Macropinocytosis, grootschalige aspecifieke vloeibare opname, is belangrijk in veel gebieden van de klinische biologie met inbegrip van immunologie, infectie, kanker en neurodegeneratieve ziekten. Hier, zijn bestaande technieken aangepast om high-throughput, eencellige resolutie meting van macropinocytosis in het macropinocytosis model organisme Dictyostelium discoideum met stroom cytometry.
Grootschalige aspecifieke vloeibare opname door macropinocytosis is belangrijk voor de verspreiding van bepaalde kankercellen, antigeen bemonstering, host cel invasie en de verspreiding van neurodegeneratieve ziekten. De meest gebruikte laboratorium-stammen van de amoebe Dictyostelium discoideum hebben extreem hoge vocht opname tarieven als volwassen in voedingsbodem, meer dan 90% daarvan te wijten aan macropinocytosis is. Daarnaast zijn veel van de bekende basisonderdelen van zoogdieren afkomstig macropinocytosis ook aanwezig, waardoor het een uitstekende modelsysteem voor het bestuderen van macropinocytosis. Hier, is de standaard techniek voor het meten van verinnerlijkte vloeistof met behulp van fluorescerende dextran als een label aangepast aan het formaat van een 96-wells-plaat, met de monsters geanalyseerd door cytometry van de stroom met behulp van een high-throughput bemonstering (HTS) bevestiging.
Cellen worden niet-quenchable fluorescerende dextran voor een vooraf bepaalde tijdsduur, gewassen door onderdompeling in ijskoude buffer en vrijstaand met behulp van natriumazide van 5 mM, die ook exocytose stopt gevoed. Cellen in elk putje worden vervolgens geanalyseerd door stroom cytometry. De methode kan ook worden aangepast voor het meten van de membraan opname- en fagocytose van fluorescerende kralen of bacteriën.
Deze methode werd ontworpen om meting van vloeibare opname door Dictyostelium in een high-throughput, arbeid en resource-efficiënt. Hierdoor wordt gelijktijdige vergelijking van meerdere stammen (bijvoorbeeld knockout mutanten van een gen) en voorwaarden (bijvoorbeeld cellen in verschillende media of behandeld met verschillende concentraties van remmer) parallel en tijdsverloop vereenvoudigt.
Grootschalige aspecifieke vloeibare opname door macropinocytosis is belangrijk in verschillende biologische contexten1, met inbegrip van de bemonstering van het antigeen door immuun cellen2, pathogen indienststelling gastheer cellen3, kanker cel proliferatie4 en de verspreiding van prion ziekten5. In het zoogdier- en Dictyostelium cellen, actine6,7, PI (3,4,5) P3-8,–9,10 (hoewel de exacte aard van de lipide verschilt tussen de twee11), geactiveerd RAS12,13, en geactiveerde Rac14,15 zijn belangrijk voor efficiënte vloeibare opname door macropinocytosis, hoewel er nog veel onbeantwoorde vragen over de manier waarop de patch macropinocytic gevormd, georganiseerd en uiteindelijk verinnerlijkte. Ontdekken meer eiwitten belangrijk voor macropinocytosis, en de daaropvolgende bepaling van hoe ze belangrijk in de verschillende biologische contexten zijn, zal een uitgebreidere kennis van macropinocytosis en mogelijk maakt van de ontwikkeling van gerichte behandelingen voor een scala van omstandigheden.
Dictyostelium is een ideaal model voor het bestuderen van macropinocytosis. Het hoge niveau van constituerende macropinocytosis in standaard laboratorium stammen betekent dat vocht opname is meer dan 90% als gevolg van de macropinocytosis6. Hierdoor macropinocytosis meetoplossingen uitsluitend door het bepalen van de vloeibare opname, in tegenstelling tot cellen van zoogdieren, waar het aandeel van de vloeibare opname als gevolg van macropinocytosis veel lager is. Die macropinocytosis is zo goed omschreven en gemakkelijk gevisualiseerde12 in dit systeem ook biedt duidelijke voordelen voor het onderzoeken van core bewaarde onderdelen van de macropinosome over andere systemen waar kunnen er meerdere regelgevende signalen 16 , 17.
De standaard techniek die gebruikt wordt voor het meten van macropinocytosis door zoogdiercellen omvat vaststelling van cellen na de pulserende met dextran gedurende een korte tijd gevolgd door microscopie om te bepalen op het gebied van een cel die wordt bezet door dextran-positieve blaasjes18. Deze techniek houdt geen echter rekening met de mogelijkheid van macropinosomes bij binnenkomst van de cel, die is gemeld in Dictyostelium19, en alleen rekening gehouden met enkele vliegtuigen van de cel, wat betekent dat het volume geïnternaliseerd krimpen is onduidelijk. Een alternatieve techniek voor het tellen van het aantal macropinosomes geïnternaliseerd binnen een bepaalde tijd, heeft het dezelfde nadelen20. Met behulp van Dictyostelium vermijdt deze kwesties; bestaande technieken voor het meten van vocht opname door Dictyostelium zijn echter relatief arbeidsintensief, met behulp van een grote hoeveelheid cellen zowel dextran21. Cellen worden geschud bij hoge dichtheid in fluorescerende dextran en monsters op verschillende tijdstippen voor bepaling van de verinnerlijkte fluorescentie met behulp van een fluorimeter verwijderd. Cellen voorbereid op deze manier kunnen worden geanalyseerd door stroom cytometry te winnen van eencellige, in plaats van populatieniveau, resolutie22, hoewel dit laag-doorvoer blijft.
Hier, is de standaard techniek voor het meten van verinnerlijkte vloeistof met behulp van fluorescerende dextran als een label aangepast aan het formaat van een 96-wells-plaat, met de monsters geanalyseerd door cytometry van de stroom met behulp van een high-throughput bemonstering (HTS) bevestiging. Cellen worden niet-quenchable fluorescerende dextran voor een vooraf bepaalde tijdsduur, gewassen door onderdompeling in ijskoude buffer en vrijstaand met behulp van natriumazide van 5 mM, die ook exocytose stopt gevoed. Cellen in elk putje worden vervolgens geanalyseerd door stroom cytometry. Deze methode werd ontworpen om de beperkingen van de bovenstaande methoden en gelijktijdige vergelijking van de vloeibare opname van grote aantallen stammen/voorwaarden toestaan terwijl minder bronnen gebruikt en vermindering van de arbeid betrokken.
Overwegende dat andere methoden voor het beoordelen van de vloeibare opname lage doorvoersnelheid, wassen van de cellen in situ en het gebruik van natriumazide loskoppelen van cellen zijn de kritische stappen in deze methode, waarmee high-throughput meting van macropinocytosis, membraan opname, of fagocytose door Dictyostelium. Als de cellen zijn gekoppeld aan een oppervlak en het medium niet is, kunnen ze worden links aangesloten terwijl het medium om hen heen is eerst afgeworpen en vervolgens gewijzigd door onderdompeling in de buffer en weer afgeworpen. Natriumazide, die put cellulaire ATP en depolarizes van de membraan30, wordt vervolgens gebruikt om de cellen los te maken en ook voorkomt exocytose zonder cel levensvatbaarheid24.
Terwijl met behulp van cytometry van de stroom te meten macropinocytosis door Dictyostelium een zeer nauwkeurige meting van de vloeibare opname zeer snel, geeft om de reden waarom een bepaalde spanning of aandoening vloeibare opname, veranderd verder onderzoek met behulp microscopie is vereist24. Ook opgemerkt moet worden dat eerder gepubliceerde resultaten, in sommige gevallen is gebleken een verschil in vloeibare opname door gemuteerde stammen gegroeid op een oppervlak (zoals in dit geval), of in het schudden van schorsing (zoals in het standaard protocol)31. Met deze methode kan betekenen dat in zeldzame gevallen blijkt vloeibare opname gebreken worden gemist. Daarnaast, bij het meten van fagocytose, kunnen alleen lage concentraties van deeltjes worden gebruikt. Het maximumpercentage van fagocytose die kan worden bepaald met deze techniek ligt ver onder het echte maximum, hoewel het nog steeds mogelijk is te meten van relevante verschillen in fagocytose tussen stammen en voorwaarden24. Om te bepalen van het maximumpercentage van fagocytose, worden opname gemeten in het schudden van de schorsing door een alternatieve protocol27. Cellen die zijn phagocytosed kralen toegenomen kant scatter, dus dit moet worden gecorrigeerd voor dienovereenkomstig bij het opzetten van de cytometer van de stroom.
Stroom cytometry kan worden gebruikt voor het meten van vocht opname in zoogdiercellen32, echter het hogere percentage van vloeistof fase opname door andere endocytotische trajecten dan gezien in Dictyostelium is een bron van zorg. Daarnaast zijn cellen meestal vrijstaand met behulp van trypsine bij 37 ° C, waardoor verdere endocytotische progressie van verinnerlijkte dextran. Ijskoude natriumazide veroorzaakt geen macrofagen loskoppelen van een oppervlak (Williams, ongepubliceerde waarneming), maken van deze techniek niet van toepassing op zoogdiercellen zonder verdere optimalisatie.
Hoge-doorvoer meting van macropinocytosis heeft het potentieel om te worden gebruikt om het scherm snel en goedkoop voor de effecten van Remmers, genetische mutatie of gene knockdown op Dictyostelium cellen. Mutanten moeten altijd worden vergeleken met hun direct bovenliggende alleen. Als de lezer geen voorafgaande voorkeur voor Dictyostelium stam heeft, niet-een stammen zoals DdB of NC4 meer “wild-type” dan een en net zo effectief als een stammen33kunnen worden gemanipuleerd. Anders, Ax2 stammen zijn de Axenische stammen met de minste genoom duplicaties34, terwijl vele spanningen van Ax4 Talin A uitsparingen en moeten worden vermeden indien mogelijk23. Meest eerder gepubliceerde stammen kunnen besteld worden vanaf de Dicty voorraad Center35.
Deze techniek maakt het mogelijk meer investigative mogelijkheden dan voorheen mogelijk naar de effecten van verschillende omstandigheden, remmers en mutaties op macropinocytosis door Dictyosteliumwas.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken de Medical Research Council, UK voor core RRK financiering (U105115237).
LSR_II flow cytometer | BD Biosciences | – | Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD |
TRITC-dextran (155 kDa) | Sigma-Aldrich | T1287 | Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine |
HL5 medium | Formedium | HLGCFG | |
96-well tissue culture plate | Corning | 3596 | Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work |
Dihydrostreptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1517 | |
Ampicillin sodium | Formdium | AMP50 | |
Kanamycin monosulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
Sodium azide | VWR | 103694M | |
Magnesium sulfate hydrate | VWR | 25169.295 | |
Calcium chloride dihydrate | VWR | 1.02382.0250 | |
Potassium dihydrogen phopshate | VWR | 1.04877.1000 | |
Di-potassium hydrogen phosphate | VWR | 1.05104.1000 | |
Fluorimeter | Perkin-Elmer | LS 50 B | |
FM1-43 | Thermofisher | T35356 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 µm | Polysciences | 15702-10 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 µm | Polysciences | 09719-10 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 µm | Polysciences | 17687-5 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 µm | Polysciences | 09847-5 | |
Texas Red E. coli bioparticles | Thermofisher | E2863 | |
Flow-set fluorospheres | Beckman Coulter | 6607007 | Calibration Beads |
SM agar | Formedium | SMACFG | |
0.22 µm syringe filter | Elkay Laboratory Products | E25-PS22-50S | |
10 mL Syringe | Becton Dickinson | 302188 | |
Round-bottom polystyrene tubes | Corning | 352058 | Use a tube that will fit onto your flow cytometer. |
70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
50 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.547.004 | |
Repeating pipette | Eppendorf | M4-SK | |
5 mL repeating pipette tips | Eppendorf | 30089650 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
LY294002 | Cayman Chemical Company | 70920 | |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG |