في فيفو اثنين-فوتون تصوير الخلايا العصبية القشرية في الفئران حديثي الولادة
Summary
نقدم في فيفو اثنين-فوتون التصوير البروتوكول للتصوير قشرة الدماغ الفئران حديثي الولادة. هذا الأسلوب مناسبة لتحليل الديناميات التنموية من الخلايا العصبية القشرية، الآليات الجزيئية التي تتحكم في ديناميات الخلايا العصبية، والتغيرات في ديناميات الخلايا العصبية في نماذج المرض.
Abstract
تصوير اثنين-فوتون أداة قوية للتحليل في فيفو الدوائر العصبية في الدماغ الثدييات. ومع ذلك، توجد عدد محدود من أساليب التصوير في فيفو لفحص أنسجة المخ من الثدييات حديثي الولادة الحية. وهنا يمكننا تلخيص بروتوكول لتصوير الخلايا العصبية القشرية فردية في الفئران حديثي الولادة الحية. يتضمن هذا البروتوكول المنهجيتين التالية: (1) نظام سوبر نوفا لوسم متفرق ومشرق للخلايا العصبية القشرية في الدماغ، و (2) إجراء العمليات جراحية للجمجمة الولدان الهشة. ويسمح هذا البروتوكول مراقبة التغيرات الزمنية لفرادى نيوريتيس القشرية خلال مراحل الأطفال حديثي الولادة مع ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء. كما يمكن عن طريق الجمع بين الفائق مع تدخل الجيش الملكي النيبالي والجينات كريسبر/Cas9 تحرير نظم إسكات الجينات الخاصة بخلية مسماة وخروج المغلوب. هذا البروتوكول، وبالتالي، يمكن لتحليل الديناميات التنموية من الخلايا العصبية القشرية، الآليات الجزيئية التي تتحكم في ديناميات الخلايا العصبية، والتغيرات في ديناميات الخلايا العصبية في نماذج المرض.
Introduction
الأسلاك الدقيقة من الدوائر العصبية في قشرة الدماغ ضروري لوظائف الدماغ العليا بما في ذلك التصور، والإدراك، والتعلم والذاكرة. الدوائر القشرية المكررة بشكل حيوي أثناء التطوير بعد الولادة. الدراسات وحققت عملية استخدام تشكيل الدائرة القشرية غذائها و في المختبر تحليلات الثقافة. ومع ذلك، ظلت ديناميات تشكيل الدائرة في الثدييات الحية غير مستكشفة في معظمها.
اثنين-فوتون الفحص المجهري تستخدم على نطاق واسع للتحليلات في فيفو الدوائر العصبية في الدماغ الماوس الكبار1،2. ومع ذلك، نظراً للتحديات التقنية، سوى عدد محدود من الدراسات تناولت تشكيل الدوائر العصبية في الفئران حديثي الولادة. على سبيل المثال، يقوم كاريو et al. تصوير مرور الزمن تسلق الألياف في المخيخ في الأسبوع بعد الولادة الثانية3. كيليو بورترا et al. عن تصوير محاور عصبية في الطبقة القشرية 1 في أول أسبوع بعد الولادة4. في الدراسة الحالية، ويمكننا تلخيص بروتوكول لمراقبة طبقة 4 القشرية الخلايا العصبية وعلى dendrites في الفئران حديثي الولادة. وترد النتائج التي تم الحصول عليها بتطبيق هذا البروتوكول، التي تتضمن منهجيات اثنين، في لدينا منشور الأخيرة5. أولاً، نحن نستخدم5،نظام ناقل سوبر نوفا6 لوضع العلامات الفردية من الخلايا العصبية في الدماغ الولدان. في نظام سوبر نوفا، البروتينات الفلورية تستخدم لتسمية الخلايا العصبية الجينات الخاصة بخلية قابلة للصرف والمسمى ضربة قاضية وتحليلات التحرير/خروج المغلوب أيضا ممكنة. ثانيا، نحن تصف إجراء العمليات جراحية لإعداد إطار الجمجمة في الفئران حديثي الولادة الهشة. معا، تسمح هذه المنهجيات في فيفو الملاحظة الفردية الخلايا العصبية في أدمغة الأطفال حديثي الولادة.
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوات حاسمة في البروتوكول واستكشاف الأخطاء وإصلاحها:
أن الخطوة الأكثر أهمية للبروتوكول هو إزالة الجمجمة (الخطوة 3، 2 من البروتوكول). عند الإدراج، تلتزم شفرة حلاقة غالباً دوراً، مما تسبب في نزيف دورال وتلف الدماغ. ويمكن تجنب هذا بإضافة قطره من المخزن المؤقت اللحاء في الجمجمة و?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون ساتو ت. وم. كانباياشي كوياما س. للمساعدة التقنية. JSPS كاكينهي منحة أرقام JP15K14322 و JP16H06143، ومؤسسة العلوم وتاكيدا، مؤسسة النصب التذكاري أوهارا، والتعاونية البحوث المشروع من جامعة نيغاتا الدماغ بحوث المعهد عام 2017-2923 (صاحب الجلالة) وتم تأييد هذا العمل JP16K14559 كاكينهي، JP15H01454، و JP15H04263، ومنحة في البحث العلمي في مجالات الابتكار “التنظيم الديناميكي وظيفة المخ بالخردة وبناء نظام” (JP16H06459) من يأمرون (منظمة الشفافية الدولية).
Materials
| pK031. TRE-Cre | Autori | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Autori | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Autori | – | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | – | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | – | |
| Titanium bar | Autori | – | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | – | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Autori | – | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
Riferimenti
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).
- Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination. The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biology. , e272 (2005).
- Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
- Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Scientific Reports. 6, 35747 (2016).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity. The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Biologia dello sviluppo. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscienze. 103 (4), 865-872 (2001).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Mizuno, H., et al. Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
- Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
- Young, P., et al. Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice. Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).
- Liu, J., et al. Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age. Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).
- Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLIFE. 6, e26839 (2017).
- Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106 (2018).
