免疫沉淀法研究受体与酶的功能相互作用
Summary
在这里, 我们提出了一个共同免疫沉淀的协议和一个在珠酶活性检测, 同时研究的具体蛋白质领域的血浆膜受体对酶的招募和酶活性。
Abstract
受体相关酶是细胞活化的主要媒介。这些酵素被调控, 至少部分, 由物理相互作用与受体的细胞质尾巴。这种相互作用经常发生在特定的蛋白质领域, 并导致酶的活化。有几种方法来研究蛋白质之间的相互作用。虽然共同免疫沉淀通常用于研究蛋白质与蛋白质相互作用所需的领域, 但没有化验证明特定领域对所吸收酶的活性的贡献。据此, 本文所描述的方法结合了免疫沉淀和一个珠状酶活性测定, 同时评价蛋白质与相关酶活化的相互作用。本协议的目标是确定对蛋白质和酶之间的物理交互至关重要的领域, 以及对酶的完全活化所必需的域。这一检测的重要性被证明, 因为某些受体蛋白域有助于酶对受体的细胞质尾部的结合, 而其他领域是必要的, 以调节同一酶的功能。
Introduction
催化受体和受体酪氨酸激酶是跨膜蛋白, 其中细胞外配体的结合导致酶活性的细胞内侧1。有些受体具有受体和酶功能, 而另一些则吸收特定的酶, 如激酶和磷酸的细胞质尾巴。在受体的尾部进行酶的招募, 以及随后这种酶的催化作用, 是两个不同的过程, 不总是由相同的蛋白域2调节。不幸的是, 没有具体的工具来评估相互作用和酶活性的同时。这里描述的功能性免疫沉淀检测是一种很有用的方法, 用于解剖从激活到受体的尾部的酶的招募。这种检测利用免疫沉淀的标记受体的抗体涂层珠。随后对珠进行酶活性测定和印迹分析。这个方法的总目标是发现哪些蛋白质领域是必要的在感受器官和酵素之间的相互作用 (由西部污点分析评估), 并且哪些领域是强制的对酵素的完全活化 (由在珠子测量酶活性测定)。开发用于研究受体相关酶的功能的工具是非常重要的, 因为它们参与了人类疾病的发病机制。此外, 进一步了解这些蛋白质的作用机制可以帮助设计新的治疗干预措施。
程控 death-1 (PD-1) 是 t 细胞表面的抑制受体, 是限制过度 t 细胞反应的必要条件。近年来, anti-PD-1 抗体已被牵连到治疗多发性恶性肿瘤1,2。PD-1 结扎抑制许多 T 细胞功能, 包括增殖, 黏附力和分泌多种细胞因子3,4,5。PD-1 的免疫突触, t 细胞和抗原呈现细胞之间的接口6, 它 colocalizes 与 T 细胞受体 (TCR)7。随后, 酪氨酸磷酸酶 SHP2 [Src 同源 2 (SH2) 域含有酪氨酸磷酸酶 2] 被招募到 PD-1 的细胞质尾部, 导致 TCR 复合体中关键酪氨酸残留物的除磷及其相关的近端信号分子3,4,5,8,9。PD-1 的细胞质尾包含两个酪氨酸图案, 一个 immunoreceptor 酪氨酸的抑制母题 (ITIM) 和一个 immunoreceptor 的酪氨酸基开关的主题 (ITSM)10。两个图案都是磷酸化后 PD-1 结扎9,10。突变研究揭示了 ITSM 在 SHP2 招聘中的主要作用, 而不是 ITIM, 后者在 PD-1 信号和功能方面的作用不清楚4。
SHP2 采用闭合 (折叠), 抑制构象或开放 (延长), 活跃构象11。PD-1 的每个尾部域对 SHP2 绑定或激活的贡献尚未阐明。为了回答这个问题, 我们开发了一种检测方法, 能够对 PD-1 的 SHP2 和它的活动12进行并行测试。我们采用了免疫沉淀和珠粒磷酸酶活性测定法, 同时测试了两者的相互作用和酶活性。使用这一方法, 我们表明, PD-1 的 ITSM 足以招募 SHP2 PD-1 的尾部, 而 ITIM PD-1 是需要充分扩展和激活的酶。
有许多受体有几个相邻的领域在他们的细胞质尾巴。功能性的免疫沉淀分析可以揭示特定领域的作用, 这是必要的蛋白质招募或酶活化。
Protocol
Representative Results
Discussion
受体-酶相互作用是细胞内信号的关键。许多酶被招募到受体通过 SH2 域绑定到磷酸化酪氨酸, 装饰的尾巴相同的受体。然而, 酶通常被折叠成闭合的非活性构象, 激活需要构象变化11 , 可以由同一受体的其他领域介导。这里描述的化验测量受体和酶之间的相互作用以及这些相互作用引起的活动。
我们使用了一种比色测定法, 利用 p-硝基苯磷酸 (pNPP) 作为基质的 S…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
该项目由 NIH 赠款1R01AI125640-01 和风湿病研究基金会资助。
Materials
| PBS | Lonza | 17-516F | Phosphate Buffered Saline |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424-R | 1.5 ml |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | Fetal bovine serum |
| Penicillin / Streptomycin | Fisher | BP295950 | |
| DMEM high glucose without L-glutamine | Lonza | BE12-614F | |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | |
| Anti-SHP2 | Santa Cruz | SC-280 | |
| Anti–GFP-agarose | MBL | D153-8 | |
| Anti-GFP | Roche | 118144600 | |
| Anti-Actin | Santa Cruz | SC-1616 | |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | 30% |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | EDTA-free |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | Modified Laemmli buffer |
| 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Invitrogen | XP04205BOX | 15-well |
| Nitrocellulose membranes | General Electric | 10600004 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Sodium chloride |
| HEPES | Gibco | 15630080 | N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid |
| DTT | Invitrogen | D1532 | Dithiothreitol |
| pNPP | Sigma | 20-106 | p-Nitrophenyl Phosphate |
| NaOH | Sigma | S8045 | Sodium hydroxide |
| BCA | Fisher | 23225 | Bi Cinchoninic Acid assay |
Riferimenti
- Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors. Molecular Cancer. 17 (1), (2018).
- Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex. Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).
- Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).
- Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation. The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).
- Patsoukis, N., et al. Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation. Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).
- Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).
- Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
- Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).
- Sheppard, K. A., et al. PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta. FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).
- Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).
- Sun, J., et al. Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2. Nature Communications. 4, 2037 (2013).
- Peled, M., et al. Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).
- Jang, S. H., et al. A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage. Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).
- Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains. The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).
- McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Shlapatska, L. M., et al. CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A. The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).
