Macropinocytosis, 大规模的非特定液体摄取, 是重要的许多领域的临床生物学包括免疫学, 感染, 癌症和神经退行性疾病。在这里, 现有的技术已经适应了允许高通量, 单细胞分辨率测量 macropinocytosis 在 macropinocytosis 模型生物盘基柄柄使用流式细胞仪。
macropinocytosis 对某些癌细胞的增殖、抗原取样、宿主细胞侵袭和神经退行性疾病的传播都具有重要的意义。柄虫盘基柄的常用实验室菌株在营养培养基中生长时具有极高的流体吸收率, 其中超过90% 是由于 macropinocytosis。此外, 哺乳动物 macropinocytosis 的许多已知核心成分也存在, 这使得它成为研究 macropinocytosis 的优秀模型系统。在这里, 用荧光葡聚糖作为标签来测量内化流体的标准技术适应了96井板格式, 用流式细胞仪分析了使用高通量取样 (高温超导) 附件的样品。
细胞被喂食非具有易点燃荧光葡聚糖的预先确定的时间长度, 浸泡在冰冷的缓冲和分离使用5毫米叠氮化钠, 这也停止胞吐作用。然后用流式细胞仪对各井的细胞进行分析。该方法还可用于测量荧光珠或细菌的膜吸收和吞噬功能。
这一方法的设计, 以允许测量流体吸收的盘基柄在高通量, 劳动力和资源有效的方式。它允许同时比较多个菌株 (如基因的挖空突变体) 和条件 (如不同培养基中的细胞或不同浓度的抑制剂) 平行和简化时间课程。
macropinocytosis 的大规模非特异流体吸收在几个生物学环境中是重要的1, 包括免疫细胞抗原取样2, 病原体进入宿主细胞3, 癌细胞增殖4和传播朊病毒疾病5。在哺乳动物和盘基柄细胞中, 肌动蛋白6,7, PI (34, 5) P38,9,10 (虽然脂质的确切性质不同的两个11), 激活Ras12,13和活化 Rac14,15是重要的有效的流体吸收 macropinocytosis, 虽然仍然有许多悬而未决的问题, 关于如何 macropinocytic 补丁是形成, 组织和最终内化。发现更多的蛋白质对 macropinocytosis 重要, 并随后确定它们如何在不同的生物学环境中是重要的, 将给予更全面的理解 macropinocytosis, 并可能允许发展有针对性的治疗范围的条件。
盘基柄是研究 macropinocytosis 的理想模型系统。标准实验室菌株本构 macropinocytosis 的高水平意味着, 由于 macropinocytosis6, 流体摄取量超过90%。这使得 macropinocytosis 仅通过确定流体摄取量来测量, 不同于哺乳动物细胞, 因为 macropinocytosis 的液体摄取比例要低得多。macropinocytosis 是如此清楚地定义和容易地可视化12在这个系统相似地提供独特的好处为调查 macropinosome 的核心保守的组分在其他系统可能有多个调控信号16,17。
用于测量哺乳动物细胞 macropinocytosis 的标准技术涉及在短时间内用葡聚糖脉冲固定细胞, 然后用显微术来确定由葡聚糖阳性囊泡18所占据的细胞的面积。然而这项技术不考虑 macropinosomes 收缩的可能性, 当进入细胞, 在盘基柄19报告了, 并且只考虑了细胞的单平面, 意味容量内部化尚不清楚。一种替代技术, 计算在给定时间内内化的 macropinosomes 的数量, 有相同的缺点20。使用盘基柄避免了这些问题;然而, 现有的测量盘基柄液体摄取的技术是相对劳力密集型的, 使用大量的细胞和葡聚糖21。细胞在高密度的荧光葡聚糖和样品去除在不同的时间点, 以确定内化荧光使用 fluorimeter。这种方法制备的细胞可以通过流式细胞仪来分析, 以获得单细胞, 而不是人口级的分辨率22, 尽管这仍然是低吞吐量的。
在这里, 用荧光葡聚糖作为标签来测量内化流体的标准技术适应了96井板格式, 用流式细胞仪分析了使用高通量取样 (高温超导) 附件的样品。细胞被喂食非具有易点燃荧光葡聚糖的预先确定的时间长度, 浸泡在冰冷的缓冲和分离使用5毫米叠氮化钠, 这也停止胞吐作用。然后用流式细胞仪对各井的细胞进行分析。该方法的目的是克服上述方法的局限性, 并允许同时比较的液体吸收大量的菌株/条件, 同时使用较少的资源和减少劳动所涉及的。
而其他评估流体吸收的方法是低吞吐量,就地洗涤细胞和使用叠氮化钠分离细胞是这种方法的关键步骤, 允许高通量测量 macropinocytosis, 膜吸收, 或盘基柄吞噬。当细胞被连接到一个表面, 而培养基不是, 它们可以被附加, 而在它们周围的介质首先被抛出, 然后通过沉浸在缓冲和再次抛出。叠氮化钠, 耗尽细胞 ATP 和 depolarizes 膜30, 然后用于分离细胞, 也防止胞吐作用不影响细胞活力24。
当使用流式细胞仪测量 macropinocytosis 的盘基柄给出非常准确的测量液体摄取非常迅速, 以确定为什么一个特定的应变或条件改变了流体摄取, 进一步调查使用显微镜是必需的24。还应指出的是, 以前公布的结果在某些情况下表明, 在表面上生长的突变株 (如本例), 或在震动悬浮 (如标准议定书)31中, 液体吸收的差异。使用这种方法可能意味着, 在罕见的情况下, 明显的液体摄取缺陷被遗漏。另外, 在测量吞噬功能时, 只能使用低浓度的微粒。这种技术可以确定的吞噬功能的最大速率远远低于实际的最大值, 尽管仍然可以测量菌株与条件之间的吞噬功能的相关差异24。为了确定吞噬功能的最大速率, 必须通过备选协议27来测量震动悬浮中的吸收量。有吞噬珠子的细胞增加了侧向散射, 因此在设置流式室仪时应相应地改正。
流式细胞术可用于测量哺乳动物细胞中的液体摄取量32, 然而, 其他吞通路比盘基柄所见的更高比例的液相吸收是一个值得关注的问题。此外, 细胞通常被分离使用胰蛋白酶在37°c, 允许进一步吞进展的内聚糖酐。冰冷叠氮化钠不会导致巨噬细胞从表面分离 (威廉斯, 未发表的观察), 使得这种技术不适用于哺乳动物细胞而没有进一步的优化。
高通量测量 macropinocytosis 有可能被用来快速和廉价地筛查抑制剂, 基因突变或基因击倒在盘基柄细胞的影响。变种人应该总是和他们的直系父母相比。如果读者没有事先偏爱盘基柄菌株, 非无菌菌株, 如 DdB 或 NC4 比无菌更 “野生型”, 可以有效地操作无菌菌株33。否则, Ax2 菌株是基因组重复度最少34的无菌菌株, 而 Ax4 的许多菌株塔林一个挖空, 如果可能的话, 应该避免23。大多数以前发布的菌株可以从 Dicty 股票中心订购35。
这种技术允许比以前更大的调查可能性的影响, 不同的条件, 抑制剂和突变对 macropinocytosis 的盘基柄。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢英国医学研究委员会 (U105115237) 对 RRK 的核心资助。
LSR_II flow cytometer | BD Biosciences | – | Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD |
TRITC-dextran (155 kDa) | Sigma-Aldrich | T1287 | Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine |
HL5 medium | Formedium | HLGCFG | |
96-well tissue culture plate | Corning | 3596 | Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work |
Dihydrostreptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1517 | |
Ampicillin sodium | Formdium | AMP50 | |
Kanamycin monosulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
Sodium azide | VWR | 103694M | |
Magnesium sulfate hydrate | VWR | 25169.295 | |
Calcium chloride dihydrate | VWR | 1.02382.0250 | |
Potassium dihydrogen phopshate | VWR | 1.04877.1000 | |
Di-potassium hydrogen phosphate | VWR | 1.05104.1000 | |
Fluorimeter | Perkin-Elmer | LS 50 B | |
FM1-43 | Thermofisher | T35356 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 µm | Polysciences | 15702-10 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 µm | Polysciences | 09719-10 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 µm | Polysciences | 17687-5 | |
Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 µm | Polysciences | 09847-5 | |
Texas Red E. coli bioparticles | Thermofisher | E2863 | |
Flow-set fluorospheres | Beckman Coulter | 6607007 | Calibration Beads |
SM agar | Formedium | SMACFG | |
0.22 µm syringe filter | Elkay Laboratory Products | E25-PS22-50S | |
10 mL Syringe | Becton Dickinson | 302188 | |
Round-bottom polystyrene tubes | Corning | 352058 | Use a tube that will fit onto your flow cytometer. |
70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
50 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.547.004 | |
Repeating pipette | Eppendorf | M4-SK | |
5 mL repeating pipette tips | Eppendorf | 30089650 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
LY294002 | Cayman Chemical Company | 70920 | |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG |