדוד phagocytosis. אין אפשרות להשתמש שמרים פלורסנט, כפי שהם באמת בלתי נפרד מן Dictyostelium על ידי העבר, לצד פיזור24. הגדרת התאים כמתואר בסעיף 3 ולנתח כמו שמתואר27. כדי למדוד phagocytosis של חרוזים להוסיף מתויג חרוזים כפי שמתואר בסעיף 3.2 כדי ריכוז הסופי של 5 x 107 חרוזים/mL (1.75 ו-2 μm) או עונה 1 פרק 108 חרוזים/mL (1 ל- 1.5 μm) עבור 1 h לפני שטיפה והכנת עבור cytometry זרימה כמו ירוק-צהוב סעיף 3.3. למדוד בערוץ nm 525 או דומה, באמצעות לייזר כחול כדי לרגש.הערה: ריכוז גבוה יוביל ניתוק התא. כדי למדוד phagocytosis של חיידקים, להוסיף שטקסס-אדום מתויג Escherichia coli bioparticles כפי שמתואר בסעיף 3.2 1 x 108 חיידקים/מ”ל לשעה לפני שטיפה והכנת עבור cytometry זרימה כמו סעיף 3.3. למדוד בתעלה 610 nm או דומה, באמצעות לייזר ירוק-צהוב כדי לרגש.

Representative Results

פעם הטכניקה בוצעה תאים הם עמוסה לתוספי ומוכן לניתוח (איור 1), להבטיח שזרימת cytometer אינה חסומה ולהתאים את הפרופיל פיזור לצד פיזור לפנים להיראות כמו התאים שמוצג באיור 2A. אם המכונה חסומה, זה ייראה יותר ככה באיור איור 2B , בטח החסימה לפני שתמשיך. להבטיח הפרמטרים להראות שליטה axenic תאים גבוהה לתוספי למביטה פלורסצנטיות בנקודות זמן ארוך יותר ויש קרינה פלואורסצנטית למביטה נמוך-אלה שורטר (איור 2C). כאשר מחפשים הבדלים בין מוטנטים, סביר להניח כי יהיו אחד שלושה פנוטיפים. המוטציות יכול להיות נורמלי ספיגת נוזלים, להם פגם חלקית או ספיגת נוזלים יכול לבטל לחלוטין. איור דו-ממדי מראה על המתח עם ספיגת נוזלים נורמלית, במקרה זה המתח מעבדה סטנדרטיים Ax2, מוטציה עם ~ 50% להקטין את ספיגת הנוזלים (Ax2 rasG-14) וביטלה אחד עם ספיגת נוזלים (Ax3 gefB-28). להשיג את (סעיף 3.5) ממוצע חציון ספיגת נוזלים ולהשתמש בו כדי לחשב את עוצמת הקול של נוזל הפנימו (כמו דמות 3B) או להשוות את הנתונים לפקד (כמו דמות 4B ו- 4 C). בעת ביצוע קורס זמן ספיגת נוזלים, כמו באיור 3A, ידי קרינה פלואורסצנטית למביטה צריך להגדיל 60-90 דקות, לאחר מכן לתוספי מתחיל להיות exocytosed, מישור זה להגיע (איור 3B). באמצעות 60 דקות כמו נקודת השעה הרגילה כאשר משווים macropinocytosis בתנאים/מוטציות שונות ולכן מאפשר קליטה טובה להיות מושגת, אין קליטה אובדת עקב אקסוציטוזה. מוטציות איפה אקסוציטוזה קשות נחסמת עשויה להימשך זמן רב כדי להגיע אל הרמה של29. כאשר מתייחסים תאים עם מעכבי יעילים נגד macropinocytosis ב Dictyostelium (להקים כמו איור 4A), את לתוספי הפנימו ב 1 h יהיה ללכת למטה כמעט שום בריכוזים גבוהים מעכב ברוב המכריע של המקרים (איור 4B). כמה מעכבי לא יכול להיות יעיל ב-100 אחוז, לעומת זאת, למשל nocodazole מעכב רק עד 50% של ספיגת הנוזלים על ידי macropinocytosis בעת הוספת בחריפות (איור 4C). אם מעכבי אינם יעילים, התאים להפנים כמות דומה של לתוספי של הפקד, ירידה ברמת קרינה פלואורסצנטית לא ישודר. טכניקה זו מאפשרת מגוון גדול של מעכבי שונים, ריכוזי המדכא שיוקרנו השפעות על ספיגת הנוזלים על ידי macropinocytosis במהירות רבה, צמצום הזמן בילה ייעול הטיפול מעכב. איור 2: הגדר של זרימת נתונים cytometer ונציג. (א) פיזור קדמי (FSC) ואת הצד פרופילים פיזור (האס) של תאים יש להגדירו כך התאים ניתן להבחין בקלות. דוגמה של איך צריך להיראות Ax2 התאים מוצג. (B) אם cytometer זרימה חסומה, כמו בדוגמה זו, התאים יש פיזור בצד נמוך מאוד. הלייזר לא יעוררו את fluorophores כראוי, המכונה החסימה לפני שתמשיך. צריך להיות מושלך נתונים שהושגו בעוד המכונה היה חסום. (ג) ידי קרינה פלואורסצנטית להגדיר כך מדגם ספיגת דקות 0 יש קרינה פלואורסצנטית נמוכה, אשר מגדילה כאשר יש כבר מתפשט תאים עבור יותר במדיום פלורסנט, כפי שמוצג בדוגמה זו שנלקחו וויליאמס & קיי 201824. (ד) דוגמאות של תאים יש כבר מתפשט עם TRITC לתוספי עבור h 1 עם macropinocytosis רגיל (Ax2, ירוק), מופחת macropinocytosis (Ax2 rasG -, HM172614, כתום) וביטלה macropinocytosis (Ax3 gefB -, HM177628, כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3: ביצוע זמן ספיגת נוזלים-קורסים ב 96-ובכן צלחות. (א) לתוספי צריכים להתווסף לכל קבוצה של דגימות ברצף, עם סיום באותו הזמן. אז תרחץ הבארות, לנתק, למדוד את קרינה פלואורסצנטית למביטה על ידי cytometry זרימה. דוגמה פעמים כדי להוסיף את לתוספי מוצגים כאן. (B) כמובן זמן ספיגת הנוזלים של תאים Ax2 הופיעה 96-ובכן צלחות. שנלקחו וויליאמס & קיי 201824, קווי שגיאה הצג השגיאה הסטנדרטית של 3 ניסויים עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 4: ספיגת נוזלים במינון התגובה עקומות. (א) להוסיף את המתחם של עניין, זה התיק PI3K מעכב LY294002, HL5 המכיל 1 מ”ג/מ”ל TRITC-לתוספי- זוגי הריכוז המרבי הסופי הרצוי. מערבבים עם מדיום הגידול HL5 + 1 מ”ג/מ”ל לתוספי המכיל את הרכב לבד בפרופורציות שונות כדי ליצור סדרת דילול בינוני 200 µL לכל תנאי. להוסיף בארות כרגיל לשעה לפני שטיפה ומדידת למביטה זריחה. (B) ספיגת נוזלים במינון עקומת בתגובה עבור תאים Ax2 מודגרות עם המדיום המכיל LY294002 מ- A. הותאם ויליאמס אנד קיי 201824. ספיגת נוזלים מנורמל לפקד שאינו מטופל. קווי שגיאה הצג השגיאה הסטנדרטית של 3 ניסויים עצמאית. (ג) ספיגת נוזלים במינון עקומת בתגובה עבור תאים Ax2 מודגרות עם nocodazole. הותאם ויליאמס אנד קיי 201824. ספיגת נוזלים מנורמל לפקד שאינו מטופל. קווי שגיאה הצג השגיאה הסטנדרטית של 3 ניסויים עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

בעוד שיטות אחרות כדי להעריך את ספיגת הנוזלים תפוקה נמוכה, לשטוף את התאים בחיי עיר ושימוש של אזיד הנתרן להתנתק תאים הן לשלבים הקריטיים בשיטה זו, אשר מאפשרים מדידה תפוקה גבוהה של macropinocytosis, ספיגת קרום, או phagocytosis על-ידי Dictyostelium. כמו התאים מחוברים משטח, המדיום אינו, הם יכולים להיות נשאר מחובר ואילו המדיום סביבם קודם שיעיפו ואז השתנה על ידי טבילה במאגר ו שיעיפו שוב. אזיד הנתרן, אשר מכלה ATP הסלולר, depolarizes את קרום30, משמש לאחר מכן לנתק את התאים, גם מונע אקסוציטוזה מבלי להשפיע על התאים הכדאיות24.

בזמן השימוש cytometry זרימה כדי למדוד את macropinocytosis על ידי Dictyostelium מעניק מדידות מדויקות מאוד של ספיגת נוזלים במהירות רבה, כדי לקבוע את הסיבה מדוע זן מסוים או מצב של שינה ספיגת נוזלים, לקדם באמצעות חקירה מיקרוסקופ הוא נדרש24. יש גם לציין כי התוצאות שפורסמו בעבר, במקרים מסוימים, הראו הבדל ספיגת הנוזלים על ידי מוטציה זנים גדל גם על משטח (כמו במקרה זה), או לוחצים ההשעיה (כמו הפרוטוקול הסטנדרטי)31. בשיטה זו פירושה כי, במקרים נדירים, ספיגת נוזלים לכאורה פגמים הם החמיצו. בנוסף, בעת מדידת phagocytosis, ניתן להשתמש רק ריכוזים נמוכים של חלקיקים. הקצב המרבי של phagocytosis זה יכול להיקבע בטכניקה זו הוא הרבה מתחת מרבי אמיתי, למרות שזה עדיין אפשרי למדוד הבדלים רלוונטיים phagocytosis בין זנים ותנאים24. כדי לקבוע את השיעור המרבי של phagocytosis, ספיגת חייב להימדד לוחצים השעיה פרוטוקול חלופי27. התאים יש phagocytosed חרוזים הגדילו פיזור בצד, אז זה אמור להיפתר עבור בהתאם בעת הגדרת את cytometer זרימה.

Cytometry זרימה יכול לשמש כדי למדוד את ספיגת הנוזלים ב תאים בתרבית של32, אולם שיעור גבוה יותר של נוזל שלב ספיגת על ידי מסלולים endocytic אחרים מאשר אצל Dictyostelium היא דאגה. בנוסף, תאים בדרך כלל מנותקים באמצעות טריפסין ב 37 מעלות צלזיוס, המאפשר יותר התקדמות endocytic של לתוספי למביטה. אזיד הנתרן כקרח אינו גורם מקרופאגים לנתק ממשטח (וויליאמס, שלא פורסמו תצפיות), ביצוע הטכניקה הזו לא תקפה בתרבית של תאים ללא נוספים מיטוב.

מדידת תפוקה גבוהה macropinocytosis יש פוטנציאל לשמש מסך במהירות ובזול על ההשפעות של מעכבי, מוטציה גנטית או גנים בתאי Dictyostelium . מוטציות צריך תמיד להשוותו הוריהם ישיר בלבד. אם הקורא אין העדפה מוקדמת לזן Dictyostelium , זנים שאינם axenic כגון DdB או NC4 יותר “פראי-סוג” מאשר אלו axenic, ניתן לטפל בצורה יעילה כמו זנים axenic33. אחרת, Ax2 זנים הם axenic זנים עם המצומצמות הגנום כפילויות34, בעוד זנים רבים של Ax4 Talin A הסתרה, צריך להיות להימנע במידת האפשר23. ניתן להזמין ביותר שפורסמו בעבר זנים Dicty מניות מרכז35.

טכניקה זו מאפשרת אפשרויות חקירה גדול יותר משהיה אפשרי לתוך ההשפעות של תנאים שונים, מעכבי מוטציות ב- macropinocytosis על ידי Dictyostelium.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים המועצה למחקר רפואי בבריטניה על ליבה מימון (U105115237) RRK.

Materials

LSR_II flow cytometer BD Biosciences – Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD
TRITC-dextran (155 kDa) Sigma-Aldrich T1287 Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine
HL5 medium Formedium HLGCFG
96-well tissue culture plate Corning 3596 Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work
Dihydrostreptomycin sulfate Sigma-Aldrich PHR1517
Ampicillin sodium Formdium AMP50
Kanamycin monosulfate Sigma-Aldrich 60615
Sodium azide VWR 103694M
Magnesium sulfate hydrate VWR 25169.295
Calcium chloride dihydrate VWR 1.02382.0250
Potassium dihydrogen phopshate VWR 1.04877.1000
Di-potassium hydrogen phosphate VWR 1.05104.1000
Fluorimeter Perkin-Elmer LS 50 B
FM1-43 Thermofisher T35356
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 µm Polysciences 15702-10
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 µm Polysciences 09719-10
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 µm Polysciences 17687-5
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 µm Polysciences 09847-5
Texas Red E. coli bioparticles Thermofisher E2863
Flow-set fluorospheres Beckman Coulter 6607007 Calibration Beads
SM agar Formedium SMACFG
0.22 µm syringe filter Elkay Laboratory Products E25-PS22-50S
10 mL Syringe Becton Dickinson 302188
Round-bottom polystyrene tubes Corning 352058 Use a tube that will fit onto your flow cytometer.
70 µm cell strainer Falcon 352350
50 mL centrifuge tube Sarstedt 62.547.004
Repeating pipette Eppendorf M4-SK
5 mL repeating pipette tips Eppendorf 30089650
DMSO Sigma-Aldrich D2650-100ML
LY294002 Cayman Chemical Company 70920
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404-2MG
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Bloomfield, G., Kay, R. R. Uses and abuses of macropinocytosis. Journal of Cell Science. 129 (14), 2697-2705 (2016).
  2. Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocompatibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182 (2), 389-400 (1995).
  3. Hardt, W. D., Chen, L. M., Schuebel, K. E., Bustelo, X. R., Galan, J. E. S. typhimurium encodes an activator of Rho GTPases that induces membrane ruffling and nuclear responses in host cells. Cell. 93 (5), 815-826 (1998).
  4. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
  5. Munch, C., O’Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (9), 3548-3553 (2011).
  6. Hacker, U., Albrecht, R., Maniak, M. Fluid-phase uptake by macropinocytosis in Dictyostelium. Journal of Cell Science. 110, 105-112 (1997).
  7. Dowrick, P., Kenworthy, P., McCann, B., Warn, R. Circular ruffle formation and closure lead to macropinocytosis in hepatocyte growth factor/scatter factor-treated cells. European Journal of Cell Biology. 61 (1), 44-53 (1993).
  8. Buczynski, G., et al. Inactivation of two Dictyostelium discoideum genes, DdPIK1 and DdPIK2, encoding proteins related to mammalian phosphatidylinositide 3-kinases, results in defects in endocytosis, lysosome to postlysosome transport, and actin cytoskeleton organization. Journal of Cell Biology. 136, 1271-1286 (1997).
  9. Araki, N., Johnson, M. T., Swanson, J. A. A role for phosphoinositide 3-kinase in the completion of macropinocytosis and phagocytosis by macrophages. Journal of Cell Biology. 135 (5), 1249-1260 (1996).
  10. Araki, N., Egami, Y., Watanabe, Y., Hatae, T. Phosphoinositide metabolism during membrane ruffling and macropinosome formation in EGF-stimulated A431 cells. Experimental Cell Research. 313 (7), 1496-1507 (2007).
  11. Clark, J., et al. Dictyostelium uses ether-linked inositol phospholipids for intracellular signalling. The EMBO Journal. 33 (19), 2188-2200 (2014).
  12. Hoeller, O., et al. Two distinct functions for PI3-kinases in macropinocytosis. Journal of Cell Science. 126, 4296-4307 (2013).
  13. Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins. Science. 233 (4768), 1061-1068 (1986).
  14. Veltman, D. M., et al. A plasma membrane template for macropinocytic cups. Elife. 5, e20085 (2016).
  15. West, M. A., Prescott, A. R., Eskelinen, E. L., Ridley, A. J., Watts, C. Rac is required for constitutive macropinocytosis by dendritic cells but does not control its downregulation. Current Biology. 10 (14), 839-848 (2000).
  16. West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109, 2731-2739 (1989).
  17. Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284 (2016).
  18. Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).
  19. Clarke, M., Kohler, J., Heuser, J., Gerisch, G. Endosome fusion and microtubule-based dynamics in the early endocytic pathway of Dictyostelium. Traffic. 3, 791-800 (2002).
  20. Pacitto, R., Gaeta, I., Swanson, J. A., Yoshida, S. CXCL12-induced macropinocytosis modulates two distinct pathways to activate mTORC1 in macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 101 (3), 683-692 (2017).
  21. Rivero, F., Maniak, M. Quantitative and microscopic methods for studying the endocytic pathway. Methods in Molecular Biology. , 423-438 (2006).
  22. Bacon, R. A., Cohen, C. J., Lewin, D. A., Mellman, I. Dictyostelium discoideum mutants with temperature-sensitive defects in endocytosis. Journal of Cell Biology. 127, 387-399 (1994).
  23. Basu, S., Fey, P., Jimenez-Morales, D., Dodson, R. J., Chisholm, R. L. dictyBase 2015: Expanding data and annotations in a new software environment. Genesis. 53 (8), 523-534 (2015).
  24. Williams, T. D., Kay, R. R. The physiological regulation of macropinocytosis during Dictyostelium growth and development. Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).
  25. Tsujioka, M., et al. Overlapping functions of the two talin homologues in Dictyostelium. Eukaryotic Cell. 7 (5), 906-916 (2008).
  26. Aguado-Velasco, C., Bretscher, M. S. Circulation of the plasma membrane in Dictyostelium. Molecular Biology of the Cell. 10, 4419-4427 (1999).
  27. Sattler, N., Monroy, R., Soldati, T. Quantitative analysis of phagocytosis and phagosome maturation. Methods in Molecular Biology. 983, 383-402 (2013).
  28. Wilkins, A., Chubb, J., Insall, R. H. A novel Dictyostelium RasGEF is required for normal endocytosis, cell motility and multicellular development. Current Biology. 10, 1427-1437 (2000).
  29. Thomason, P. A., King, J. S., Insall, R. H. Mroh1, a lysosomal regulator localized by WASH-generated actin. Journal of Cell Science. 130 (10), 1785-1795 (2017).
  30. van Duijn, B., Vogelzang, S. A., Ypey, D. L., van der Molen, L. G., van Haastert, P. J. M. Normal chemotaxis in Dictyostelium discoideum cells with a depolarized plasma membrane potential. Journal of Cell Science. 95, 177-183 (1990).
  31. Novak, K. D., Peterson, M. D., Reedy, M. C., Titus, M. A. Dictyostelium myosin I double mutants exhibit conditional defects in pinocytosis. Journal of Cell Biology. 131, 1205-1221 (1995).
  32. Mercer, J., Helenius, A. Vaccinia virus uses macropinocytosis and apoptotic mimicry to enter host cells. Science. 320 (5875), 531-535 (2008).
  33. Paschke, P., et al. Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum. PLoS One. 13 (5), e0196809 (2018).
  34. Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum. Genome Biology. 9 (4), R75 (2008).
  35. Fey, P., Dodson, R. J., Basu, S., Chisholm, R. L. One stop shop for everything Dictyostelium: dictyBase and the Dicty Stock Center in 2012. Methods in Molecular Biology. 983, 59-92 (2013).

Tags

Dictyostelium DiscoideumMacropinocytosisFlow CytometryHigh-throughput MeasurementCell CultureTRITC-dextranCell WashingCell CountingTime CourseSodium Azide

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Williams, T., Kay, R. R. High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (139), e58434, doi:10.3791/58434 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image