Macropinocytose, absorption de fluides à grande échelle non spécifiques, est important dans de nombreux domaines de la biologie clinique y compris immunologie, infection, cancer et les maladies neurodégénératives. Ici, les techniques existantes ont été adaptées pour permettre la résolution haut-débit, cellule unique mesure de macropinocytose dans la macropinocytose modèle organisme Dictyostelium discoideum utilisant cytométrie en flux.
À grande échelle non spécifique d’absorption fluide par macropinocytose est importante pour la prolifération de certaines cellules cancéreuses, échantillonnage de l’antigène, invasion des cellules hôtes et la propagation des maladies neurodégénératives. Les souches couramment utilisés en laboratoire de l’amibe Dictyostelium discoideum ont des taux d’absorption de liquide extrêmement élevées lorsqu’il est cultivé dans un milieu nutritif, plus 90 % d’entre eux sont en raison de la macropinocytose. En outre, de nombreux éléments base connue de macropinocytose mammifères sont également présents, ce qui en fait un système excellent modèle pour étudier la macropinocytose. Ici, la technique standard de mesure intériorisé fluide à l’aide de dextran fluorescent sous une étiquette est adaptée à un format de plaque à 96 puits, avec les échantillons analysés par cytométrie en flux à l’aide d’un accessoire d’échantillonnage haut débit (HTS).
Les cellules sont nourris non trempants dextran fluorescent pour une durée prédéterminée, baigné par immersion dans un tampon glacée et détaché à l’aide de l’azide de sodium 5 mM, qui s’arrête aussi exocytose. Dans chaque puits, les cellules sont ensuite analysées par cytométrie en flux. La méthode peut également être adaptée pour mesurer l’absorption de la membrane et phagocytose des perles fluorescentes ou des bactéries.
Cette méthode a été conçue pour permettre la mesure de l’absorption de liquide par Dictyostelium , haut débit, du travail et ressources efficacement. Il permet une comparaison simultanée de plusieurs souches (par exemple les mutants de masquage d’un gène) et les conditions (par exemple des cellules dans les différents médias ou traités avec différentes concentrations de l’inhibiteur) en parallèle et simplifie le temps-cours.
À grande échelle non spécifique d’absorption fluide par macropinocytose est importante dans plusieurs contextes biologique1, y compris l’échantillonnage d’antigène par immunitaire des cellules2, entrée pathogène dans l’hôte cellules3, cancer cellulaire4 de la prolifération et la propagation de maladies de prion5. Dans les mammifères et les cellules de Dictyostelium , actine6,7, PI (3,4,5) P38,9,10 (bien que la nature exacte des lipides diffère entre les deux11), activés RAS12,13et activés Rac14,15 sont importants pour l’absorption de liquide efficace de macropinocytose, bien qu’il reste beaucoup de questions sans réponse sur comment le patch macropinocytic est formé, organisé et éventuellement intériorisés. Découverte de plusieurs protéines importantes pour la macropinocytose et lors de la détermination de la façon dont elles sont importantes dans les divers contextes biologiques, donnera une compréhension plus complète de macropinocytose et potentiellement permettre le développement de traitements ciblés pour un éventail de conditions.
Dictyostelium est un système de modèle idéal pour l’étude de macropinocytose. Le niveau élevé de macropinocytose constitutive dans les souches de laboratoire standard signifie que l’absorption du liquide est supérieure à 90 % en raison de la macropinocytose6. Cela permet de macropinocytose à mesurer uniquement en déterminant l’absorption liquide, contrairement aux cellules de mammifères où la proportion de l’absorption de liquide en raison de la macropinocytose est beaucoup plus faible. Macropinocytose est donc bien définie et facilement visualisée12 dans ce système de même offre des avantages distincts pour enquêter sur les éléments conservés de la macropinosome de base sur les autres systèmes où il peut y avoir plusieurs signaux réglementaires 16 , 17.
La technique standard utilisée pour mesurer la macropinocytose par les cellules de mammifères comporte la fixation des cellules après pulsé avec dextran pendant une courte période de temps suivi au microscope afin de déterminer la surface d’une cellule qui est occupée par des vésicules de dextran séropositifs18. Cette technique ne constitue pas cependant la possibilité de macropinosomes diminue en entrant dans la cellule, qui a été rapportée chez Dictyostelium19et prend uniquement en compte seul planes de la cellule, ce qui signifie que le volume intériorisé n’est pas claire. Une autre technique, de compter le nombre de macropinosomes internalisés dans un temps donné, a les mêmes inconvénients20. À l’aide de Dictyostelium évite ces problèmes ; Cependant, les techniques existantes pour mesurer l’absorption de liquide par Dictyostelium sont relativement main-d’oeuvre, à l’aide d’un grand montant des cellules et dextran21. Les cellules sont secouées à haute densité en fluorescent dextran et échantillons prélevés à des moments différents pour la détermination de la fluorescence intériorisée à l’aide d’un fluorimètre. Cellules préparées de cette manière peuvent être analysés par cytométrie à gagner unicellulaire, plutôt qu’au niveau des populations, résolution22, bien que cela reste faible débit.
Ici, la technique standard de mesure intériorisé fluide à l’aide de dextran fluorescent sous une étiquette est adaptée à un format de plaque à 96 puits, avec les échantillons analysés par cytométrie en flux à l’aide d’un accessoire d’échantillonnage haut débit (HTS). Les cellules sont nourris non trempants dextran fluorescent pour une durée prédéterminée, baigné par immersion dans un tampon glacée et détaché à l’aide de l’azide de sodium 5 mM, qui s’arrête aussi exocytose. Dans chaque puits, les cellules sont ensuite analysées par cytométrie en flux. Cette méthode a été conçue pour dépasser les limitations des méthodes ci-dessus et permettre une comparaison de l’absorption de liquide d’un grand nombre de souches/conditions tout en utilisant moins de ressources et de réduire le travail impliqué.
Alors que les autres méthodes d’évaluation de l’absorption fluide sont débit faible, lavage de la cellules in situ et l’utilisation de l’azoture de sodium pour détacher les cellules est les étapes essentielles dans cette méthode, qui permettent de mesurer haut débit macropinocytose, absorption de membrane, ou phagocytose de Dictyostelium. Comme les cellules sont attachées à une surface et le milieu n’est pas, elles soient laissés adhérents alors que le milieu qui les entoure est tout d’abord jeté et ensuite changés par immersion dans un tampon et jetés à nouveau. Azoture de sodium, qui épuise l’ATP cellulaire et dépolarise la membrane30, est ensuite utilisé pour détacher les cellules et empêche également l’exocytose sans affecter la viabilité de cellules24.
Bien qu’utilisant l’écoulement cytometry pour mesurer la macropinocytose par Dictyostelium donne une mesure très précise de l’absorption de liquide très rapidement, à établir la raison pourquoi une condition ou un souche particulière a modifié l’absorption fluide, plus loin à l’aide de l’enquête la microscopie est nécessaire24. Il faut aussi noter que les résultats déjà publiés manifestent, dans certains cas, une différence dans l’absorption de liquide par des souches mutantes cultivées soit sur une surface (comme dans le cas présent), ou en secouant la suspension (comme dans le protocole standard)31. À l’aide de cette méthode peut signifier que, dans de rares cas, les défauts apparents absorption fluide sont manquées. En outre, lorsque vous mesurez la phagocytose, seulement de faibles concentrations de particules peuvent être utilisées. Le taux maximal de phagocytose qui peut être déterminée par cette technique est bien en deçà du maximum réel, bien qu’il soit encore possible de mesurer des différences pertinentes dans la phagocytose entre souches et conditions24. Pour déterminer le taux maximum de phagocytose, absorption doit être mesurée en secouant la suspension par un protocole alternatif27. Les cellules qui ont phagocytés perles ont augmenté de diffusion latérale, donc cela devrait être corrigé pour en conséquence lorsque vous configurez le cytomètre en flux.
Cytométrie en flux peut être utilisée pour mesurer l’absorption de liquide dans les cellules de mammifères,32, toutefois la proportion plus élevée de liquide phase absorption par d’autres voies d’endocytose que vu chez Dictyostelium est un sujet de préoccupation. En outre, les cellules sont détachent généralement à l’aide de trypsine à 37 ° C, permettant outre endocytose progression de dextran intériorisée. L’azoture de sodium glacée ne provoque pas de macrophages de se détacher de la surface (Williams, inédites d’observation), ce qui rend cette technique non applicable aux cellules mammifères sans optimisation supplémentaire.
Mesure de débit élevé de macropinocytose a le potentiel d’être utilisé pour dépister rapidement et à moindre coût les effets des inhibiteurs, mutation génétique ou de gène sur les cellules de Dictyostelium . Des mutants doivent toujours être comparées à leur parent direct seulement. Si le lecteur n’a aucune préférence préalable pour la souche de Dictyostelium , des souches non-axéniques comme DdB ou NC4 sont plus « sauvage » que les axéniques et peuvent être manipulés aussi efficacement que les souches axéniques33. Dans le cas contraire, Ax2 souches sont l’axéniques souches possédant le moins génome duplications34, tandis que de nombreuses souches de Ax4 sont débouchures de Talin A et devraient être évité si possible23. Plupart des souches publiées antérieurement peuvent être commandés auprès l’ Dicty Stock Center35.
Cette technique permet de plus grandes possibilités d’investigation était auparavant impossible sur les effets de différentes conditions, des inhibiteurs et des mutations sur macropinocytose de Dictyostelium.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions le Medical Research Council UK pour financement RRK (U105115237) de base.
LSR_II flow cytometer | BD Biosciences | – | Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD |
TRITC-dextran (155 kDa) | Sigma-Aldrich | T1287 | Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine |
HL5 medium | Formedium | HLGCFG | |
96-well tissue culture plate | Corning | 3596 | Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work |
Dihydrostreptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1517 | |
Ampicillin sodium | Formdium | AMP50 | |
Kanamycin monosulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
Sodium azide | VWR | 103694M | |
Magnesium sulfate hydrate | VWR | 25169.295 | |
Calcium chloride dihydrate | VWR | 1.02382.0250 | |
Potassium dihydrogen phopshate | VWR | 1.04877.1000 | |
Di-potassium hydrogen phosphate | VWR | 1.05104.1000 | |
Fluorimeter | Perkin-Elmer | LS 50 B | |
FM1-43 | Thermofisher | T35356 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 µm | Polysciences | 15702-10 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 µm | Polysciences | 09719-10 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 µm | Polysciences | 17687-5 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 µm | Polysciences | 09847-5 | |
Texas Red E. coli bioparticles | Thermofisher | E2863 | |
Flow-set fluorospheres | Beckman Coulter | 6607007 | Calibration Beads |
SM agar | Formedium | SMACFG | |
0.22 µm syringe filter | Elkay Laboratory Products | E25-PS22-50S | |
10 mL Syringe | Becton Dickinson | 302188 | |
Round-bottom polystyrene tubes | Corning | 352058 | Use a tube that will fit onto your flow cytometer. |
70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
50 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.547.004 | |
Repeating pipette | Eppendorf | M4-SK | |
5 mL repeating pipette tips | Eppendorf | 30089650 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
LY294002 | Cayman Chemical Company | 70920 | |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG |