Analisi dei complessi della proteina di membrana tilacoide mediante elettroforesi nativa blu
Summary
Un protocollo per la delucidazione della pianta thylakoid proteina complessa organizzazione e composizione con blu nativo poliacrilammide gel elettroforesi (BN-PAGE) e 2D-SDS-PAGE è descritto. Il protocollo è ottimizzato per Arabidopsis thaliana, , ma può essere utilizzato per altre specie di piante con modifiche minori.
Abstract
Catena di trasporto fotosintetiche dell’elettrone (ecc) converte energia solare in energia chimica sotto forma di NADPH e ATP. Quattro complessi proteici grande incorporato nell’energia solare raccolta membrana tilacoide per guidare gli elettroni dall’acqua a NADP+ via due fotosistema e utilizzare la pendenza del protone creato per la produzione di ATP. Photosystem PSII, PSI, citocromo b6f (Cyt b6f) e dell’atpasi sono tutti i complessi multiproteici con orientamento distinto e dinamiche nella membrana tilacoide. Preziose informazioni circa la composizione e le interazioni dei complessi della proteina nella membrana tilacoide ottenibile da solubilizzare i complessi dall’integrità della membrana di detergenti delicati, seguite dalla separazione elettroforetica di Natale del gel della complessi. L’elettroforesi Natale blu del gel di poliacrilammide (BN-PAGE) è un metodo analitico utilizzato per la separazione dei complessi della proteina nella loro forma nativa e funzionale. Il metodo può essere utilizzato per la purificazione della proteina di complessi per più dettagliata analisi strutturale, ma fornisce anche uno strumento per analizzare le interazioni dinamiche tra i complessi di proteine. Il metodo è stato sviluppato per l’analisi dei complessi della proteina respiratoria mitocondriale, ma da allora ha stato ottimizzato e migliorato per la dissezione dei complessi proteici thylakoid. Qui, forniamo un dettagliato protocollo sono aggiornato per l’analisi di complessi proteici fotosintetici labile e le loro interazioni in Arabidopsis thaliana.
Introduction
Grande proteina del multisubunit complessi fotosistema PSI e PSII, Cyt b6f e dell’atpasi coordinare la produzione di ATP e NADPH in reazioni fotosintetiche di luce. Nei cloroplasti di piante superiori, i complessi si trovano nella membrana tilacoide, che è una struttura a membrana strutturalmente eterogenee, che comprende appressed grana e lo stroma non appressed tilacoidi. L’elettroforesi Natale blu del gel di poliacrilammide (BN-PAGE) è un metodo ampiamente usato nell’analisi dei complessi della proteina del multisubunit grande nella loro forma nativa e biologicamente attivo. Il metodo è stato istituito per la dissezione della membrana mitocondriale della proteina complessi1, ma più successivamente è stato personalizzato per la separazione dei complessi della proteina dalla membrana tilacoide rete3. Il metodo è adatto (i) per la purificazione dei complessi della proteina thylakoid individuali per l’analisi strutturale, (ii) per determinare interazioni natali tra complessi proteici e (iii) per l’analisi dell’organizzazione complessiva dei complessi proteici Dopo aver cambiato il stimoli ambientali.
Prima della separazione, complessi proteici sono isolati dalla membrana con detergenti non ionici attentamente selezionate, che sono generalmente lievi e preservare la struttura nativa dei complessi proteici. Detersivi contengono idrofobo e idrofilici siti e micelle stabile forma sopra una certa concentrazione, chiamato una concentrazione micellare critica (CMC). Aumento della concentrazione di detersivo sopra i risultati di CMC in rottura delle interazioni lipido-lipidico e la solubilizzazione dei complessi della proteina. La scelta di detersivo dipende sulla stabilità della proteina complessa di interesse e la capacità di solubilizzazione del detergente. Ordinariamente usati detergenti sono α/β-dodecil-maltoside e digitonina. La solubilizzazione dei complessi della proteina nel loro stato nativo, materiale insolubile viene rimosso mediante centrifugazione. Nelle piante superiori, la membrana tilacoide è altamente eterogeneo in struttura e alcuni detersivi (ad es., digitonina) solubilizzano selettivamente solo una specifica frazione della membrana3. Pertanto, per caratterizzare l’organizzazione complessa di proteine o le interazioni tra i complessi di proteine, è cruciale determinare sempre la capacità di solubilizzazione del detergente scelto attraverso la determinazione del contenuto di clorofilla e la clorofilla a/b rapporto del surnatante per valutare il rendimento e il dominio rappresentato thylakoid (sub), rispettivamente, della frazione solubilizzata. Il rapporto di clorofilla a/b in tilacoidi intatto di crescita-luce acclimatati piante è in genere intorno alle 3, mentre il chl un / valore b di thylakoid frazioni arricchite in grana o stroma tilacoidi scende di sotto (~ 2,5) o superiore (~ 4,5) al valore del totale tilacoidi, rispettivamente.
Per fornire la carica negativa per i complessi di proteine, colorante (CBB) azzurro brillante di Coomassie è aggiunto al campione solubilizzato. A causa dello spostamento di carica, complessi proteici migrano verso l’anodo e sono separati su una pendenza di acrilamide (AA) secondo la loro forma e la massa molecolare. Separazione efficace e ad alta risoluzione si ottiene utilizzando un gradiente di concentrazione di acrilammide lineare. Durante l’elettroforesi, i complessi di proteine migrano verso l’anodo fino a quando essi raggiungono il loro limite di dimensione dei pori dipendente dalla dimensione. Il formato del poro del gel di poliacrilammide dipende da (i) il totale acrilammide /bis– acrilammide concentrazione (T) e (ii) il cross-linker bis– acrilammide monomero concentrazione (C) riguardante i monomeri totale4. Dopo la separazione con BN-PAGE, i complessi di proteine possono essere ulteriormente suddivisi in loro subunità proteiche individuali di seconda dimensione (2D) – SDS – PAGE. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l’analisi di complessi di proteine di membrana tilacoide da BN-pagina/2D-SDS-PAGE.
Protocol
Representative Results
Discussion
I macchinari di conversione di energia fotosintetica sono composto da complessi di grande proteina del multisubunit, che sono incorporati nella membrana tilacoide. Questo protocollo descrive un metodo di base per l’analisi dei complessi proteici thylakoid pianta Arabidopsis thaliana con BN-PAGE combinato con 2D-SDS-PAGE. Il protocollo è adatto anche per l’analisi dei complessi della proteina thylakoid da tilacoidi tabacco e spinaci, ma potrebbe richiedere piccoli aggiustamenti.
Per l…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta finanziariamente dall’Accademia di Finlandia (numeri di progetto 307335 e 303757) ed energia solare nell’accordo di sovvenzione di biomassa (SE2B) Marie Skłodowska-Curie (675006). Il protocollo si basa sul riferimento3.
Materials
| 6-aminocaproic acid (ACA) | Sigma-Aldrich | A2504 | |
| BisTris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Acrylamide (AA) | Sigma-Aldrich | A9099 | Caution: Neurotoxic! |
| n-dodecyl-β-D-maltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| SDS | VWR | 442444H | |
| Urea | VWR | 28877.292 | |
| Glycerol | J.T. Baker | 7044 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | J.T. Baker | 3688 | |
| EDTA disodium salt | J.T. Baker | 1073 | |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | Caution:Toxic! |
| Pefabloc SC | Roche | 11585916001 | |
| Serva Coomassie Blue G | Serva | 35050 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| APS (Ammonium persulfate) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED (Tetramethylethylenediamine) | Bio-Rad | 1610801 | |
| (N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide | Omnipur | 2610 | |
| Glycine | Fisher | G0800 | |
| Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) | New England Biolabs | P7708 | |
| Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml | Corning | 352093 | |
| Dual gel caster with 10 x 8 cm plates | Hoefer | SE215 | |
| Gradient maker SG5 | Hoefer | ||
| 0.75 mm T-spacers | Hoefer | SE2119T-2-.75 | |
| Sample gel comb, 0.75 mm | Hoefer | SE211A-10-.75 | |
| Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system | Hoefer | SE250 | |
| IPC-pump | Ismatec | ||
| Power supply, PowerPac HV | Bio-Rad | 164-5097 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Rocker-Shaker | Biosan | BS-010130-AAI | |
PROTEAN II xi Cell |
Bio-Rad | 1651813 |
Riferimenti
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