温度控制384孔板中用 Ca 敏感荧光染料测定人 iPSC 的心肌细胞较多的收缩

1. 细胞板的制备 注: 准备细胞板 3-4 周前的药物影响的测量。 实验0天注意: 为了进行规划, 测试复合应用程序可以在实验的22天-28 之间的任何一天执行。 打开水浴在37摄氏度和温暖40毫升电镀介质 (由制造商提供)。注: 将单元格与供应商提供的匹配区域性和维护媒体一起使用。 将含有冷冻细胞的 cryotubes 在水浴中放置2分钟, 解冻 hiPSC 厘米。 将1毫升细胞悬浮液小心转移到50毫升锥形管上。 用1毫升的温热电镀培养基洗涤每个 cryotube, 从含有细胞的步骤1.1.3 中提取剩余的细胞并将洗涤介质添加到同一个锥形管中。 仔细混合另8毫升温暖电镀介质到细胞悬浮液中。 使用台盼蓝排除方法和 hematocytometer8计数活细胞。注意: 一个384孔细胞板的 6 x 106细胞的要求考虑了在冰冻细胞中多达20% 个死细胞的可能性, 这是我们的经验中最大的。 将细胞悬浮液调节至 5 x 105活细胞/毫升, 并使用温热电镀介质。 将细胞悬浮液分配到两个384孔细胞板中, 每孔添加25µL (每孔约12500个细胞)。注: 电池板不需要与任何矩阵覆膜 (参见讨论)。 在含有 5% CO2的加湿气氛中保持37摄氏度的细胞板。 实验1天 打开水浴在37摄氏度和温暖50毫升的维护培养基补充1% 伏/v 青霉素-链霉素溶液。 在每个孔板中, 用50µL 的热维护介质代替电镀介质。 实验的天数 2-21 (最多27天)注意: hiPSC-CMs 不需要任何传代在此期间, 因为他们是非分裂细胞。 每 2-3 天续订一半维护介质, 并在7、14和21天内完全续订。注: 荧光测量可在实验的22和28天之间进行。较长的持续时间尚未尝试, 但可能仍然正常。 2. 仪器、复合板和测定板的制备 注: 在测定药物效果的当天, 在实验的22和28天之间准备仪器、复合板和检测板。使用带有温度控制的荧光板读卡器和适当的荧光过滤器套件和激发光源。例如, 使用 Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 荧光过滤器套件 (激励: 472 nm; 发射: 520-560 nm) 和 150 W 励磁光源单元。 至少2小时前, 第一个细胞板被放置在板读取器内进行测量, 打开读卡器, 并设置在37摄氏度的供暖系统。注意: 这也可以在前一天晚上完成。 准备阳性对照, 毛佛司, N6-cyclopentyl-adenosine 和 E-4031 作为库存解决方案0.33 毫米在 dmso, 10 毫米在 dmso, 和3.33 毫米在 H2O, 分别。注: 库存解决方案将被稀释333倍的时间, 他们被添加到细胞, 目的是达到最终测试浓度1µM 毛佛司, 30 µM N6-cyclopentyl-adenosine, 和10µM E-4031, 这产生可靠和可重现的效果。 将352种测试化合物作为 DMSO 库存解决方案准备333倍的计划测试浓度 (例如, 10 mM 测试在30µM)。注: 目的是在复合应用后, 在细胞板中达到 0.3% (v-/v) DMSO 的最终浓度;这是最高的 DMSO 浓度, 不影响心肌细胞的节奏活动。库存解决方案也可以在前一天进行准备。每个重复测量需要至少5µL 的库存解决方案。 准备复合板。 温40毫升的维护培养基, 辅以1% 伏/v 青霉素-链霉素溶液室温。 通过增加1.5 µL 的库存溶液, 分别分布到两个384孔复合板中: i) 测试化合物 (两个孔各), ii) 阳性对照组 (毛佛司, N6-cyclopentyl 腺苷, E-4031, 每复合板四孔), iii) 负控制 (DMSO, 每复合板20孔)。 将复合板离心 100 x g , 1 分钟。 在室温下添加37µL 的维护介质到每个井 (3.9% DMSO 在38.5 µL 在该阶段)。 将复合板离心 100 x g , 1 分钟。 将复合板加载到板读取器中。注: 应尽快执行后续步骤, 以最小化复合板中的蒸发。 准备荧光染料。 打开水浴在37摄氏度和温暖100毫升的维护培养基补充1% 伏/v 青霉素-链霉素溶液。 用10毫升的热维护培养基和抗生素重组 Ca 敏感荧光染料和止渴。注: 此股票荧光培养基含有钙敏感荧光染料, 通常 Fluo-4 和止渴, 任何残留物都可以储存在4摄氏度至少5天。 3. 数据采集 注: 在药物效果测量当天执行数据采集。对第一个细胞板完全执行步骤 3.1-. 10, 然后对第二个单元格板重复它们。 启动板读取器软件 (如果需要) 并加载吸管提示。 调整软件设置, 记录2分钟的钙波段, 采集频率至少为10赫兹, 以确定每个油井的基线跳动率。 对于一个细胞板, 稀释3毫升的股票荧光培养基成12毫升的热维护培养基与抗生素, 使荧光培养基。 用30µL 荧光培养基取代20µL 的培养基。 移液器上下1x 混合。 尽快将电池板放入板读卡器, 让 hiPSC 适应到温度。 在开始数据采集之前等待60分钟。 在板读取器软件中开始数据采集, 以记录至少 10 Hz 的采集频率的 Ca 波的2分钟段, 以定义每个井的基线跳动速率。注: 对于每个记录序列, 确保在数据采集后, 电池板不会自动从设备中转移出去。这样可以防止电池板在室温下冷却。有了一些版本的平板阅读器软件, 可能有必要停止每一个录音之前, 它完全结束, 以实现这一点。 通过将5µL 从复合板移入细胞板 (加入后, DMSO 浓度为 0.3% [v/v]), 将测试和参考化合物与平板读卡器机器人一起添加。 在板读取器软件中启动数据采集, 记录2分钟的 Ca 波段, 在化合物添加后开始大约5、15、30、45和60分钟 (确保每一次电池板停留在设备中)。 4. 数据分析 注意: 数据分析可以在测量后的任何时间执行。 将每个录制期间的原始数据从平板阅读器软件导出为 ASCII 文本文件。 将原始数据导入数据分析软件。 对于每个井和所有时间点, 提取主要跳动频率。注: 使用材料表中列出的数据分析软件, 可以使用 LombPeriodogram 函数在自定义分析例程中计算跳动频率, 方法是基于最小二乘法光谱分析的 Lomb–Scargle 法7.周期图应计算在0.01 和 5 Hz 之间的频率范围。可以使用 PeakAutoFind 例程从周期图中提取主频率。这种分析方法比使用平板读卡器软件提供的方法更精确地测量跳动频率。但是, 如果软件自定义不是选项, 则仍可使用后者。 将数据分析软件中每个记录期间的主要跳动频率导出为剪贴板副本或 ASCII 文本文件。 通过剪贴板粘贴或文本文件导入, 将主要跳动频率导入电子表格软件。注意: 可以在任何现代电子表格软件中执行步骤 4.5-4.9。 对于每一个井, 规范化, 以基线的跳动频率在药物应用后的每个时间点 (5, 15, 30, 45 和60分钟) 通过除以主要跳动频率在该时间点由初级殴打频率在基线。 在药物应用 (5、15、30、45和60分钟) 后的每个时间点计算平均 dmso 效应, 方法是对采用 DMSO 的20孔的规范化值进行平均。 在药物应用 (5、15、30、45和60分钟) 之后的每一个井和每个时间点, 减去同一个板块的平均 DMSO 效应 (时间匹配)。 重复测量的平均值。注: 如果化合物改变频率或软件在复合添加后找不到主频率, 则对跳动模式的目视检查可以评估该化合物是否产生心律失常。