JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscienze

מודל הרומן במבחנה של פגיעה מוחית טראומטית הפיצוץ

Published: December 21, 2018
doi:
10.3791/58400
, , , , , ,
1Anaesthetics, Pain Medicine and Intensive Care Section, Department of Surgery and Cancer,Imperial College London, 2Royal British Legion Centre for Blast Injury Studies, Department of Bioengineering,Imperial College London, 3Department of Bioengineering,Imperial College London, 4Department of Life Sciences,Imperial College London, 5Department of Anaesthetics,Royal Berkshire Hospital NHS Foundation Trust, 6Royal Centre for Defence Medicine,Medical Directorate Joint Force Command

Summary

מאמר זה מתאר מודל הרומן של פגיעה מוחית טראומטית פגיעה עיקריים. צינור אויר מונחה הלם משמש כדי לחשוף במבחנה בתרבויות פרוסה בהיפוקמפוס העכבר גל הלם יחיד. . זהו פרוטוקול פשוטה ומהירה ליצירת פגיעה ברקמות המוח לשחזור עם תפוקה גבוהה…

Abstract

פגיעה מוחית טראומטית היא הגורם המוביל למוות ונכות באוכלוסיות צבאיות ואזרחיות. תוצאות פגיעה מוחית טראומטית ההדף מהפיצוץ של מטעני חבלה, אולם, המנגנונים העומדים בבסיס הנזק המוחי כתוצאה מחשיפה הלחץ הפיצוץ אינה מובנת לחלוטין, מאמינים כי ייחודי לסוג זה של פגיעה מוחית. במודלים פרה הן כלי חיוני שתורמים להבין טוב יותר פגיעה מוחית הפיצוץ-induced. מודל TBI הפיצוץ הרומן במבחנה פותחה באמצעות שפופרת של שוק פתוח כדי לדמות את החיים האמיתיים בשדה פתוח הפיצוץ גלים וניסו מאת waveform פרידלנדר. עכבר C57BL/6N organotypic פרוסה בהיפוקמפוס תרבויות נחשפו גלי הלם יחיד ואת ההתפתחות של פציעה התאפיינה עד 72 h באמצעות propidium יודיד, סמן פלורסנט ומבוססת של נזק לתאים שרק חודר תאים עם נפגעת ממברנות הסלולר. קרינה פלואורסצנטית יודיד Propidium היה גבוה באופן משמעותי פרוסות נחשפים גל הדף בהשוואה עם פרוסות המזויפים בכל משך זמן של הפרוטוקול. הפגיעה ברקמות המוח הוא מאוד לשחזור פרופורציונליים ל- overpressure שיא של גל ההלם מוחל.

Introduction

הפיצוץ פציעת מוח טראומטית (TBI) הוא סוג מורכב של פגיעה מוחית כתוצאה מהפיצוץ של מטעני חבלה1,2. הפיצוץ TBI התפתחה גדול נושא הבריאות ב- 15 השנים האחרונות עם הקונפליקטים הצבאית האחרונה בעוד בעיראק ובאפגניסטן2,3. בסך הכל, ההערכה היא כי בין 4.4% 22.8% מהחיילים אותתה בעיראק ובאפגניסטן סבלו TBI מתון, אחוז גדול של אלה הקשורות הפיצוץ, עם שיעור גבוה יותר המדווחת של הפיצוץ TBI בצבא ארצות הברית לעומת כוחות בריטניה4 ,5.

השימוש של מטעני חבלה היה אחראי ביותר של הטראומה הקשורים הפיצוץ, כולל הפיצוץ TBI, שעבר על ידי כוחות הצבא6. הפיצוץ של פיצוץ מטען תוצאות מהירה מאוד — אבל ארעי – להגדיל בלחץ, המתרחשים באלפיות שניה. גל הלחץ שנוצר מפיצוץ שדה חינם אמיתי מדוגמנים על-ידי הפונקציה פרידלנדר, עלייה פתאומית כדי overpressure שיא ואחריו דעיכה מעריכית7,8. הטווח של כוחות קיצוניים וקורס זמן מהיר שלהם ראה באירוע הפיצוץ בדרך כלל מנוסים לא-הפיצוץ טראומות1,9. Overpressure שיא, המהווה את הלחץ המקסימלי של waveform, וכן את משך הזמן של הגל החיובי מאמינים כי חשוב כתורמים פגיעת מוח, הם תלויים מטען הנפץ, המרחק בין פיצוץ10, 11.

הטראומה כי תוצאות פיצוץ נפץ מסווגים ארבעה מרכיבים נפרדים, כמנהל ראשי, משני, שלישוני, רבעוני הפיצוץ פציעה10,12,13,14. כל אחד ממרכיבים אלה קשורה למנגנונים הספציפיים של פציעה. פגיעת העיקרית נובעת הפעולה הישירה של גל הלחץ על איברים ורקמות2,13. הפיצוץ משני פציעה תוצאות מן ההשפעה של קטעים קלע, גורם החודר, שאינו חודר פצעים2,15. פגיעת שלישוני מתרחשת כאשר גוף הקורבן הוא עקורים מפני הקרקע או האובייקטים שמסביב והיא קשורה עם האצה/ההאטה כוחות1,10,13. פגיעת רבעוני מתאר קבוצה הטרוגנית של פציעות הקשורות ישירות הפיצוץ אינו מכוסה על ידי הראשון פגיעה שלושה מנגנונים שתואר12,13. זה כולל (אך אינו מוגבל) פגיעה תרמי, שאיפת עשן, קרינה, גלים אלקטרומגנטיים, השפעות פסיכולוגיות שליליות13,15. רוב TBI הפיצוץ-הקשורים ישירות נובעת המנגנונים הראשונים של פגיעה, בעוד המנגנון רבעוני של פגיעת קשורות לרוב עם פגיעה מערכתית13. ההשפעות של האצה/ההאטה כוחות (למשל, צליפת שוט), קהה, חודר פציעת מוח טראומטית כבר חקרו בהרחבה ביחס לשאר סוגי TBI (למשללנפגעי תאונות, נפילות, פציעה בליסטי). אולם, גל הלחץ ההדף העיקרי הוא ייחודי כדי פגיעה הפיצוץ, השלכותיה על רקמת המוח הם הרבה פחות טוב הבין16. מנגנוני פגיעה פגיעה עיקריים, הקשורים עם גל הלחץ, הם הראשונים של הכוחות מכני לתקשר עם המוח.

רבים במודלים פרה TBI פותחו בעשורים האחרונים זה לא תסולא בפז להבין מנגנונים TBI הפיצוץ של פציעה, פתופיזיולוגיה ולחקור טיפולים חדשים פוטנציאליים, אשר שאחרת היה בלתי אפשרי לעשות באופן בלעדי בבמישור הקליני הגדרת17,18,19. למרות שאין דגם פרה אחד ניתן להפיק את המורכבות של הפיצוץ קליניים לפציעות, בדרך כלל במודלים שונים TBI פרה לשכפל היבטים ברורים של האדם TBI. ניתן יהיה ללמוד את הפעולה המזיקות של הכוחות המשויך פיצוץ פיצוץ בבידוד או בשילוב במודלים TBI הפיצוץ גם במבחנה וגם ויוו . מודלים במבחנה יש יתרון המאפשר שליטה חזקה מאוד של הסביבה ניסיוני (תנאים הפיזיולוגיות רקמות, ביומכניקה פציעה), אשר מפחית את השתנות ביולוגי ומשפר הפארמצבטית, המתיר חקר ספציפי מולקולרית מפלי מבלי confounders נוכחות חיה מודלים20. המטרה שלנו הייתה לפתח מודל במבחנה כדי לחקור את ההשפעות של פגיעה עיקריים על רקמת המוח. אנחנו נועדו לפתח מודל עם shockwave קולית עם נציג waveform פרידלנדר של פיצוץ חינם-שדות כגון זה המיוצר על ידי חבלה מאולתר (IED).

Protocol

הניסויים המתוארים בכתב היד נעשו בהתאם הממלכה המאוחדת חיות (וצפייה) מעשה 1986, אושרו על ידי צער & אתי סקירה הגוף של אימפריאל קולג ‘-לונדון. טיפול בבעלי חיים היה בהתאם להנחיות המוסדי של אימפריאל קולג ‘-לונדון. 1. בהיפוקמפוס פרוסה Organotypic הכנה ותרבות הערה: פרוטוקול זה מאפשר הייצור של organotypic פרוסות בהיפוקמפוס בהתאם לשיטה ממשק שתואר על ידי Stoppini ועמיתיו עם שינויים מזעריים21,22,23. באופן אידיאלי, לא יותר מאשר שלוש חיות צריך להיות מורדמים, גזור בהפעלה אחת כדי להבטיח שכל צעד נעשה במהירות וכדי להימנע התפשרות על איכות הפרוסות. שימוש בטכניקה אספטית ברחבי. ודא שהשלבים הבאים נלקחים לפני שמתחילים את פרוטוקול לנתיחה. הכנה של מסנן לעקר את כל הפתרונות מראש באמצעות מסנן מיקרומטר 0.22. להמשיך הפתרונות ב 4 ° C במהלך האחסון, במהלך ניתוח מוחי והכנות בהיפוקמפוס הפרוסה על ידי שמירה על צלחות פטרי ומיכלי אחסון על כיור חום מתכת לשבת קרח רטוב בכל עת. אוטוקלב כל מתכת, כלי נגינה, טבעות, ממחטות נייר. להבטיח כל חומר כדי לשמש עבור כל שלב של הפרוטוקול והכלים מוכנים לשימוש, תכננתי מראש, ריסס עם 70% אתנול. ודא כי מותר להם להתקרר ויבשה. המתת חסד יום 5 – 7-C57BL הישן/6N העכבר גור על ידי נקע בצוואר הרחם ונגב בקצרה פני העור שלם עם רקמת נייר סטרילי טבולים 70% אתנול. מלטף את העור יבש, לערוף את הגור בעזרת מספריים מאיו. חתך בעור הקרקפת עם מספריים איריס לאורך הקו האמצעי של הראש מתחיל הוא מעולף ומסתיים ליד החוטם ומשכו אותו רוחבית. הכנס את קצה המספריים Vannas מאגנום נקב, להפוך את שני חתכים לרוחב קטנים על העצם לאורך הסינוסים רוחבי, ואז לחתוך את הגולגולת לאורך הקו האמצעי עד הנורה הריח ובצע שני חתכים קטנים בניצב האמצע באזור זה. שימוש בסדר הצבע מלקחיים מעוקל, תמשוך את המדפים של העצם רוחבית מן האמצע, מסירים את המוח עם מרית קטנה ובזהירות להעביר אותו 90 מ מ סיליקון מצופים elastomer פטרי המכילות “דיסקציה בינוני”.הערה: חיתוך בינוני הוא של Gey מאוזנת תמיסת מלח (5 מ”ג/מ”ל D-גלוקוז, 1% פתרון אנטיביוטיקה-antimycotic, עם 10,000 יחידות/mL פניצילין, סטרפטומיצין 10 מ”ג/מ”ל, µg 25/המפוטריצין מ”ל). להסיר את המוח הקטן, נפרדות האונות לאורך הקו האמצעי באמצעות סכין גילוח. להשתמש במרית כדי להעביר האונות סיליקון 90 מ מ חדש מצופים elastomer פטרי מלא בינוני טריים קפואים לנתיחה. אם אחד או יותר בעלי חיים כדי לשמש מושב אחד, חזור על שלבים 1.2 – 1.6. תחת stereomicroscope, חותכים את הנורה הריח ואת קצה בצמוד עם סכין גילוח, נפרדות קליפת משאר הרקמה המוחית באמצעות מלקחיים עצה משובחים. שלב זה משאיר ההיפוקמפוס נחשף על פני השטח המדיאלי של הרקמה קורטיקלית. משלב זה ואילך, השתמש של תרביות רקמה למינארי (סגול לעקר וניקה עם 70% אתנול פתרון). להחיל בינוני לנתיחה כקרח לדיסק חוטב פלסטיק שטוחים והצב, בעזרת מרית, על רקמת המוח בדיסק כך פונה מעלה, השטח המדיאלי של קליפת המוח, הציר של ההיפוקמפוס הוא בניצב לציר של הלהב חוטב. להסיר ככל האפשר של המדיום לנתיחה מהדיסק חוטב באמצעות טיפ בסדר פסטר פיפטה. לחתוך את המוח לפרוסות מיקרומטר 400 באמצעות מסוק רקמות במהירות חוטב 50%, כוח.הערה: חשוב מאוד כי צעד זה נעשה הכי מהר ככל האפשר רקמת המוח לא שקוע במדיום לנתיחה. החלף את המדיום דיסקציה של סיליקון מצופים elastomer הפטרי בינוני טריים קפואים. ברגע למסוק רקמות הסתיימה, בזהירות להטביע על רקמת המוח במדיום לנתיחה טריים, ולהעביר הרקמה לחתוך חזרה 90 מ מ סיליקון מצופים elastomer הפטרי באמצעות אזמל להב ישר. תחת stereomicroscope, הפרד בזהירות את הפרוסות בקליפת המוח באמצעות מלקחיים עצה בסדר. לכל פרוסה, לבדוק את ההיפוקמפוס עבור נזק לרקמות מורפולוגיה ופוטנציאל הנובע הקרע או לחתוך. נפרדים hippocampi של קליפת entorhinal ומן את fimbria באמצעות טיפ בסדר מלקחיים ומספריים Vannas קטן. בדרך כלל, בסביבות 6 עד 8 פרוסות בהיפוקמפוס נוצרות לכל האונה. העברה עד 6 פרוסות בהיפוקמפוס הכנס תרביות רקמה באמצעות חתך פסטר פיפטה ובמקום זאת בפנים 35 מ מ פטרי צלחת. ודא כי הפרוסות פרושים בנפרד כמה מילימטרים (פעולה זו תבטיח שכל פרוסה יכול לדימות בנפרד). מיד להוסיף כקרח “מדיום הגידול” בתחתית כל צלחת פטרי, תחת הוספה תרביות רקמה, רק מתחת לקצה העליון של התרבות רקמות להוסיף רים.הערה: מדיום הגידול מכיל 50% מינימום הכרחי בינוני נשר, של 25% הנקס מאוזנת תמיסת מלח 25% הסוס סרום, 5 מ”ג/מ”ל D-גלוקוז, 2 mmol/L-גלוטמין, 1% פתרון אנטיביוטיקה-antimycotic, 10 mmol/L. HEPES, טיטרציה ל pH 7.2 עם נתרן הידרוקסידי. לשנות את מדיום הגידול מחרתיים הקרע, ואז כל 2-3 ימים לאחר מכן (מדיום הגידול בשימוש ב 37 מעלות צלזיוס). לוודא מדיום הגידול מתווספת כמות מספקת, אך לא כל כך כי זה גולשת מעל קרום הוספה תרביות רקמה, אשר עלול לסכן את הכדאיות של הפרוסות רקמות. שמור את הפרוסות רקמות חממה humidified ב 37 ° C עם 5% פחמן דו-חמצני באוויר במשך 12-14 ימים לפני שימוש בניסויים. 2. הכנת הפרוסות Organotypic בהיפוקמפוס עבור פרוטוקול TBI הפיצוץ ניסיוני הערה: כל השלבים של סעיף זה, למעט הדמיה, יתקיים תרביות רקמה למינארי. הכנס את הטבעות מפלדת בהזמנה אישית לתוך צלחת טוב 6 (אחת בכל טוב).הערות: הטבעות יש שפה עם חריץ (אשר צריך לשבת בתנוחה בשעה 12), להתאים בקלות לכף בתוך הבארות, בעוד התרבות רקמות מוסיף להתאים בקלות בטבעת הזאת. ודא כי הטבעות עם חומר מחטא אחרים, ביסודיות לשטוף עם מים מטוהרים, בלוק שטופים מותר להתקרר מראש. למלא את הבאר של צלחת 6-ובכן ומחוממת מראש (37 ° C) ללא סרום “בינוני ניסיוני” עם propidium יודיד.הערה: בינוני ניסיוני עם יודיד propidium הוא: 75% מינימום הכרחי בינוני הנשר, של 25% הנקס מאוזנת תמיסת מלח, 5 מ”ג/מ”ל D-גלוקוז, 2 mmol/L-גלוטמין, 1% פתרון אנטיביוטיקה-antimycotic, 10 mmol/L HEPES ו 4.5 µmol/L propidium יודיד, טיטרציה pH עד 7.2 עם נתרן הידרוקסידי. ודא כי הרמה של המדיום לא מגיעים מעל החריץ של הטבעת. להעביר את הצלחת 6-ובכן עם הטבעות בחזרה החממה עבור h 1 על מנת להבטיח כי המדיום ב 37 מעלות צלזיוס לפני הכיסויים תרביות רקמה מועברים. להעביר את הכיסויים תרביות רקמה עם הפרוסות organotypic פטרי 35 מ מ לתוך הצלחת 6-ובכן עם הטבעות, המדיום ניסיוני עם מלקחיים. להפוך נקודה על שפת הוספה ב 3 שעון עמדה עם עט טוש.הערה: הכיסויים הולכים להסירו מהצלחת 6-ובכן במהלך הניסוי ומקל שלב זה מחזיר את תותב למיקום המקורי לאחר החשיפה גל הלם, כדי בקלות לעקוב אחר כל פרוסה ברחבי בפרוטוקול. תווית כל צלחת 6-ובכן עם שם ייחודי & תאריך ולגרום המפה של הבארות של כל צלחת, מתן שמות מכל קידוח (למשל., A, B, C, וכו ‘.), כל פרוסה היטב בכל (למשל., 1, 2, 3, וכו.), כך כל פרוסה יש מזהה ייחודי ( למשל., A1, A2, A3, וכו.). להעביר את הצלחת 6-ובכן החממה לשעה להבטיח הפרוסות ב 37 מעלות צלזיוס מיד לפני הדמיה.הערה: למנוע הצפה של מדיום או בועות אוויר מתחת התרבות רקמות הכנס רפידה, אשר עלול לסכן את הכדאיות של הפרוסות. h 1 לאחר העברת בינוני ניסיוני, תמונת כל פרוסה בנפרד באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (2 X אובייקטיבי, נה 0.06) מצוידים עם המתאימים עירור (BP 535/50 ננומטר), מסנן פליטה (LP 610 nm) כדי להעריך את תקינות פרוסה לפני הפציעה הפרוטוקול מבוצע.הערות: הפרוסות התערוכה אזורים צפופים אדום מכתים בשלב זה לשקול להציג את הכדאיות פרוץ, לא להיות כלולים ניתוח נוסף (אלו בדרך כלל מייצגים פחות מ 10% של המספר הכולל של פרוסות שנוצרו). להבטיח הדמיה מתבצע באופן רציף, מהר ככל האפשר כדי למזער את הזמן הפרוסות נמצאים מחוץ החממה (בדרך כלל 6 בארות צריך לקחת רק תחת 30 דקות התמונה). לשמור את המכסה של לוח 6-טוב על כל הזמן. עיבוי מסוימים עלול להצטבר בתוך המכסה. אם זה קורה, בקצרה להשתמש במייבש שיער ‘ נמוך ‘. ודא כי כל התנאים הדמיה זהים בימים שונים ובין ניסויים.הערה: מטרת ההדמיה היא לכמת זריחה של רקמות, ולכן השלב זה חשוב להבטיח את הפארמצבטית של התוצאות ולאפשר את ההשוואה של הנתונים שהתקבלו. 3. ועלייתו ותעבורה של התרבות רקמות הוספת עם הפרוסות Organotypic בהיפוקמפוס מיד לאחר דימות, ב תא למינארי, לקחת אחד הוספה תרביות רקמה מהצלחת 6-ובכן באמצעות מלקחיים. בזהירות העברת התותב כדי שקית פוליאתילן סטרילי (3 “x 5”) מראש מלא עם 20 מ של מדיום ניסיוני חמים (37 מעלות צלזיוס) טרי מבעבע עם 95% חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני.הערה: ודא חמצן, פחמן דו-חמצני מועשר ניסיוני המדיום היה מבעבע לפחות 40 דקות עם 95% חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני באמצעות bubbler scintered זכוכית בתוך בקבוק Dreschel והעבירו לתוך שקיות פוליאתילן עקר בפנים תרביות רקמה למינארי באמצעות מזרק 20 מ עם מסנן חיידקים צינור מילוי סטרילי (127 מ מ) מצורף. לאטום את התיקים מיד ומעבירים אותם אל חממה 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה לפני התרבות רקמות מוסיף העברה. ודא כי כל שקית סטרילית כראוי מתויג (עם צלחת, זיהוי טוב). חזור על שלב זה עבור כל הוספה תרביות רקמה. אל תכלול את בועות האוויר בקפידה על איטום התיקים סטרילי (נעשה בצורה מאובטחת על ידי סיבוך העליון של התיקים, על-ידי החלת מלחציים פלסטיק). להחזיר את התיקים סטרילי עם התוספות תרביות רקמה והלוחיות 6-ובכן בינונית ניסיוני לתוך החממה 37 º C. לאחר 1 h, בזהירות לארוז את התיקים סטרילי עם התוספות תרביות רקמה קופסאות פלסטיק בתוך תיבת מוסדר תרמו מלא במים מיוננים ב 37 ° C כדי לשמור את הפרוסות organotypic בטמפרטורה הפיזיולוגיות במהלך החשיפה גל הלם פרוטוקול. 4. הכנת צינור הלם וחשיפה גל הלם בהיפוקמפוס פרוסה Organotypic ללבוש מגפיים מגן הבוהן פלדה, מעיל מעבדה וכפפות במהלך הכנת הצינור הלם, חשיפה גל הלם. בולט המסגרת מחזיק שקית סטרילית כדי הלם צינור דיסטלי מקורבות, המבטיח כי החור המרכזי מיושר עם השקע צינור הלם (באמצעות מוט מבלטים). הר שני מתמרים לחץ רדיאלי: חיישן 1, בחלק האמצעי של הסעיף מונע, חיישן 2 בוהסתיר דיסטלי הצינור הלם (איור 1 א’). לחבר את מתמרים לחץ אוסצילוסקופ דרך יחידת הכוח המקור הנוכחי. ודא כי כל הלם צינור שחרור שסתומי והפקדים זרימה סגורים. פתח את הקו החיצוני אוויר דחוס, לחייב את ברז חשמלי לבר 2.5. פתח את השסתום בטיחות גליל אוויר דחוס, לאט פתח את וסת הלחץ כדי להגביר את הלחץ על פס 5.הערה: הלחץ להגדיר עבור זה הרגולטור צריך להיות מעט מעל הסרעפת הגבוהה מתפוצץ לחץ. הכן את דיאפרגמות באמצעות מיקרומטר-עבה 23 חיתוך יריעות פוליאסטר לריבועים2 10 10x ס מ. הכינו את נקודות האחיזה באמצעות הקלטת אוטוקלב ותוקע אותם כדי העליון והתחתון של כל הסרעפת. מקם אחת הסרעפת (יחיד חריץ של עכוז כפול – דיאפרגמה יחידה תצורה) או שני דיאפרגמות (לשני החריצים של עכוז כפול – דיאפרגמה כפולה תצורה) בעכוז (איור 1B). מרכז את דיאפרגמות, וחברי אותם באמצעות ארבעה רמינגטון M24 םיגרב, והידק אותן ברצף בצורה סימטרית באלכסון, ומבטיחה כי דיאפרגמות הם קמטים. תהדק את כל שקית סטרילית בנפרד במצב אנכי על המסגרת מחזיק, המבטיח כי פני השטח של התרבות רקמות הוספת עם הפרוסות בהיפוקמפוס organotypic עומדת בפני הלם הצינור לשקע תותב תרביות רקמה ממורכזת פנימה סטרילי שקית (איור 1C). ודא כי השקית סטרילי זה בצורה מאובטחת כשכרטיס מסביב כדי להבטיח הנייח וקבוע. לובשים מגיני אוזניים, בטיחות משקפיים כאשר לוחצים את הצינור הלם. . הפעילי את יחידת הכוח המקור הנוכחי and אוסצילוסקופ כדי לרכוש את הנתונים גל הלם (קצב רכישת של 50 מגה-דגימות בשנייה, שיא אורך 20 ms, 1 מיליון נקודות) ולסגור את ברז חשמלי באמצעות את כפתור בקרת זרימה על לוח הבקרה של הרכבת התחתית הלם, לאט לדחוס את המקטע אמצעי האחסון הנהג של הצינור הלם עבור תצורת דיאפרגמה יחידה או המקטע אמצעי האחסון הנהג והן המקטע עכוז כפול של הצינור הלם עבור דיאפרגמה כפולה תצורה.הערה: עבור תצורת דיאפרגמה יחידה, הלחץ פרץ יהיה תלוי רק החומר הסרעפת, עובי, הסרעפת יתבקע באופן ספונטני ברגע החומר מתפוצץ לחץ מתמלאת. עבור תצורת דיאפרגמה כפולה, הלחץ המתפרצת גם תלוי לחץ הגז דיפרנציאלית הנהג והן הצ’יימברס עכוז זוגי ונפתחת, עבור דיאפרגמות להתפוצץ בצורה מבוקרת, שסתום בטיחות עכוז זוגי ידנית פעם הלחצים היעד הינם נגישים. ברגע הסרעפת ציסטות נקרעות (הפקת רעש חזק), במהירות לסגור את זרימת אוויר דחוס באמצעות הידית זרימה ופתח את ברז חשמלי.הערה: הנפח הכולל של מקטע התקן ניתן לשנות על ידי החדרת לריווח מקטעים, המאפשר מגוון רחב יותר של גל ההלם שיא הלחץ ומשכי ואפשר להשיג. שילוב אידיאלי של גל ההלם פרמטרים צריך להיות מספיק כדי לגרום לפצעים רקמות אבל לא כל כך גבוה שזה גורם תרביות רקמה הוספה או שקית סטרילית עיוות או קרע. לחשוף כל שקית סטרילית עם הוספה תרביות רקמה כדי גל צינור יחיד הלם, תחזיר את זה מייד אל תיבת מוסדר תרמו לפני שקית סטרילית חדשה שנלקחו מן התיבה, כשכרטיס על המסגרת מחזיק. ודא כי צעדים 4.10 – 4.14 מבוצעות בצורה חלקה, מהירה ככל האפשר (תוך מספר דקות) כדי למנוע את הקירור בינוני ניסיוני, כפי בטמפרטורה שמתחת 37 ° C עלולים להפריע פציעה פיתוח. לאחר כל תרביות רקמה מוסיף נחשפו גל הלם (או פרוטוקול המזויפים), להחזיר את הכיסויים תרביות רקמה לצלחת 6-ובכן המקורי, שלהם בהתאמה (בתוך תא תרביות רקמה למינארי) וחוזרים החממה. לשמור את הצלחת 6-ובכן בחממה עם 5% פחמן דו-חמצני באוויר ב 37 ° C עד הדמיה נוספות. כולל לחצנים שאם כל הניסוי, יחד עם החשיפה גל הלם פרוסה.הערה: פרוסות המזויפים מטופלים באופן זהה לפרוסות נחשפים גל הלם (אטום בשקיות סטריליות בינונית ניסיוני, מועבר למעבדה צינור הלם באותה תיבת מוסדר תרמו, מושעה על מסגרת המתכת לתקופה המקבילה של זמן) אבל ההלם צינור לא מפוטר. 5. כימות פגיעה בהיפוקמפוס Organotypic פרוסה H 24 שעות ביממה, 48 שעות ו 72 h, תמונה הפרוסות כמתואר 2.8 מדרגות 2.9. לאחר הדמיה ב 72 h פוסט גל הלם החשיפה, למחוק את רקמות ביולוגיות מקומיים הבאים תבזבז בפרוטוקולי ולחטא ואת אוטוקלב המתכת טבעות.

Representative Results

הצינור הלם נעשה שימוש בשיטה זו מאפשר את הדור של הלחץ שנחשולי המדמים שדה פתוח אמיתי פיצוצים וניסו מאת פרידלנדר פונקציה7,8. בגלי ההלם קולית עם מהירות של 440 מטר לשנייה (1.3 מאך) התקבלו (איור 2 א). צורת גל המידע המדווח הוא חיישן 2, ממוקם בצורה רדיאלית בסוף הסעיף מונע של הצינור הלם. באמצעות פרוטוקול המתואר לעיל, organotypic פרוסה בהיפוקמפוס תרבויות נחשפים גל הלם יחיד (איור 2 א) לפתח נזק משמעותי לכמת באמצעות propidium יודיד, הפלורסנט מאוד קוטבי, כי רק חודר את התאים עם נפגעת ממברנות הסלולר24,25 (איור 2B, ג). אפילו בתנאים אופטימליים, ועקביים כדי OHSC אחרים שפורסמו מודלים21,22, יש רמה נמוכה של הרקע propidium יודיד פלורסצנטיות נובע, בין השאר, קטין נזק הנובע (מניפולציות רקמות הטבועה כגון מדיה שינויים במהלך תקופת תרבות או הסרה של החממה עבור הדמיה). הפיצוץ הזה TBI פרוטוקול כרוך מניפולציה משמעותית הכוללת את ועלייתו הפרוסות בינוני בתוך שקיות סטריליות מידה ניכרת של טיפול במהלך פרוטוקול חשיפה גל הלם (למשל., מחבר חובק למעקה השקיות עקר בעל מסגרת). עם זאת, אם כל הצעדים מבוצעים בקפידה, זו מניפולציה נוספים לא יש השפעה על הבריאות הבסיסית של OHSC כפי נראו אין הבדלים משמעותיים בין קבוצת ביקורת של פרוסות שמרו על הלוחיות. ובכן 6 בכל עת (כלומר., התוספות היו לא שקוע או מטופלים) וקבוצת דמה, אשר כלל הפרוסות הוסתרו בתוך שקיות סטריליות כשכרטיס אל הצינור הלם (איור 2B). גלי שני שבחרת, ב kPa 50 ו 55 kPa שיא הלחץ, הפיק משמעותי (p < 0.05 ו- p < 0.0001, בהתאמה), לשחזור הפציעה בהשוואה המזויף שציווית פרוסות כל הזמן-נקודות לאחר חשיפת הפיצוץ פרוטוקול (איור 2B) מבלי לגרום נזק את הכיסויים תרביות רקמה או את התיקים סטרילי. על מנת לקבוע את הרגישות של המודל להבדלים קטנים שיא-הלחץ, החלטנו לבחור ערכים שהיו שונים על ידי ~ 10%. תוצאות אלה גם להציג, כצפוי, הפגיעה הנובעת 55 kPa זו גבוהה יותר לאחר גל הלם 50 kPa. הנתונים מבוטא זאת אומרת ± שגיאת התקן של הממוצע. משמעות הוערכה באמצעות אמצעים חוזרות 2-way השונות שימוש הולם-Sidak פוסט הוק מבחן. גורם 1 היה קבוצה (שליטה, העמדת פנים, הפיצוץ), פקטור 2 היה זמן לאחר הפגיעה (-1 h, 24 שעות ביממה, 48 שעות ו 72 h), שבו גורם 1 היה הגורם חוזרות ונשנות. ההתאמה של ערך p להשוואות מרובות שימש. ערכי P 0.05 פחות נלקחו כדי להצביע על הבדל משמעותי בין הקבוצות. בדיקות סטטיסטיות יושמו באמצעות חבילת תוכנה גראפית ונתונים סטטיסטיים. איור 1: סכימטי של המכשיר צינור הלם עם המסגרת מחזיק שקית סטרילית. (א). הצינור הלם הוא צינור ארוך מפלדת 3.8 מ’, עשוי משלושה חלקים ארוכים 1.22 מ’, המחוברים באמצעות אטמים, flanges, עם 59 מ מ. קוטר פנימי שיבוץ (B) מראה את מכלול עכוז כפול. להיות כשכרטיס אחד או שניים דיאפרגמות מיילר בהרכבה בחותם המסופקים על ידי o-טבעות גומי. מסגרת מחזיק שקית סטרילית (C). הגוף של המסגרת כוללת שני לוחות מתכת עם חור עגול ממורכז (59 מ מ קוטר) שמתיישר עם השקע צינור הלם. דק (4 מ מ) שני, יריעות סיליקון elastomer מצוידים בין שני לוחות מתכת. המטרה של גליונות אלה נועד לספק של השטח להחליק ואפילו כדי לצבוט את התיקים סטרילי. המרחק בין התיק לבין השקע של הצינור הלם הוא 7 ס מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2: shockwave טיפוסי ופציעה וכתוצאה מכך organotypic בהיפוקמפוס לחתוך תרבויות. (א) נציג דוגמה גל הלם שהושג באמצעות מיקרומטר-עבה 23 פוליאסטר, הסרט-2.16 בר פרץ לחץ, 55 kPa שיא הלחץ, משך גל חיובי 0.4 ms, 10.1 kPa·ms דחף. Waveform נתונים, התקבלו חיישן 2 רכוב בצורה רדיאלית-והסתיר דיסטלי הצינור הלם מונע סעיף. מהירות גל הלם היה 440 מטר לשנייה (1.3 מאך). (B) הפיתוח של פציעה הוא יחסי העוצמה של גל ההלם. 50 kPa והן 55 kPa שיא הלחץ גלי הלם נגרם נזק משמעותי שהתפתחה לאורך כל פרוטוקול 72 h בהשוואה לקבוצת המזויפים. הפגיעה כתוצאה מחשיפה גל 55 kPa שיא הלחץ היה גבוה באופן משמעותי אחרי kPa 50-48 שעות ה 72 המזויפים פרוסות טופלו באופן זהה על פרוסות הפיצוץ אבל צינור הלם לא פוטר. שליטה פרוסות היו בהשתתפות 6 צלחות טוב באינקובטור בלי שינוי כלשהו. העמודות מייצגות ערכים רעים, קווי שגיאה לשגיאות תקן (n = 7, פקדים; n = 48, דמה; n = 30, הפיצוץ 50 kPa; n = 51, הפיצוץ 55 kPa; n = מספר פרוסות, מ- 6 ניסויים נפרדים). * p < 0.05, *p < 0.0001 לעומת המזויפים. # p < #0.05,p < 0.01 לעומת הפיצוץ 55 kPa. (ג) נציג propidium יודיד פלורסצנטיות תמונות של organotypic פרוסות דמה (אני), (ii) הפיצוץ 50 kPa וכן (iii) הפיצוץ 55 kPa קבוצות ב- 72 שעות לאחר פציעה. הפרוסה המזויפים מראה רמות נמוכות של קרינה פלואורסצנטית, כלומר., פציעה, ואת הפיצוץ חשוף פרוסות להראות רמות גבוהות של פגיעה ‘ מאטום לשקוף ‘, יותר מבוטא על הפרוסה הלחץ נחשף שיא 55 kPa (סולם בר = 500 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

בין כל המנגנונים של פגיעה המשויך הפיצוץ TBI (הדף הראשי, משניות ושלישוניות פגיעה במנגנונים), ראשי פגיעת הוא ייחודי הפיצוץ לטראומה וזה המעט הבין של מנגנונים הקשורים הפיצוץ1,2 . פרוטוקול הרומן שמתואר כאן פותחה כדי ללמוד פגיעה עיקריים TBI באמצעות שפופרת של שוק פתוח לחשוף במבחנה בתרבויות פרוסה בהיפוקמפוס העכבר גל הלם יחיד באמצעות פרוטוקול פשוטה ומהירה מאפשר היצירה של לשחזור . פיצוץ ראשי TBI עם תפוקה גבוהה

במבחנה פגיעה עיקריים TBI הדגמים הראשונים יחולו גלי הלחץ ההידרוסטטי תאים26,27. אולם, הפלט לחץ לא ביסס את הפונקציה פרידלנדר כמו משך הזמן של דופק הלחץ ההידרוסטטי היה הרבה יותר זמן מאשר הפיצוץ מוטס הלחץ גלים13. המאפיין פרידלנדר פונקציה יכולה להיות הדגם בקלות במעבדה בעזרת הלם צינור1,8. הצינור הלם יכול לייצר גלי המדמים שדה פתוח אמיתי פיצוצים בסביבת מעבדה קונבנציונאלי, תוך מתן אפשרות שליטה מדויקת של גל פרמטרים, כגון שיא הלחץ, משך גל חיובי, דחף, על ידי שינוי דיאפרגמה החומר עובי ו את התקן האחסון8,28,29.

מודלים פשוטים במבחנה כגון תרביות תאים בדרך כלל חוסר של הטרוגניות של סוגי תאים, קישוריות סינפטית30. לאחרונה, השפעת הפיצוץ על במבחנה לתא מוח ‘spheroids’ שילוב סוגי תאים שונים כבר ובדוקים31. בהמשך החקירה של ההכנות הללו מעניין זה מצדיק..; עם זאת, לא ברור איך הארגון הסלולר שלהם וקישוריות מראות את המוח ללא פגע. OHSC הם ומבוססת במבחנה דגם ניסיוני23,32, הם קלים לתרבות, cytoarchitecture רקמות תלת מימדי, תאית התמיינות וקישוריות הסינפטית שלהם הם שהשתמרה היטב מאוד דומה כי אין ויוו33,34,35,36. OHSCs מייצגים רמת ביניים של מורכבות בין תרבית תאים של ויוו דגם23,32. OHSCs הוכחו להתרבות בתוך חוץ גופית ניווניות פתולוגיים cascades ראיתי דגמים ויוו , היה מאוד שימושי בהקרנת הסרט neuroprotective תרופות וב -הבנת מנגנוני שלהם פעולה17,21,22,37,38. לבסוף, אזור אנטומי למד, ההיפוקמפוס, רלוונטי מאוד במחקרים TBI translational, אזור זה הוא לעתים קרובות פגועה TBI חולים39,40,41. OHSC שימשו מודל הפיצוץ TBI28,42,43,44, עם זאת, המודל שלנו הוא פשוט יחסית, יכול להיות מותאם כדי הלם-צינורות הקיים או אופקי או אנכי תצורות ללא עיבודים מורכבים.

ניתן לשמור OHSC בתרבות במשך ימים רבים, אשר מקלה על החקירה של תהליכים ביולוגיים מעל הזמן34. במודל זה, הפגיעה ברקמות שנבעו גל הלם החשיפה נמדדה מדי יום במשך כשלושה ימים, בעקבות החשיפה הפיצוץ באמצעות propidium יודיד, סמן ומבוססת של נזק לתאים. Propidium יודיד הוא צבע קוטבי מאוד רעילים זה חודר לתאי עם פרוץ ממברנות הסלולר, איפה זה נקשר חומצות גרעין ומוצגים האופיינית פלואורסצנטי אדום בהיר24,25,45. ידי קרינה פלואורסצנטית נמדד עם יודיד propidium הוכח שיש קשר טוב עם ספירת התא הפגוע באמצעות Nissl מכתים46,47.

נתון כי הפגיעה המיוצר במודל זה היה מפוזר (איור 2C), ידי קרינה פלואורסצנטית של כל פרוסה נמדד בעת ביצוע הניתוח, דומה לעבודה שפורסמו בעבר אחרים במוח פציעה פרדיגמות21,22 , במקום להשתמש באזורים ספציפיים, כפי שעשו אחרים במבחנה הפיצוץ TBI מודלים28,43,44,48. הגישה הכללית בשימוש המודל המתואר במאמר זה גם מבטל ההשתנות פוטנציאל זה מוצג כאשר חלוקה לרמות מוגדרים אזורים מעניינים ומספק תמונה מקיפה יותר של הפגיעה הקשורות הפיצוץ. Overpressures שיא גל הלם, 50 kPa ו 55 kPa, הפיק משמעותי (p < 0.05 ו- p < 0.0001, בהתאמה) פגיעה בהשוואה המזויפים פרוסות (איור 2B). לפי התכנון, גל ההלם עם מרב overpressure הגבוה, 55 kPa, הפיק פגיעה יותר מאשר הגל 50 kPa. במודל במבחנה עם המוח מבודדים רקמות נחשף ישירות shockwave, כיצד לשנות את קנה המידה באופן מדויק האורגניזם כולו או אדם אינה פשוטה. למרות זאת, ההלם היינו נמצאים בטווח של overpressures שיא נצפתה בשטח, בדרך כלל 50 – 1,000 kPa8,49.

כדי לשמר את OHSC נחשפים הפיזיולוגיות טמפרטורה ורמות של חמצן, פחמן דו חמצני, תוך הבטחת כי הם היו חינם מפני זיהום לאורך כל פרוטוקול חשיפה גל הלם, התוספות תרביות רקמה נאטמו לתוך סטרילי שקיות פוליאתילן בעקבות הטכניקה aseptic, שקוע במדיום ניסיוני התחמם עד 37 ° C, מבעבע טרי עם 95% חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני, באופן דומה כדי העבודה שפורסמו בעבר28,43,44 ,48. בניגוד מודלים אלה שבו מכשירים מורכבים שימשו כדי להחזיק את התיקים סטרילי במהלך החשיפה גל הלם, ב פרוטוקול זה, שיטה פשוטה ומהירה שימש להשעות את הכיסויים תרביות רקמה OHSC לפני ששקע צינור הלם (איור 1 א’, C ). המודל המתואר במאמר זה מאפשר עיבוד מהיר של תפוקה גבוהה, תוך מזעור הסיכון של היפותרמיה. היבטים אלה רלוונטיות בעיקר ללימודי neuroprotection בהתחשב בכך כמה התערבויות טיפוליות שיש חלון זמן מוגבל מאוד של פוטנציאל היישום לאחר TBI. פרוטוקול חשיפה זה גל הלם הרומן מאפשרת 6 עד 9 תרביות רקמה מוסיף (בדרך כלל 36 עד 54 organotypic בהיפוקמפוס רקמות פרוסות) להיחשף גל הלם בתוך פרק זמן קצר של זמן (כ ג 1).

OHSCs דורשים אספטי טכניקה טובה בכל רחבי. חשוב להשתמש אספטי למינארי ברחבי את culturing, כאשר העברת התיקים סטרילי עבור הפיצוץ. לצורך ביצוע ההדמיה פרוסה בתנאים aseptic בשלמותם הלוחיות. ובכן 6 במקום, אנו משתמשים בהזמנה אישית טבעות מתכת כדי להרים את המכסים תרבות תא למישור מוקד של המיקרוסקופ. חלק חשוב של פרוטוקול שלנו היא כי אנו לכלול המזויפים שציווית פרוסות בכל ניסוי. פרוסות המזויפים מטופלים באופן זהה כדי הפיצוץ פרוסות עם יוצאי דופן כי ההלם-הצינור לא מפוטר; צעד חשוב נוסף הוא כי כל הפרוסות הם צילמו 1 h לפני הפציעה או טיפול דמה, כדי להבטיח כי הבריאות של האוכלוסייה של פרוסות שימוש זהה (איור 2B).

בנוסף לכימות תא פציעה על הפרוסות לאורך זמן, הרקמה יכול להיות קבוע בסוף הניסוי אימונוהיסטוכימיה קונבנציונאלי50. אנחנו פיתח, הערכה השיטה באמצעות העכבר פרוסות בהיפוקמפוס. עם זאת, הטכניקה שלנו יכול להיות מותאם בקלות להשתמש רקמות אחרות זה יכול להיות גדלה בתרבות, כגון חוט השדרה, רשתית, ריאות או רקמת האפיתל. הנייר הזה, העבודות הקודמות שלנו עם הדגם, חקרנו רק את ההשפעה של חשיפה פיצוץ יחיד. עם זאת, הדגם יהיה מתאימה כדי לחקור את ההשפעות של תקיעות ברמה נמוכה חוזרות ונשנות על המוח או רקמות אחרות. OHSCs יכול להישמר בתרבות במשך שבועות רבים או אפילו חודשים, ומאפשר אפקטים כרונית להיחקר.

במבחנה מודלים, להיות יותר ויוו מודלים, פשוט יש של תפוקה גבוהה יותר, פחות יקרים, ניסויים יכולים בדרך כלל להסתיים על סרגל זמן קצר יותר17. עם זאת, התוצאות המתקבלות באמצעות מודלים במבחנה צורך לאמת במודלים של בעלי חיים במבחנה תרבותי רקמות נשמרים בסביבה מלאכותית, עלול להגיב לפגיעה אחרת ממה שהם היו ויוו17. בכל זאת, מודלים במבחנה הייתה בעלת ערך רב מאוד להגדיל את ההבנה שלנו של אשדים פגיעה במוח, תוך הקרנת neuroprotective תרופות לפני השימוש מורכבים יותר ויוו מודלים17,22 , 51 , 52. למרות היתרונות הרבים המוצעים על ידי מודל זה, חשוב לציין במבחנה מודלים חסר מפתח תכונות של TBI להציג מודלים ויוו , כגון ההשפעות על מערכת כלי הדם, וחיות מוגברת תוך-גולגולתי לחץ, התגובה החיסונית מערכתית, התנהגותיות תיפקודי, המדגישה את הצורך כדי לאמת את התוצאות נמצאו במבחנה דגמים של כל החיות. למרות זאת, במבחנה מודלים כגון המודל המתואר במאמר זה הם כלים מדעיים הרלוונטיים translationally מאוד שימושי.

לסיכום, עבודה זו מתארת פשוט וברור שיטה שבו העכבר organotypic בתרביות רקמה בהיפוקמפוס נחשפים לשחזור ונשלטת היטב במציאות הרלוונטיים גלי הלם באמצעות צינור הלם מעבדה. הפגיעה הכללית המתקבלת, אשר הייתה לכמת באמצעות propidium יודיד, סמן ומבוססת של נזק לתאים, היא מאוד לשחזור והיא פרופורציונליים ל- overpressure שיא של גלי הלם מוחל.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

נתמך על-ידי: המגישים ההגנה רפואה, בירמינגהם, אנגליה, רויאל בריטיש לגיון המרכז ללימודים הפיצוץ פציעה, אימפריאל קולג ‘ בלונדון, אנגליה. מועצת המחקר הרפואי, לונדון, הממלכה המאוחדת (MC_PC_13064; MR/N027736/1). הקרן בטיחות גז, לונדון, אנגליה. ריטה קמפוס-Pires היה מקבל פרס הכשרה דוקטורט מ פארא Fundação e Ciência Tecnologia, ליסבון, פורטוגל. קייטי האריס היה הנמען של studentship PhD מ ווסטמינסטר רפואי ספר מחקר אמון, לונדון, אנגליה.

מודל זה פותחה עם התמיכה של מרכז הלגיון הבריטי המלכותי עבור מחקרים פגיעה הפיצוץ (RBLCBIS) ב אימפריאל קולג ‘. ברצוננו להודות על התמיכה הכלכלית של הלגיון הבריטי המלכותי. חוקרים המעוניינים שיתופי פעולה או נוסף פרט ניתן לפנות את מחברים או RBLCBIS.

אנו מודים ד ר Amarjit סמרה, מנהלת המחקר, המגישים לתרופה ההגנה, בירמינגהם, בריטניה, לתמיכה שזה יעבוד, סקוט ארמסטרונג, המחלקה לכירורגיה & סרטן, אימפריאל קולג ‘ בלונדון, על סיוע ראשוני ניסויים , Theofano Eftaxiopolou, מצודת דוד הארי & לוז Ngoc נגוין, המחלקה של בביו-הנדסה אימפריאל קולג ‘ בלונדון, & ויליאם גאה, המחלקה של פיזיקה אימפריאל קולג ‘ בלונדון, לקבלת ייעוץ על המרקע-ההלם, רקל Yustos, טכנאי, מחלקת מחקר מדעי החיים, אימפריאל קולג ‘ בלונדון, תמיכה טכנית, בין פול בראון, מנהל סדנת ו סטיב נלסון, סדנת טכנאי המחלקה לפיסיקה, אימפריאל קולג ‘ בלונדון, להכנת המתכת מצלצל, ניל פאוול של הפקולטה לפיזיקה, אימפריאל קולג ‘ בלונדון, גרפיקה.

Materials

Geys balanced salt solution Sigma UK G9779
D- glucose Sigma UK G8270
Antibiotic/antimycotic Sigma UK A5955
Minimum essential medium Eagle Sigma UK M4655
Hanks balanced salt solution Sigma UK H9269
Horse serum Sigma UK H1138
L-glutamine Sigma UK G7513
HEPES VWR Prolabo, Belgium 441476L
Sodium hydroxide Sigma UK S-0945
Tissue culture inserts Millicell CM 30 mm low height Millipore PICM ORG 50
6-well plates NUNC, Denmark 140675
Propidium iodide Sigma UK P4864
Sterile polyethylene bags – Twirl'em sterile sample bags Fisherbrand 01-002-30
Portex Avon Kwill Filling Tube 5" (127mm) Smiths Medical Supplies E910
Epifluorescence microscope NIKON Eclipse 80i, UK
Microscope objective Nikon Plan UW magn. 2x, NA 0.06, WC 7.5 mm
Microscope filter Nikon G-2B (longpass emission)
Mylar electrical insulating film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm RS Components UK 785-0782
Pressure transducer Dytran Instruments Inc. 2300V1
Tissue chopper Mickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, United Kingdom. Mcllwain tissue chopper
Silicone elastomer Dow Corning, USA Sylgard 184
Graphing & statistics software GraphPad Software, USA Prism 7.0
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Risling, M., Davidsson, J. Experimental animal models for studies on the mechanisms of blast-induced neurotrauma. Frontiers in Neurology. 3, 30 (2012).
  2. Nakagawa, A., et al. Mechanisms of primary blast-induced traumatic brain injury: insights from shock-wave research. Journal of Neurotrauma. 28 (6), 1101-1119 (2011).
  3. Goldstein, L. E., McKee, A. C., Stanton, P. K. Considerations for animal models of blast-related traumatic brain injury and chronic traumatic encephalopathy. Alzheimer’s Research & Therapy. 6 (5), 64 (2014).
  4. Rona, R. J., et al. Mild traumatic brain injury in UK military personnel returning from Afghanistan and Iraq: cohort and cross-sectional analyses. Journal of Head Trauma and Rehabilitation. 27 (1), 33-44 (2012).
  5. Terrio, H., et al. Traumatic brain injury screening: preliminary findings in a US Army Brigade Combat Team. Journal of Head Trauma and Rehabilitation. 24 (1), 14-23 (2009).
  6. Elder, G. A., Stone, J. R., Ahlers, S. T. Effects of low-level blast exposure on the nervous system: is there really a controversy. Frontiers in Neurology. 5, 269 (2014).
  7. Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. Explosive blast neurotrauma. Journal of Neurotrauma. 26 (6), 815-825 (2009).
  8. Bass, C. R., et al. Brain injuries from blast. Annals of Biomedical Engineering. 40 (1), 185-202 (2012).
  9. Young, L. A., Rule, G. T., Bocchieri, R. T., Burns, J. M. Biophysical mechanisms of traumatic brain injuries. Seminars in Neurology. 35 (1), 5-11 (2015).
  10. Wolf, S. J., Bebarta, V. S., Bonnett, C. J., Pons, P. T., Cantrill, S. V. Blast injuries. Lancet. 374 (9687), 405-415 (2009).
  11. Kluger, Y., Nimrod, A., Biderman, P., Mayo, A., Sorkin, P. The quinary pattern of blast injury. American Journal of Disaster Medicine. 2 (1), 21-25 (2007).
  12. Champion, H. R., Holcomb, J. B., Young, L. A. Injuries from explosions: physics, biophysics, pathology, and required research focus. Journal of Trauma: Injury, Infection, and Critical. 66 (5), 1468-1477 (2009).
  13. Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, D. F. In-vitro approaches for studying blast-induced traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 26 (6), 861-876 (2009).
  14. Edwards, D. S., Clasper, J., Bull, A. M. J., Clasper, J., Mahoney, P. F. . Blast Injury Science and Engineering: A Guide for Clinicians and Researchers. , 87-104 (2016).
  15. Kirkman, E., Watts, S., Cooper, G. Blast injury research models. Philosophical Translations of the Royal Society B: Biological Sciences. 366 (1562), 144-159 (2011).
  16. Hicks, R. R., Fertig, S. J., Desrocher, R. E., Koroshetz, W. J., Pancrazio, J. J. Neurological effects of blast injury. J Trauma. 68 (5), 1257-1263 (2010).
  17. Morrison, B., Elkin, B. S., Dolle, J. P., Yarmush, M. L. In vitro models of traumatic brain injury. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 13, 91-126 (2011).
  18. Johnson, V. E., Meaney, D. F., Cullen, D. K., Smith, D. H. Animal models of traumatic brain injury. Handbook of Clinical Neurology. , 115-128 (2015).
  19. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 128-142 (2013).
  20. Morganti-Kossmann, M. C., Yan, E., Bye, N. Animal models of traumatic brain injury: is there an optimal model to reproduce human brain injury in the laboratory?. Injury. 41, S10-S13 (2010).
  21. Banks, P., Franks, N. P., Dickinson, R. Competitive inhibition at the glycine site of the N-methyl-D-aspartate receptor mediates xenon neuroprotection against hypoxia-ischemia. Anesthesiology. 112 (3), 614-622 (2010).
  22. Harris, K., et al. Neuroprotection against traumatic brain injury by xenon, but not argon, is mediated by inhibition at the N-methyl-D-aspartate receptor glycine site. Anesthesiology. 119 (5), 1137-1148 (2013).
  23. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  24. Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Research Protocols. 3 (3), 278-290 (1999).
  25. Macklis, J. D., Madison, R. D. Progressive incorporation of propidium iodide in cultured mouse neurons correlates with declining electrophysiological status: a fluorescence scale of membrane integrity. Journal of Neuroscience Methods. 31 (1), 43-46 (1990).
  26. Salvador-Silva, M., et al. Responses and signaling pathways in human optic nerve head astrocytes exposed to hydrostatic pressure in vitro. Glia. 45 (4), 364-377 (2004).
  27. Howard, D., Sturtevant, B. In vitro study of the mechanical effects of shock-wave lithotripsy. Ultrasound Medical Biology. 23 (7), 1107-1122 (1997).
  28. Effgen, G. B., et al. A Multiscale Approach to Blast Neurotrauma Modeling: Part II: Methodology for Inducing Blast Injury to in vitro Models. Front Neurol. 3, 23 (2012).
  29. Nguyen, T. T. . The characterisation of a shock tube system for blast injury studies. , (2016).
  30. Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets CNS and Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
  31. Sawyer, T. W., et al. Investigations of primary blast-induced traumatic brain injury. Shock Waves. 28 (1), 85-99 (2017).
  32. Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  33. Gahwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neuroscience. 20 (10), 471-477 (1997).
  34. De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nature Protocols. 1 (3), 1439-1445 (2006).
  35. Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term live imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nature Protocols. 1 (3), 1223-1226 (2006).
  36. De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. Journal of Physiology. 550 (Pt 1), 135-147 (2003).
  37. Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS). Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
  38. Cater, H. L., et al. Stretch-induced injury in organotypic hippocampal slice cultures reproduces in vivo post-traumatic neurodegeneration: role of glutamate receptors and voltage-dependent calcium channels. Journal of Neurochemistry. 101 (2), 434-447 (2007).
  39. Atkins, C. M. Decoding hippocampal signaling deficits after traumatic brain injury. Translational Stroke Research. 2 (4), 546-555 (2011).
  40. Bigler, E. D., et al. Hippocampal volume in normal aging and traumatic brain injury. American Journal of Neuroradiology. 18 (1), 11-23 (1997).
  41. Umile, E. M., Sandel, M. E., Alavi, A., Terry, C. M., Plotkin, R. C. Dynamic imaging in mild traumatic brain injury: support for the theory of medial temporal vulnerability. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 83 (11), 1506-1513 (2002).
  42. Effgen, G. B., et al. Primary Blast Exposure Increases Hippocampal Vulnerability to Subsequent Exposure: Reducing Long-Term Potentiation. Journal of Neurotrauma. 33 (20), 1901-1912 (2016).
  43. Effgen, G. B., et al. Isolated primary blast alters neuronal function with minimal cell death in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neurotrauma. 31 (13), 1202-1210 (2014).
  44. Vogel Iii, E. W., et al. Isolated Primary Blast Inhibits Long-Term Potentiation in Organotypic Hippocampal Slice Cultures. Journal of Neurotrauma. , (2015).
  45. Vornov, J. J., Tasker, R. C., Coyle, J. T. Direct observation of the agonist-specific regional vulnerability to glutamate, NMDA, and kainate neurotoxicity in organotypic hippocampal cultures. Experimental Neurology. 114 (1), 11-22 (1991).
  46. Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).
  47. Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V., Malouf, A. T. Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures. The Journal of Neuroscience. 15 (11), 7702-7711 (1995).
  48. Miller, A. P., et al. Effects of blast overpressure on neurons and glial cells in rat organotypic hippocampal slice cultures. Frontiers in Neurology. 6, 20 (2015).
  49. Panzer, M. B., Wood, G. W., Bass, C. R. Scaling in neurotrauma: how do we apply animal experiments to people. Experimental Neurology. , 120-126 (2014).
  50. Campos-Pires, R., et al. Xenon Protects against Blast-Induced Traumatic Brain Injury in an In Vitro Model. Journal of Neurotrauma. 35 (8), 1037-1044 (2018).
  51. Coburn, M., Maze, M., Franks, N. P. The neuroprotective effects of xenon and helium in an in vitro model of traumatic brain injury. Critical Care Medicine. 36 (2), 588-595 (2008).
  52. Campos-Pires, R., et al. Xenon improves neurologic outcome and reduces secondary injury following trauma in an in vivo model of traumatic brain injury. Critical Care Medicine. 43 (1), 149-158 (2015).

Tags

In VitroBlastTraumatic Brain InjuryShockwaveOrganotypic SlicePropidium IodideFluorescence MicroscopyNeuroprotective Drugs

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Campos-Pires, R., Yonis, A., Macdonald, W., Harris, K., Edge, C. J., Mahoney, P. F., Dickinson, R. A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (142), e58400, doi:10.3791/58400 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image