Une méthode automatisée pour déterminer la Performance de la drosophile en réponse aux changements de température dans l’espace et le temps

La température est un facteur environnemental constant qui influe sur les organismes fonctionnent et comportent¹. Différences de latitude et altitude conduisent à des différences dans le type de climats organisme sont exposés, qui se traduit par une sélection évolutive pour leurs réponses à température^2,3. Organismes réagissent à différentes températures moyennant des adaptations morphologiques, physiologiques et comportementales qui maximisent le rendement dans leurs environnements particuliers⁴. Par exemple, chez la drosophile Drosophila melanogaster, les populations des différentes régions ont préférences de température différente, dimensions corporelles, developmental fois, longévité, fécondité et performance marche à différentes températures^{2 ,5,6,7}. La diversité observée entre les mouches d’origines différentes s’explique en partie par la variation génétique et expression de gène en plastique^8,9. De même, Drosophila espèces provenant de régions différentes répartir différemment entre les gradients de température et montrent les différences de résistance à la chaleur extrême et essais de froid^10,11,12.

Drosophile est récemment devenu le modèle de choix pour comprendre les bases génétiques et neurales de température perception^{13,14,15,16,17}. De façon générale, les mouches adultes perçoivent la température par le biais de capteurs de température périphérique chauds et froids dans les antennes et capteurs de température dans le cerveau^{13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20}. les récepteurs de la périphérie pour les températures chaudes expriment Gr28b.d¹⁶ ou²¹de la pyrexie, tandis que la périphérie froides récepteurs sont caractérisés par des Brivido¹⁴. Dans le cerveau, la température est traitée par les neurones exprimant TrpA1¹⁵. Des études comportementales sur les mutants de ces voies sont améliorent notre compréhension de la façon dont la température est traitée et donnent un aperçu des mécanismes qui diffèrent entre les populations de Drosophila provenant de différentes régions.

Nous décrivons ici une arène à température contrôlée qui produit des changements de température rapides et précis. Les enquêteurs peuvent préprogrammer ces changements, qui permet des manipulations de température standardisées et reproductibles sans intervention humaine. Les mouches sont enregistrés et suivis avec un logiciel spécialisé pour déterminer leur position et leur vitesse à différentes phases d’une expérience. La principale mesure présentée dans le présent protocole est la vitesse de marche à des températures différentes, parce que c’est un indice écologiquement pertinent de performance physiologique qui permet d’identifier une adaptabilité thermique individuel⁵. Ainsi que des mutants de récepteur de température, cette technique peut aider à révéler les mécanismes d’adaptation thermique aux niveaux cellulaires et biochimiques.

1. préparation du milieu alimentaire mouche

1. Verser 1 L d’eau du robinet dans un bécher de verre de 2 L et ajouter un magnétique. Placer le bécher sur une plaque chauffante magnétique à 300 ° C jusqu'à ce que la température d’ébullition est atteinte.
2. Remuer à 500 tours/min et ajoutez le code suivant : 10 g d’agar, 30 g de glucose, 15 g de saccharose, 15 g de semoule de maïs, 10 g de germe de blé, 10 g de farine de soja, 30 g de mélasse et 35 g d’active levure sèche.
3. Lorsque le mélange des mousses vigoureusement, baissez la température de la plaque de cuisson à 120 ° C tout en continuant de remuer.
4. Tourner à la température de la plaque chauffante plus loin jusqu'à 30 ° C après 10 min et continuer à remuer jusqu'à ce que le mélange refroidisse à 48 ° C. Mesurer la température en insérant un thermomètre directement dans la nourriture sans toucher les parois du bécher.
5. Dissoudre 2 g d’ester méthylique de l’acide p-hydroxy-benzoïque dans 10 mL d’éthanol à 96 % et ajoutez-le au mélange, avec 5 mL d’acide propionique de 1 M. Continuer à remuer pendant 3 min.
6. Éteindre la plaque chauffante et versez 45 mL d’aliment dans les bouteilles et les 6,5 mL d’aliment dans les flacons de collection d’élevage.

2. préparation des mouches

1. Place 20 garçons et 20 filles vole dans les bouteilles d’élevage contenant 45 mL de milieu de nourriture volée. Transférer les mouches de nouvelles bouteilles après 3 à 4 jours en tapant dessus vers le bas et puis les puiser dans les bouteilles fraîches. Jeter les mouches après trois changements.
   1. Placer les bouteilles à l’intérieur de l’incubateur cycles sombres de lumière/12 h 12 h avec une température constante de 25 ° C.
      Remarque : Une nouvelle génération de mouches seront eclose après dix jours.
2. Anesthésier nouvellement éclos de mouches sur des tampons en dioxyde de carbone pour un maximum de 4 min et à leur rassemblement dans des flacons d’élevage mouche de 2,5 x 9,5 cm 6,5 ml de milieu de nourriture volée à l’aide d’un pinceau.
   1. Recueillir les mouches seulement vierges et séparez-les par sexe en groupes de 20 mouches par flacon d’élevage.
   2. Placer les flacons à l’intérieur des incubateurs pendant 5 à 7 jours, changeant les mouches de nouveaux flacons tous les 2-3 jours et les jours précédant les expériences.

3. cadre de lumières

1. Faire un cadre en bois de 10 cm de long, largeur 4 cm, hauteur 4 cm et 0,5 cm d’épaisseur.
2. Sur chacun des bords courts, créer une bordure de 4 cm de long, 4 cm de hauteur et largeur de 1,5 cm vers l’intérieur zone du cadre en bois. Laissez la face interne de l’ouverture de la frontière.
3. Percer deux trous de 0,5 cm de diamètre à l’intersection de l’un des bords longs de l’armature en bois et à chacune des frontières sur les bords courts.
4. Placer 10 cm d’une bande de LED blanche chaude à l’intérieur de chacune des frontières sur les bords courts. Peler le dos de la bande de LED à coller immédiatement en place.
   Remarque : Pour des expériences en quel illumination doit être éliminé, la bande de LED blanche chaude peut être substituée à LED infrarouge bandes.
5. Connectez une extrémité de la bande de LED dans l’une des frontières de l’alimentation à découpage et son autre extrémité de la bande de LED au bord opposé.
6. Allumez l’alimentation à découpage pour vérifier que les deux bandes de LED s’allume.
7. Couvrir le côté ouvert de chaque frontière avec une feuille blanche de papier.
8. Collez un autre morceau de papier sur chacune des phases internes longitudinal.

4. température contrôlée Arena

1. Allumez l’arène à température contrôlée (Figure 1 a et 1C). S’assurer que le ventilateur se met en marche et l’anneau en aluminium commence à réchauffer.
2. Utilisez un câble USB pour connecter l’arène à température contrôlée pour l’ordinateur exécutant le script TemperaturePhases avec des séquences de température.
3. Ouvrez le script TemperaturePhases dans l’ordinateur et vérifiez que la séquence de température est correctement mises en place (vidéo 1).
   1. Vérifiez que la durée de chaque phase expérimentale est réglée à 60 s en vérifiant que « au pair. StimulusDur » est égal à 60 s.
   2. Vérifiez que le numéro 1) égal à désiré nombre de phases, 2) itératifs marche/arrêt réglage de la lumière rouge indicative des diodes électroluminescentes (del), augmentation de la température 3) 2 ° C par phase, et 4) 16 ° C sous la température de départ sont toutes correctes dans le « démarrer l’expérimental section de bloc ».
      Remarque : Laissez les mouches s’acclimater à l’aréna de voler pendant 7 min à 16 ° C afin d’éviter une augmentation artificielle de la vitesse au cours des premières phases expérimentales (Figure 2).
   3. Exécutez le script TemperaturePhases . Le logiciel s’initialise pendant 5 secondes, selon la définition de « arena. Wait » et puis arrêter.
   4. Appuyez sur la barre d’espace du clavier pour commencer à exécuter les phases expérimentales, une fois qu’une mouche a été soufflée dans l’arène de voler (étape 5.3).
      Remarque : Le TemperaturePhases est le script courant, contrôle de la boîte ; Toutefois, il est possible de créer d’autres scripts personnalisés pour utiliser ce dispositif qui s’ajustent aux besoins des différentes expériences.
4. Connectez la caméra sur le dessus de l’arène à l’ordinateur de l’enregistrement à l’aide du câble USB de la caméra.
5. Ouvrez le programme d’enregistrement vidéo (voir Table des matières) dans l’ordinateur de l’enregistrement en sélectionnant « fichier | Nouvel enregistrement de film ». Un écran affichant l’image de la caméra s’ouvrira.
   1. Veiller à ce que l’image de la caméra capte tous les bords de l’arène et les LEDs rouges indicatives.
   2. Démarrer l’enregistrement en appuyant sur le bouton rouge au milieu de la partie inférieure de l’écran montrant l’image de la caméra après avoir réglé l’armature de lumières autour de l’arène (étape 5.4).
      NOTE : petits changements dans l’éclairage peut affecter la précision de la localisation. Il est recommandé de maintenir l’éclairage de l’arène de contrôle de la température constante en fixant l’emplacement de l’appareil.

5. la température des expériences comportementales

1. Préparer la mouche Arena (Figure 1).
   1. Mettez un brin d’auto-ADHESIF blanc sur le dessus les tuiles en cuivre, assurant que tous les bords sont couverts.
   2. Placez l’anneau d’aluminium chauffée autour des tuiles de cuivre. Le bord de l’anneau s’adapte autour des tuiles en cuivre donc il est toujours placé au même endroit.
   3. Nettoyer le couvercle en verre avec un tissu propre et placez-le sur le dessus de l’anneau en aluminium, en laissant un espace à travers lequel une mouche peut être soufflée dans.
      Remarque : Avant les expériences, recouvrir le couvercle en verre avec l’agent siliconizing pour créer une surface glissante. Appliquer l’agent siliconizing pour 24h et rincez-le à l’eau avant utilisation.
2. Exécutez le script TemperaturePhases (étape 4.3.3) et ouvrez le programme d’enregistrement vidéo (étape 4.5).
3. Souffler la volée d’un flacon d’élevage (étape 2.2.2) dans l’arène de voler (e.g., 1 mâle à la mouche dans la Figure 3).
   1. Prendre un flacon de mouches de l’incubateur, touchez deux fois pour les forcer à aller vers le bas, piéger une mouche avec un aspirateur à bouche et fermer le flacon et remettez-le dans l’incubateur.
   2. Placez la mouche sur la scène par le biais de l’écart qui a été laissé entre le couvercle en verre et anneau en aluminium (étape 5.1.3).
   3. Combler le fossé entre le couvercle en verre et anneau en aluminium en appuyant sur le couvercle en verre jusqu'à ce qu’elle atteigne le bord de l’anneau en aluminium dès que la mouche est introduite dans l’arène de voler.
4. Placer le cadre de lumières autour de l’arène afin d’assurer l’éclairage symétrique.
   1. Marquer l’emplacement (p. ex.., à l’aide d’un marqueur permanent) de la trame de lumières autour de l’arène de voler (Figure 1) pour s’assurer que le cadre est toujours placé au même endroit.
5. Démarrer l’enregistrement avec le programme d’enregistrement vidéo (étape 4.5.2) et appuyez sur la barre d’espacement du clavier de l’ordinateur de contrôle pour commencer à exécuter les phases expérimentales (étape 4.3.4).
6. Phases expérimentales après tout terminés, enregistrer la vidéo au format .mp4 ou .avi et retirer la mouche de l’arène de voler avec l’aspirateur de la bouche.
   Remarque : La fin des phases expérimentales peut être déterminée par les deux LEDs rouges indicatifs étant éteints ou par l’arrêt du script TemperaturePhases .
   1. Arrêter l’enregistrement vidéo en appuyant sur le bouton arrêter au milieu du bord inférieur de l’écran dans le programme d’enregistrement. Appuyez sur « fichier | Enregistrer sous » pour enregistrer la vidéo.

6. lunette Digital video suivi et analyse des données

1. Utiliser le FlySteps dépistant le logiciel (vidéo 2) pour suivre les vidéos.
   1. Ouvrez le « fichier_configuration.ini » dans le dossier « FlyTracker ».
   2. Définir l’emplacement des vidéos en « video_folder » et les noms des vidéos en « video_files ».
   3. Spécifier les frontières de l’arène de voler en « arena_settings », basé sur (x, y) coordonnées en pixels de plusieurs points au bord de l’arène.
   4. Spécifier l’emplacement des LEDs rouges indicatives dans « led_settings », basé sur (x, y) coordonnées en pixels de l’emplacement du centre de la LED.
   5. Vérifiez l’emplacement des frontières de l’arène de voler en définissant « debug » à « true » dans « arena_settings », en cliquant sur « Enregistrer » et exécuter le script dans le terminal. Une capture d’écran de la vidéo s’affiche avec un carré bleu formé par les coordonnées saisies dans « arena_settings ».
      Remarque : Cette place entoure la zone à être l’objet d’un suivi.
   6. Changer « debug » dans « arena_settings » à « false », cliquez sur « Enregistrer » et exécutez l’écran dans le terminal une fois de plus.
      NOTE : Ceci va commencer le processus de suivi.
      Remarque : Les mouches peuvent marcher hors de la zone de suivi sur l’anneau en aluminium chauffée. Cela se produit pendant les premières secondes d’une expérience, après quoi les mouches cesser de toucher l’anneau chauffée et restent à l’intérieur de la zone de suivi.
      Remarque : Les vidéos peuvent être suivis avec d’autres logiciels de suivi selon les préférences de l’expérimentateur.
2. Utilisation (x, y) emplacement de chaque volée fournie par le logiciel de suivi pour calculer la mesure de l’intérêt pour l’exécution de la température. Scripts personnalisés (par exemple., FlyStepsAnalysis en supplémentaires) peut être utilisé.
3. Comparer les courbes de performances de température des différents groupes de voler à l’aide de mesures répétées (RM) analyse de la variance (ANOVA) et post-hoc des comparaisons multiples à l’aide de logiciels statistiques (voir Table des matières).

L’arène à température contrôlée (Figure 1 a) se compose de trois tuiles de cuivre dont la température peut être contrôlée individuellement grâce à un circuit programmable. Chaque tuile cuivre possède un capteur de température qui donne une rétroaction au circuit programmable. Le circuit déclenche une alimentation pour augmenter la température de chaque tuile. Des éléments thermo-électriques passives agissent comme des éléments de chauffage constante pour maintenir la température désirée, et un dissipateur de chaleur refroidi par un ventilateur fournit un refroidissement constant. L’ampleur du changement de température détermine la vitesse du processus de manière non linéaire. Une augmentation de 2 ° C nécessite seulement 0,1 s et une augmentation de 18 ° C il faut 4 s. Un écran connecté au circuit programmable (Figure 1) informe l’utilisateur de la température mesurée par les capteurs de température dans chacune des tuiles. Les tuiles en cuivre sont entourées d’un anneau d’aluminium constamment chauffé à 50 ° C (Figure 1 b et 1C) de semi-conducteurs à la périphérie. Cet anneau forme les bords de l’arène de voler (Figure 1), la zone dans laquelle les mouches doivent être placées. L’arène de voler est couvert par un couvercle en verre siliconé (Figure 1 a et 1C), qui offre un espace de 3 mm haute qui s’assure que les mouches peuvent marcher mais pas voler. À côté de l’arène de voler sont deux LEDs rouges (Figure 1) qui peuvent être programmées pour marquer les différentes phases expérimentales. Par exemple, pour les résultats affichés dans la Figure 2 a, chaque LED est associé avec une température différente, alors que dans la Figure 2 b, chaque LED indique 60 s. Le logiciel FlySteps peut enregistrer lorsque chacun des indicatifs LED est allumé, et le chercheur peut ensuite utiliser ces informations pour déterminer automatiquement les phases expérimentales basées sur la température ou le temps.

L’arène de température contrôlée peut être utilisé pour comparer la réponse comportementale de mouches de différents fonds génétiques aux changements de température dynamique. Par exemple, les mouches provenant de différentes espèces peuvent être exposés à augmentez la température (Figure 3) pour comparer les différences dans la performance thermique. La vitesse de toutes les espèces augmente à mesure que la température augmente jusqu'à atteindre un point d’une performance maximale, après quoi il a diminué et ont péri. Cependant, chaque espèce a une courbe de réponse particulière avec des vitesses de réaction maximale spécifique et tolérances thermiques. Les rapports précédents ont montré que la drosophile provenant de différentes espèces diffèrent entre le moment du développement, la longévité, la fécondité, dimensions du corps, communication sexuelle et température tolérance^{3,6,7 ,8,22}. Ainsi, notre description de locomotion propres à chaque espèce dans un gradient de température ajoute à cet ensemble de travaux.

L’arène de température contrôlée permet également d’étudier la réponse au conditionnement des expériences basées sur la température. La forme la plus simple de cette approche est un paradigme de conditionnement opérant dans lequel les mouches sont formés à préférer un côté de l’arène sur l’autre, par échauffement du côté qui sera évité^23,24,25. Nous avons exposé des mouches à 40 ° C au milieu et une des tuiles côté, tout en laissant les autre carreaux de côté à un confortable 22 ° C (Figure 4). Mouches de type sauvage a rapidement arrêté se déplaçant le long de la scène et est resté à l’endroit confortable. En revanche, le mutant de mémoire classique cancre gardé explorant l’arène et passée moins de temps que les témoins à l’endroit confortable. Les différences entre les performances des mouches sauvage et des mutants de cancre s’agrandissait lorsque toutes les tuiles ont été placées à 22 ° C et des comparaisons ont été faites entre les groupes de traitement. Des mutants de cancre a également montrent une plus grande différence entre les phases de formation et de test en comparaison avec les mouches de type sauvage (Figure 4). Ces résultats suggèrent un effet de mémoire sur restant dans l’emplacement confortable.

Combinaisons de température et l’emplacement sont également utiles pour comprendre la fonction des récepteurs de température différente lors des changements de la dynamique de la température. Nous avons exposé des mutants de d. melanogaster Gr28b.d et TrpA1^GAL4 individuels à l’augmentation de la température (2 ° C augmenter toutes les 60 s) tout en fournissant un endroit confortable à 22 ° C (Figure 5). L’emplacement confortable déplacé de gauche à droite et vice versa, par itération. Les résultats montrent que les mutants de Gr28b.d de récepteur de température périphérie se comportent comme le contrôle, car ils passent plus de temps à l’endroit confortable lorsque la température augmente. Cependant, cerveau température récepteur TrpA1^GAL4 des mutants ne sont pas affectés par l’augmentation de la température et ne changent pas leurs emplacements dans l’arène. L’augmentation et la diminution de la courbe de TrpA1^GAL4 mutants montrent l’effet chez les mouches qui se trouvaient déjà dans l’emplacement confortable avant qu’il soit confortable et est resté là pendant cette phase. La cohérence des pics et les vallées de la courbe de TrpA1^GAL4 suggèrent que ces mouches sont restés encore pendant la majeure partie de l’expérience ; par conséquent, ils ont été comptés constamment lorsque leur emplacement était celui considéré comme confortable. Cette conclusion a été confirmée par un examen visuel des vidéos enregistrées. Ces résultats appuient précédents rapports physiologiques suggérant cette perception de la périphérie de changements rapides et grands ne dépend pas de le Gr28b.d¹⁷ et que les mouches possèdent un mécanisme central principal pour détecter la température basée sur TrpA1 ^14,21.

Figure 1 : diagramme de température contrôlée-arène. (A) une vue latérale de l’arène à température contrôlée. Un circuit programmable connecte un capteurs de puissance d’alimentation et de la température à résistances sous tuiles en cuivre pour contrôler leur température. Tuiles sont constamment refroidis par un dissipateur de chaleur relié à un ventilateur. Un anneau d’aluminium chauffée sur laquelle repose un couvercle en verre entoure les tuiles. (B) thermiques de montrant les tuiles fixé à 24 ° C (haut) et des carreaux de côté à 24 ° C avec une tuile moyenne à 30 ° C (en bas). Vue de dessus A (C) de l’arène. Une caméra enregistre les tuiles en cuivre, anneau en aluminium et LED rouges, puis détermine automatiquement les phases expérimentales. Un écran dans le coin de la boîte, non enregistrée par la caméra, affiche la température actuelle de la tuile. (D) l’anneau de lumière : deux bandes de LED blancs chauds à l’intérieur d’une boîte en bois, couvert de livre blanc assurer éclairage constant et symétrique de la scène entière. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : mouches doivent s’acclimater à l’arène, avant de commencer le protocole température. (A) seul mouches mâles ont été présentés à l’arène et a permis d’explorer à une constante de 16 ° C pendant 1 min, après quoi la température a commencé à augmenter. (B) single mouches exposés à 16 ° C 20 ° C et 24 ° C (aucune différence de groupe ; bidirectionnelle ANOVA F (2 570) = 4.156, p = 0,162) ont une locomotion plus élevée au début de l’expérience qu’après 5 min (bidirectionnel RM ANOVA F (9 570) = 7.803, p < 0,0001). Les données sont la moyenne et l’écart-type de la moyenne (± SEM) des 20 mouches femelles vierges âgés de 5 à 7 jours testé sur plusieurs jours. Astérisque indique une différence significative entre les groupes (*** p < 0,0001 ; Tukey du test de comparaison multiple, p = 0,05). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Locomotion de 5 espèces de drosophile , exposés à des températures progressivement croissantes. Chaque mâle vole de tempérée, tropicale (bleu), (rouge), et espèce cosmopolite de drosophile (brun) ont été exposés à un gradient croissant de température (2 ° C toutes les 60 s) entre 16 et 46 ° C. Les 7 premières minutes étaient constamment à 22 ° C pour permettre des mouches à la découverte de l’arène. Espèces diffèrent significativement (bidirectionnel RM ANOVA F(4,70) = 28.46, p < 0,001). (a) d. melanogaster (brun ; rempli de cercles) a été plus rapide lorsque introduit dans l’arène. (b) d. yakuba (rouge ; vide carrés) a été plus rapide que la température a augmenté. (c) d. suzukii (brun carré rempli) était plus lent que les autres mouches cosmopolites au point maximum de performance. (d) d. simulans (brun, vider les cercles) était en décroissance au point maximal de D. melanogaster. Chaque point représente la moyenne (± SEM), des mouches mâles 15 5 à 7 jours testés sur plusieurs jours. Signification est indiquée par (♦ = différence de tous, p < 0,0001 ; † = différence de tout sauf d. melanogaster, p < 0,0001 ; • = différence de d. melanogaster, p < 0,01 ; ¢ = différence de d. melanogaster, p < 0,001 ; = différence entre groupes nommés, p < 0,0001 ; Tukey du test de comparaison multiple, p = 0,05). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : l’arène de température contrôlée peut être utilisé pour le conditionnement opérant. Souche de Canton-S de d. melanogaster (sauvage ; noir bordure) et dnc¹ (cancre; bordure rouge) mutants ont été formés à préférer une tuile latérale à 22 ° C après réchauffement au milieu et en face de tuiles latérales à 40 ° C pendant 4 min (formation, ne Pattern). Mémoire des zones chauffés est ensuite testé en définissant toutes les tuiles à 22 ° C (test ; modèle de grille). Les mouches ont été conditionnés à préférer les carreaux sur la gauche dans la moitié des expériences, puis les carreaux sur la droite dans l’autre moitié. Le pourcentage du temps total à l’intérieur de la tuile à 22 ° C au cours de la formation et les tests a été mesuré pour comparer les performances. Groupes ne différait (aller simple ANOVA F(3,76) = 23.23, p < 0,0001), avec un imbécile spectacle pire que sauvage dans l’ensemble. Les données sont moyenne (± SEM) des mouches femelles vierges 20 5 à 7 jours testés sur plusieurs jours. Astérisques indiquent les différence de signification entre les groupes (*** p > 0,0001 ; *** p > 0,001 ; ** p > 0.01 ; Tukey du test de comparaison multiple, p = 0,05) s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : réponse de mutants de température à la température quand un endroit confortable est fourni. Mutants de température Gr28b.d (vert ; places) répondent en tant que contrôles (w¹¹¹⁸, black ; cercles) en augmentant le pourcentage de temps dans la zone confortable lorsque la température augmente (bidirectionnel RM ANOVA F (1,38) = 0.5107, p = 0,479). TrpA1^GAL4 mutants (jaune ; triangles) sont différents des témoins (w¹¹¹⁸, noir), comme elles n’augmentent pas le temps dans la zone confortable lorsque la température augmente (bidirectionnel RM ANOVA F (1,38) = 1,670, p = 0,019). Les données sont moyenne (± SEM), des mouches mâles 20 5 à 7 jours testés sur plusieurs jours. TrpA1^GAL4 est significativement différente de la Gr28b.d et le contrôle (p < 0,05 ; Tukey du test de comparaison multiple, p = 0,05). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Ici, nous avons présenté une automatisé thermorégulées arène (Figure 1) qui produit des changements de température précis dans le temps et l’espace. Cette méthode permet d’exposition individuelle drosophile non seulement préprogrammé augmentation progressive de la température (Figure 2 et Figure 3), mais aussi aux défis de température dynamique où chaque carreau de l’arène de mouche a été chauffé indépendamment, à une température différente (Figure 4 et Figure 5).

L’arène de température contrôlée utilise une approche innovante pour le processus de chauffage. Au lieu de produire des changements de température dans les carreaux par thermoélectrique Peltier résistances utilisées dans les méthodes traditionnelles, l’arène thermorégulées utilise actuel pour réchauffer une masse de cuivre avec les tuiles de cuivre, et mouches sont placés en haut. La masse de cuivre est constamment refroidie par un bloc dissipateur de chaleur relié à un ventilateur. Peltier-comme éléments sont utilisés pour maintenir la température désirée de la masse de cuivre, une fois qu’il a été réchauffé. Parce que ces éléments ne sont pas les générateurs principaux de température, elles souffrent moins de stress, qui prolonge leur durée de vie et permet des changements de température plus rapides. Un circuit programmable qui reçoit des commentaires provenant de capteurs de température sous chacun des carreaux en cuivre, qui peut également activer l’alimentation basse tension, coordonne le mécanisme de chauffage. Les chercheurs peuvent spécifier quand et où les changements de température se produisent et déterminent l’intensité et la direction de tels changements. En outre, la méthode de couplage avec spécialisées dépistant le logiciel, tels que FlySteps, permet l’analyse de tous les aspects liés au mouvement de la drosophile , tels que la vitesse globale à certaines températures ou le temps passé dans certains endroits ( La figure 2, Figure 3, Figure 4et Figure 5). Néanmoins, tous les résultats doivent tenir compte des caractéristiques inhérente à voler les comportements susceptibles d’affecter leur locomotion. Par exemple, si les mouches ne sont pas autorisés à explorer l’arène et à régler avant de changer la température, les mesures de vitesse peuvent être artificiellement élevés (Figure 2). Mouches peuvent également laisser des substances odorantes qui affectent les mouches ultérieures ; par conséquent, le couvercle en verre doit être nettoyé, et bande couvrant les tuiles doit être changé entre les sujets. Étant donné que la locomotion diminue à mesure que les mouches âge²⁶, il est important que mouches sont standardisés pour l’âge éviter les variations dans les résultats. Dans notre aréna, les mouches ont également montré centrophobism, préférant les bords sur la zone médiane. Expérimentateurs doivent contrôler pour cela en changeant l’emplacement des espaces confortables pour éviter de surestimer les préférences de site.

Les caractéristiques actuelles de l’arène et les exigences du processus de suivi qui pourraient limiter certaines procédures expérimentales. Par exemple, l’environnement proche de l’arène n’inclut pas les points d’accès à travers lequel les odeurs pourraient être introduites, qui empêche les études dans lesquelles ce stimulus est important. De même, le tracker FlyStepts nécessite des vidéos avec des arrière-plans uniformes, qui limite la possibilité d’ajouter des aliments ou autres éléments d’environnement de la mouche. L’arène pourrait être adaptée pour inclure un raccordement avec un robinet de gaz, et développements logiciels existent qui peuvent permettre aux objets plus d’être présent. Futurs projets peuvent tirer parti de ces possibilités d’adapter l’arène à température contrôlée aux besoins spécifiques de l’expérimentales.

Enfin, nous avons montré dans les résultats de différentes espèces de drosophile effectuent différemment car la température augmente (Figure 3) et que des mutants de température ne réagissent pas de la même manière en tant que contrôles (Figure 5). Cela montre que cette nouvelle méthode peut être utilisée pour explorer le comportement thermique de la drosophile et comment elle est affectée par la sélection naturelle et des caractéristiques fonctionnelles. Enfin, il montre que notre méthode peut aider davantage de compréhension de l’adaptation thermique et spéciation ainsi que les interactions entre les récepteurs de température et autres stimuli étudie à l’avenir.