قياس الإنتاجية العالية من ماكروبينوسيتوسيس ديسكويديوم ديكتيوستيليوم "التدفق الخلوي"
Summary
من المهم ماكروبينوسيتوسيس، امتصاص السوائل غير محددة على نطاق واسع، في العديد من مجالات البيولوجيا السريرية بما في ذلك أمراض المناعة والعدوى والسرطان والأعصاب. هنا، قد كيفت للسماح بالقرار الفائق، خلية واحدة قياس ماكروبينوسيتوسيس في ماكروبينوسيتوسيس طراز الكائن الحي ديسكويديوم ديكتيوستيليوم باستخدام التدفق الخلوي التقنيات الموجودة.
Abstract
امتصاص السوائل غير محددة واسعة النطاق ماكروبينوسيتوسيس مهم لانتشار بعض الخلايا السرطانية مستضد أخذ العينات وغزو الخلية المضيفة وانتشار أمراض الأعصاب. وقد السلالات المختبرية المستخدمة عادة من الاميبا ديسكويديوم ديكتيوستيليوم معدلات عالية للغاية من امتصاص السوائل عندما نمت في المتوسط المغذيات، أكثر من 90% منها بسبب ماكروبينوسيتوسيس. وبالإضافة إلى ذلك، العديد من المكونات الأساسية المعروفة للثدييات ماكروبينوسيتوسيس موجودة أيضا، مما يجعل من نظام نموذجا ممتازا لدراسة ماكروبينوسيتوسيس. هنا، الأسلوب القياسي لقياس السوائل المدخلة باستخدام ديكستران فلوري كتسمية يتكيف مع شكل لوحة 96-جيدا، مع العينات التي تم تحليلها بالتدفق الخلوي باستخدام ملحق الفائق أخذ عينات (HTS).
ويتم تغذية الخلايا ديكستران الفلورية غير قوينتشابل لمدة محددة سلفا من الوقت، غسلها بالانغماس في المخزن المؤقت المثلج وفصل استخدام أزيد الصوديوم 5 مم، التي توقف الرقابة أيضا. ثم يتم تحليل خلايا في كل بئر بالتدفق الخلوي. الأسلوب كما يمكن تكييفها لقياس امتصاص الغشاء والبلعمه من الخرز الفلورسنت أو البكتيريا.
هذا الأسلوب صمم للسماح لقياس امتصاص السوائل ديكتيوستيليوم بطريقة تتسم بكفاءة العالية الإنتاجية والعمالة والموارد. أنه يسمح بمقارنة متزامنة لسلالات (مثل خروج المغلوب طفرات الجينات) وشروط متعددة (مثل الخلايا في وسائل الإعلام المختلفة أو تعامل مع تركيزات مختلفة من المانع) بالتوازي ويبسط الدورات الزمنية.
Introduction
امتصاص السوائل غير محددة واسعة النطاق ماكروبينوسيتوسيس مهم في عدة سياقات البيولوجية1، بما في ذلك أخذ العينات مستضد بالمناعة الخلايا2، دخول الممرض المضيف الخلايا3، سرطان الخلية الانتشار4 انتشار أمراض بريون5. وفي الثدييات وخلايا ديكتيوستيليوم ، PI أكتين6،7،9،،من8ف-3 (3,4,5)10 (على الرغم من أن الطبيعة الدقيقة للمادة الدهنية تختلف بين اثنين11)، وتنشيط رأس12،13و14،راك المنشط15 هامة لكفاءة امتصاص السوائل ماكروبينوسيتوسيس، على الرغم من أنه لا تزال هناك العديد من الأسئلة دون إجابة حول كيف يتم التصحيح ماكروبينوسيتيك تشكيل المنظمة والمدخلة في نهاية المطاف. اكتشاف البروتينات أكثر أهمية بالنسبة ماكروبينوسيتوسيس، وفيما بعد، تحديد كيف أنها هامة في مختلف السياقات البيولوجية، سوف تعطي فهم أكثر شمولاً من ماكروبينوسيتوسيس ومن المحتمل أن يسمح تطوير واستهدفت علاجات لمجموعة من الشروط.
ديكتيوستيليوم نظام نموذج مثالي لدراسة ماكروبينوسيتوسيس. مستوى عال من ماكروبينوسيتوسيس التأسيسي في سلالات المختبر القياسية يعني أن امتصاص السوائل هو ما يزيد على 90 في المائة بسبب ماكروبينوسيتوسيس6. وهذا ما يسمح ماكروبينوسيتوسيس أن يقاس فقط بتحديد امتصاص السوائل، وخلافا لخلايا الثدييات حيث أن نسبة امتصاص السوائل بسبب ماكروبينوسيتوسيس أقل بكثير. ماكروبينوسيتوسيس يعرف جيدا جداً، ويقدم بسهولة تصور12 في هذا النظام وبالمثل مزايا واضحة للتحقيق الأساسية مكونات مصانة ماكروبينوسومي على النظم الأخرى حيث قد يكون هناك إشارات تنظيمية متعددة 16 , 17.
هذه التقنية القياسية المستخدمة لقياس ماكروبينوسيتوسيس بخلايا الثدييات ينطوي على تحديد الخلايا بعد النبض مع ديكستران لفترة قصيرة من الوقت متبوعاً بالفحص المجهري لتحديد منطقة الخلية التي تحتلها الحويصلات ديكستران إيجابية18. هذا الأسلوب لا تمثل مع ذلك إمكانية ماكروبينوسوميس تقلص عند دخول الخلية، التي سجلت في ديكتيوستيليوم19، ويأخذ في الحسبان سوى الطائرات وحيدة الخلية، بمعنى أن حجم استيعابه وليس واضحا. أسلوب بديل، لإحصاء عدد ماكروبينوسوميس في وقت معين، قد سلبيات نفس20. استخدام ديكتيوستيليوم تجنب هذه القضايا؛ ومع ذلك، التقنيات الموجودة لقياس امتصاص السوائل ديكتيوستيليوم نسبيا كمية العمل المكثف، باستخدام كبير للخلايا وديكستران21. يتم هز الخلايا في كثافة عالية في ديكستران الفلورسنت وإزالتها في نقاط زمنية مختلفة لتحديد الأسفار المدخلة فلوريميتير باستخدام عينات. يمكن تحليل الخلايا التي أعدت هذه الطريقة بالتدفق الخلوي للحصول على خلية واحدة، بدلاً من مستوى السكان،22من القرار، على الرغم من أن هذه تظل منخفضة الإنتاجية.
هنا، الأسلوب القياسي لقياس السوائل المدخلة باستخدام ديكستران فلوري كتسمية يتكيف مع شكل لوحة 96-جيدا، مع العينات التي تم تحليلها بالتدفق الخلوي باستخدام ملحق الفائق أخذ عينات (HTS). ويتم تغذية الخلايا ديكستران الفلورية غير قوينتشابل لمدة محددة سلفا من الوقت، غسلها بالانغماس في المخزن المؤقت المثلج وفصل استخدام أزيد الصوديوم 5 مم، التي توقف الرقابة أيضا. ثم يتم تحليل خلايا في كل بئر بالتدفق الخلوي. تم تصميم هذا الأسلوب التغلب على أوجه قصور الأساليب المذكورة أعلاه وتسمح بمقارنة متزامنة لامتصاص السوائل عدد كبير من سلالات/الظروف أثناء استخدام موارد أقل، والحد من العمال المعنيين.
Protocol
Representative Results
Discussion
بينما أساليب أخرى لتقدير امتصاص السوائل منخفضة الإنتاجية، غسل الخلايا في الموقع ، واستخدام أزيد الصوديوم لفصل الخلايا هي الخطوات الحاسمة في هذا الأسلوب، والتي تسمح بقياس الإنتاجية العالية من ماكروبينوسيتوسيس، امتصاص الغشاء، أو البلعمه من ديكتيوستيليوم. كما يتم إرفاق الخلايا إلى سطح وليس المتوسط، يمكن غادر تعلق بينما المتوسط حولهم هو أولاً خلعت وثم تغيرت بالانغماس في المخزن المؤقت وخلعت مرة أخرى. أزيد الصوديوم، مما يستنزف ATP الخلوي و الغشاء30ديبولاريزيس، ثم يستخدم لفصل الخلايا، وأيضا يمنع الرقابة دون التأثير على الخلية صلاحية24.
بينما استخدام التدفق الخلوي لقياس ماكروبينوسيتوسيس من ديكتيوستيليوم يعطي مقياسا دقيقا جداً لامتصاص السوائل بسرعة كبيرة، تحديد السبب لماذا غيرت سلالة معينة أو شرط امتصاص السوائل، زيادة استخدام التحقيق المجهر هو المطلوب24. كما تجدر أن أظهرت النتائج المنشورة سابقا، في بعض الحالات، فرقا في امتصاص السوائل من سلالات متحولة نمت أما على سطح (كما هو الحال في هذه الحالة)، أو في الهز تعليق (كما هو الحال في بروتوكول قياسي)31. باستخدام هذا الأسلوب قد يعني أنه، في حالات نادرة، هي غاب العيوب الواضحة امتصاص السوائل. بالإضافة إلى ذلك، عند قياس البلعمه، يمكن أن تستخدم فقط بتركيزات منخفضة من الجسيمات. الحد الأقصى لمعدل البلعمه التي يمكن تحديدها مع هذا الأسلوب أقل بكثير من الحد الأقصى الحقيقية، على الرغم من أنه لا يزال من الممكن قياس الاختلافات ذات الصلة بين السلالات وظروف24في البلعمه. لتحديد الحد الأقصى لمعدل البلعمه، يجب أن يقاس امتصاص في الهز تعليق ب بروتوكول بديلة27. الخلايا التي قد فاجوسيتوسيد الخرز زادت مبعثر الجانب، حيث ينبغي تصحيح هذا لبناء على ذلك عند إعداد cytometer التدفق.
يمكن استخدام التدفق الخلوي لقياس امتصاص السوائل في خلايا الثدييات32، لكن نسبة أعلى من السوائل المرحلة الإقبال بمسارات أخرى اندوسيتيك من ينظر في ديكتيوستيليوم مصدر قلق. وبالإضافة إلى ذلك، يتم فصل الخلايا عادة استخدام التربسين في 37 درجة مئوية، مما يتيح مواصلة التقدم اندوسيتيك من ديكستران المدخلة. أزيد الصوديوم المثلج لا تسبب الضامة لفصل من سطح (ويليامز، والمراقبة غير منشورة)، مما يجعل هذا الأسلوب لا ينطبق على خلايا الثدييات دون مزيد من التحسين.
قياس الإنتاجية العالية من ماكروبينوسيتوسيس لديه القدرة على استخدامها على الشاشة بسرعة وبتكاليف زهيدة لتأثيرات مثبطات، والطفرات الوراثية أو الجينات ضربة قاضية على الخلايا ديكتيوستيليوم . وينبغي دائماً مقارنة طفرات للوالدين المباشر فقط. إذا كان القارئ ليس لديه تفضيل مسبق لسلالة ديكتيوستيليوم ، سلالات غير أكسينيك مثل DdB أو NC4 أكثر “البرية من نوع” من تلك التي أكسينيك ويمكن معالجته فعالية كسلالات أكسينيك33. وإلا فهي سلالات Ax2 أكسينيك سلالات مع أقل عدد الجينوم الازدواجية34، في حين أن العديد من سلالات Ax4 تالين بالضربة القاضية وينبغي أن تكون تجنبها إذا أمكن23. يمكن طلب معظم سلالات المنشورة سابقا من مركز الأسهم ديكتي35.
هذا الأسلوب يتيح إمكانيات التحقيق أكبر مما كان ممكناً في السابق إلى آثار الظروف المختلفة، ومثبطات والطفرات في ماكروبينوسيتوسيس من ديكتيوستيليوم.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر “مجلس البحوث الطبية” المملكة المتحدة للتمويل (U105115237) إلى ررك الأساسي.
Materials
| LSR_II flow cytometer | BD Biosciences | – | Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD |
| TRITC-dextran (155 kDa) | Sigma-Aldrich | T1287 | Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine |
| HL5 medium | Formedium | HLGCFG | |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3596 | Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work |
| Dihydrostreptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1517 | |
| Ampicillin sodium | Formdium | AMP50 | |
| Kanamycin monosulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Sodium azide | VWR | 103694M | |
| Magnesium sulfate hydrate | VWR | 25169.295 | |
| Calcium chloride dihydrate | VWR | 1.02382.0250 | |
| Potassium dihydrogen phopshate | VWR | 1.04877.1000 | |
| Di-potassium hydrogen phosphate | VWR | 1.05104.1000 | |
| Fluorimeter | Perkin-Elmer | LS 50 B | |
| FM1-43 | Thermofisher | T35356 | |
| Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 µm | Polysciences | 15702-10 | |
| Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 µm | Polysciences | 09719-10 | |
| Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 µm | Polysciences | 17687-5 | |
| Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 µm | Polysciences | 09847-5 | |
| Texas Red E. coli bioparticles | Thermofisher | E2863 | |
| Flow-set fluorospheres | Beckman Coulter | 6607007 | Calibration Beads |
| SM agar | Formedium | SMACFG | |
| 0.22 µm syringe filter | Elkay Laboratory Products | E25-PS22-50S | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 302188 | |
| Round-bottom polystyrene tubes | Corning | 352058 | Use a tube that will fit onto your flow cytometer. |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 50 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.547.004 | |
| Repeating pipette | Eppendorf | M4-SK | |
| 5 mL repeating pipette tips | Eppendorf | 30089650 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| LY294002 | Cayman Chemical Company | 70920 | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG |
Riferimenti
- Bloomfield, G., Kay, R. R. Uses and abuses of macropinocytosis. Journal of Cell Science. 129 (14), 2697-2705 (2016).
- Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocompatibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182 (2), 389-400 (1995).
- Hardt, W. D., Chen, L. M., Schuebel, K. E., Bustelo, X. R., Galan, J. E. S. typhimurium encodes an activator of Rho GTPases that induces membrane ruffling and nuclear responses in host cells. Cell. 93 (5), 815-826 (1998).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
- Munch, C., O’Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (9), 3548-3553 (2011).
- Hacker, U., Albrecht, R., Maniak, M. Fluid-phase uptake by macropinocytosis in Dictyostelium. Journal of Cell Science. 110, 105-112 (1997).
- Dowrick, P., Kenworthy, P., McCann, B., Warn, R. Circular ruffle formation and closure lead to macropinocytosis in hepatocyte growth factor/scatter factor-treated cells. European Journal of Cell Biology. 61 (1), 44-53 (1993).
- Buczynski, G., et al. Inactivation of two Dictyostelium discoideum genes, DdPIK1 and DdPIK2, encoding proteins related to mammalian phosphatidylinositide 3-kinases, results in defects in endocytosis, lysosome to postlysosome transport, and actin cytoskeleton organization. Journal of Cell Biology. 136, 1271-1286 (1997).
- Araki, N., Johnson, M. T., Swanson, J. A. A role for phosphoinositide 3-kinase in the completion of macropinocytosis and phagocytosis by macrophages. Journal of Cell Biology. 135 (5), 1249-1260 (1996).
- Araki, N., Egami, Y., Watanabe, Y., Hatae, T. Phosphoinositide metabolism during membrane ruffling and macropinosome formation in EGF-stimulated A431 cells. Experimental Cell Research. 313 (7), 1496-1507 (2007).
- Clark, J., et al. Dictyostelium uses ether-linked inositol phospholipids for intracellular signalling. The EMBO Journal. 33 (19), 2188-2200 (2014).
- Hoeller, O., et al. Two distinct functions for PI3-kinases in macropinocytosis. Journal of Cell Science. 126, 4296-4307 (2013).
- Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins. Science. 233 (4768), 1061-1068 (1986).
- Veltman, D. M., et al. A plasma membrane template for macropinocytic cups. Elife. 5, e20085 (2016).
- West, M. A., Prescott, A. R., Eskelinen, E. L., Ridley, A. J., Watts, C. Rac is required for constitutive macropinocytosis by dendritic cells but does not control its downregulation. Current Biology. 10 (14), 839-848 (2000).
- West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109, 2731-2739 (1989).
- Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284 (2016).
- Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).
- Clarke, M., Kohler, J., Heuser, J., Gerisch, G. Endosome fusion and microtubule-based dynamics in the early endocytic pathway of Dictyostelium. Traffic. 3, 791-800 (2002).
- Pacitto, R., Gaeta, I., Swanson, J. A., Yoshida, S. CXCL12-induced macropinocytosis modulates two distinct pathways to activate mTORC1 in macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 101 (3), 683-692 (2017).
- Rivero, F., Maniak, M. Quantitative and microscopic methods for studying the endocytic pathway. Methods in Molecular Biology. , 423-438 (2006).
- Bacon, R. A., Cohen, C. J., Lewin, D. A., Mellman, I. Dictyostelium discoideum mutants with temperature-sensitive defects in endocytosis. Journal of Cell Biology. 127, 387-399 (1994).
- Basu, S., Fey, P., Jimenez-Morales, D., Dodson, R. J., Chisholm, R. L. dictyBase 2015: Expanding data and annotations in a new software environment. Genesis. 53 (8), 523-534 (2015).
- Williams, T. D., Kay, R. R. The physiological regulation of macropinocytosis during Dictyostelium growth and development. Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).
- Tsujioka, M., et al. Overlapping functions of the two talin homologues in Dictyostelium. Eukaryotic Cell. 7 (5), 906-916 (2008).
- Aguado-Velasco, C., Bretscher, M. S. Circulation of the plasma membrane in Dictyostelium. Molecular Biology of the Cell. 10, 4419-4427 (1999).
- Sattler, N., Monroy, R., Soldati, T. Quantitative analysis of phagocytosis and phagosome maturation. Methods in Molecular Biology. 983, 383-402 (2013).
- Wilkins, A., Chubb, J., Insall, R. H. A novel Dictyostelium RasGEF is required for normal endocytosis, cell motility and multicellular development. Current Biology. 10, 1427-1437 (2000).
- Thomason, P. A., King, J. S., Insall, R. H. Mroh1, a lysosomal regulator localized by WASH-generated actin. Journal of Cell Science. 130 (10), 1785-1795 (2017).
- van Duijn, B., Vogelzang, S. A., Ypey, D. L., van der Molen, L. G., van Haastert, P. J. M. Normal chemotaxis in Dictyostelium discoideum cells with a depolarized plasma membrane potential. Journal of Cell Science. 95, 177-183 (1990).
- Novak, K. D., Peterson, M. D., Reedy, M. C., Titus, M. A. Dictyostelium myosin I double mutants exhibit conditional defects in pinocytosis. Journal of Cell Biology. 131, 1205-1221 (1995).
- Mercer, J., Helenius, A. Vaccinia virus uses macropinocytosis and apoptotic mimicry to enter host cells. Science. 320 (5875), 531-535 (2008).
- Paschke, P., et al. Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum. PLoS One. 13 (5), e0196809 (2018).
- Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum. Genome Biology. 9 (4), R75 (2008).
- Fey, P., Dodson, R. J., Basu, S., Chisholm, R. L. One stop shop for everything Dictyostelium: dictyBase and the Dicty Stock Center in 2012. Methods in Molecular Biology. 983, 59-92 (2013).
