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Materials
Riferimenti
Biochimica

Purificação de proteínas anaeróbica e análise cinética através do eletrodo de oxigênio para estudar a inibição e atividade dioxigenase DesB

Published: October 03, 2018
doi:
10.3791/58307
, , , ,
1Department of Chemistry,Wesleyan University

Summary

Aqui nós apresentamos um protocolo para a purificação da proteína anaeróbico, concentração da proteína anaeróbica e posterior caracterização cinética usando um sistema de eletrodo de oxigênio. O método é ilustrado usando a enzima DesB, uma enzima dioxigenase, que é mais estável e ativo quando purificado e armazenados em um ambiente anaeróbio.

Abstract

Proteínas sensíveis ao oxigênio, incluindo as enzimas que utilizam o oxigênio como um substrato, podem ter reduzido estabilidade quando purified usando métodos tradicionais de purificação aeróbio. Este manuscrito ilustra os detalhes técnicos envolvidos no processo de purificação anaeróbica, incluindo a preparação de amortecedores e reagentes, os métodos de cromatografia de coluna em uma caixa de luva e a dessalinização da proteína antes da cinética. Também descritos são os métodos de preparação e usando um eletrodo de oxigênio para realizar a caracterização cinética de uma enzima de oxigênio-utilizando. Esses métodos são ilustrados, utilizando a enzima dioxigenase DesB, uma dioxigenase galato de bactéria estirpe de Sphingobium SP. SYK-6.

Introduction

Enzimas que utilizam ferro ou outros metais para ativar o oxigênio são frequentemente suscetíveis à inativação durante o processo de purificação por causa de sua remoção do ambiente de redução de uma célula. Portanto, estas proteínas devem ser usadas como lisados celulares, ser submetidas a externos agentes redutores ou ser purificadas por via anaeróbia para garantir que eles têm atividade enzimática ideal1,2,3,4. Para essas enzimas que são oxigênio-sensível (especificamente ferro-contendo enzimas), realizando todas as etapas de purificação e caracterização, mantendo condições anaeróbias é necessário totalmente caracterizá-las. Isto levou os pesquisadores a desenvolver instalações de laboratório inteiro dentro dos limites das câmaras anaeróbias para estudos variando de expressão de proteínas através de cristalografia5,6,7,8 .

Neste documento, nós relatamos métodos de purificação anaeróbica e caracterização cinética da enzima DesB usando um sistema de eletrodo de oxigênio. DesB é uma dioxigenase galato de bactéria estirpe de Sphingobium SP. SYK-6 que está relacionada com a LigAB, uma dioxigenase protocatecuate do organismo mesmo. Ambas as enzimas pertencem ao tipo II protocatechuate dioxigenase (PCAD) superfamília que não tem sido estudada extensivamente a data9, provavelmente em parte devido a enzimas desta superfamília sendo suscetíveis à inativação quando purified usando padrão aeróbio métodos de purificação de proteínas. Uma vez que algumas das enzimas PCAD exibam a promiscuidade de substrato, enquanto outros são específicos do substrato2,10, ainda mais, caracterização desta superfamília é necessária identificar os determinantes da especificidade. Como tem sido observado em várias enzimas superfamílias11,12,13,14,15, pequenas moléculas podem alterar a atividade através de inibição competitiva direta ou a vinculação de moléculas para separar bolsos alostéricos que provoca um aumento ou diminuição da atividade enzimática16. Enquanto cinética sozinha não pode diferenciar o local de ligação de um modulador, determinar a magnitude de uma mudança de atividade é importante para entender os efeitos. Como tais, métodos para a caracterização cinética da atividade de DesB nativa e sua atividade na presença de 4-nitrocatechol 4 (NC), um composto comumente usado para caracterizar e inibir dioxigenase enzimas2,17, 18, são mostrados.

DesB é capaz de quebrar para baixo galato, um aromático derivados de lignina e composto, através de uma reação da dioxigenase (EDO) extradiol qual anel de abertura é catalisada utilizando o oxigênio como um dos substratos10,19. Esta reação enzimática ocorre dentro do contexto da degradação de lignina, um heteropolímero aromático encontrada na parede celular das plantas. Lignina pode ser depolymerized, produzir uma variedade de compostos aromáticos, que pode ser mais dividido em metabólitos central3,20,21,22,23,24 ,25,26,,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (EDO) catalisar um anel de abertura reação em compostos aromáticos dihydroxylated, onde a clivagem ocorre adjacente a um diol metal-coordenado; em contraste, dioxygenases intradiol cleave análogos compostos aromáticos entre os dois grupos hidroxila (Figura 1). EDOs, como muitas outras metaloenzimas, tem um centro de metais divalente para Fe coordenação composta por um dois-histidina,3534,9,do Tríade 1-carboxilato. Estes metaloenzimas se tornar oxidadas, por meio de auto-oxidação ou inativação baseada em mecanismo, Considerando que a enzima é processada inativo2,36,37,38.

Em procedimentos experimentais descritos neste manuscrito, utilizamos DesB, um membro da superfamília PCAD da bactéria Sphingobium SP. SYK-6, para catalisar a adição de oxigénio através do vínculo de C4-C5 de galato (Figura 2A). O regiochemistry desta clivagem é análogo ao LigAB, que é um protocatechuate-4,5-dioxigenase (Figura 2B). Até então, investigações deste dioxigenase galato não incluem nenhum relato de compostos que inibem DesB10,19,39. Com o uso de métodos de purificação aeróbio, DesB exibiram atividade variável, enquanto com o uso de métodos anaeróbios fomos capazes de consistentemente obter proteína com atividade reprodutível. Os estudos cinéticos descritos aqui mostram os métodos de purificação anaeróbica do DesB, caracterização cinética de reação de DesB com galato e a inibição de DesB por 4-nitrocatechol (4 NC).

Protocol

1. general materiais e métodos Prepare todos os meios necessários, conforme descrito na tabela 1. Autoclave a 120 ˚ c durante 15 min. estéril filtrar a solução SOC, após a adição de MgCl2 e glicose, passando-a através de um filtro de 0,2 µm. Ajuste o pH da solução de caldo lisogenia (LB mídia) do moleiro antes da autoclavagem. A solução de mídia LB-Amp de suplemento após a esterilização em autoclave com soluções estéreis de 0,2 mM L-cisteína, então 0,1 mM fer…

Representative Results

É mostrada a análise do gel de SDS-PAGE de frações individuais de purificação da construção de fusão de DesB-maltose ligação proteína (MBP) (Figura 3). O gel revela que a proteína é pura (MW = 91.22 kDa), exceto a presença de DesB (MW = 49.22 kDa) e domínio da proteína MBP (42 kDa) clivada do outro. Fracções E2 e E3 foram selecionados para a concentração (etapa 4.2). Resultados …

Discussion

Os passos críticos na obtenção de ativa, purificada da proteína DesB envolvem a formação e manutenção do site ativo da FE reduzido na enzima. Como tal, corrigir o desempenho da indução, purificação, concentração, e passos do desalting são essenciais para obter com sucesso a enzima activa. Induzindo a expressão de proteínas em presença de sulfato de amônio ferroso de 1 mM garante que FE corretamente é incorporada ao sítio ativo de DesB. Este método é inspirado por estudos como aqueles com amidohydro…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer o Dr. Camille Keller da Wesleyan University para suporte técnico. Professor Lindsay D. Eltis e Jenna K. Capyk pela University of British Columbia, bem como Christian Whitman a Universidade do Texas em Austin, um agradecimento especial por seus conselhos sobre métodos de purificação de proteínas anaeróbico e o uso de um O2 -eletrodo sensível.

Materials

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise Gold Bio Technologies I2481C50
Coomassie Brilliant Blue R-250 Bio-Rad 161-0400
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700
30% Acrylamide Bio-Rad 161-0158
N,N'tetramethyl-ethylenediamine Bio-Rad 161-0801
Amylose Resin High Flow New England Biolabs E8022S
BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells New England Biolabs C2527I
L-cysteine Sigma Aldrich C7352
gallic acid Sigma Aldrich G7384
4-nitrocatechol Sigma Aldrich N15553
Ferrous ammonium sulfate Mallinckrodt 5064
Sodium dithionite Alfa Aesar 33381-22
wheaton serum bottles Fisher Scientific 06-406G
25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane Pall Corportation 4187
400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator EMD Millipore UFSC40001
76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter EMD Millipore PLGC07610
DL-dithiothreitol Gold Bio Technologies DTT50
Sephadex G-25 coarse desalting gal column GE Healthcare 17-0033-01
2 mL Crimp-Top Vials Fisher Scientific 03-391-38
Oxygraph Plus Electrode Control Unit Hansatech Instruments OXYG1 Plus
Oxygen Eletrode Chamber Hansatech Instruments DW1
Electrode Disc Hansatech Instruments S1
PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel Hansatech Instruments S4
Electrode cleaning Kit Hansatech Instruments S16
Spacer paper Zig Zag available at any gas station
He-series Dri-Lab glove box Vacuum/Atmospheres Company
HE-493 Dri-Train Vacuum/Atmospheres Company
Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula Fisher Scientific 21-401-10
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column Fisher Scientific k420400-1530
10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe Hamilton 80300
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column Fisher Scientific K420401-1505
Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer Avestin
B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent Thermo Fisher Scientific 89821
Lysozyme from chicken egg white Sigma Aldrich 12650-88-3
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fisher Scientific 151-21-3
ampicillin Sigma Aldrich 7177-48-2
Tryptone Fisher Scientific BP-1421-500
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-10
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-3
Magnesium Chloride Fisher Scientific M33-500
Dextrose Fisher Scientific D16-3
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-1
Tris hydrochloride Fisher Scientific BP153-500
Maltose Fisher Scientific BP684-500
Glycine Fisher Scientific G46-500
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Riferimenti

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Uchendu, S. N., Rafalowski, A., Cohn, E. F., Davoren, L. W., Taylor, E. A. Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition. J. Vis. Exp. (140), e58307, doi:10.3791/58307 (2018).
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