Bitki proteinleri böcek hücrelerinde salgılanan Baculovirus ifade vektörel çizimler oluşturmak için değiştirme
Summary
Burada, bitki salgılanan proteinler için protein kristalizasyon büyük miktarlarda üretmek için böcek hücre ve baculovirus protein ifade sistemi kullanan iletişim kurallarını mevcut. Bir baculovirus ifade vektör GP67 ya da böcek hemolin sinyal peptid bitki protein salgılanması ifade böcek hücrelerinde ile değiştirildi.
Abstract
Rekombinant salgı ökaryotik proteinler yapısal ve biyokimyasal araştırmalar ifade etmek bilim adamları için bir mücadele vardı. Böcek hücre baculovirus-aracılı ifade sistem rekombinant ökaryotik salgı proteinler bazı translasyonel modifikasyonlar ile ifade etmek için kullanılan sistemlerinden biridir. Salgı proteinler için protein glikozilasyon, disülfür bağları oluşumu ve diğer translasyonel modifikasyonlar salgı yollar aracılığıyla yönlendirilmesi gerekir. Varolan böcek hücre ifade salgı bitki proteinlerin artırmak için bir baculovirus ifade vektör ya bir GP67 eklenmesi ya da bir hemolin sinyal peptid sırası organizatörü ve çoklu klonlama siteleri arasında tarafından değiştirilir. Bu yeni tasarlanmış değiştirilmiş vektör sistemi başarıyla Arabidopsis thalianaçözünür rekombinant salgılanan bitki reseptör proteinler yüksek bir verim üretti. İki ifade bitki proteinleri, Arabidopsis TDR ve PRK3 plazma membran reseptörleri, ekstrasellüler etki x-ışını crystallographic çalışmalar için kristalize. Değiştirilmiş vektör sistemi salgı rekombinant proteinler de hayvan krallığının bir ifade için kullanılabilir gelişmiş bir araçtır.
Introduction
X-ışını crystallographic çalışmalar için özellikle Biyokimya ve biyofizik karakterizasyonu için homojen rekombinant proteinlerin büyük miktarlarda üretme yeteneğine sahip olması bir araştırma laboratuvarı için zorunludur. Escherichia coli, mantar, böcek hücreleri, memeli hücreleri, bitki hücreleri, vb aralarında gibi birçok tanınmış Contegra ifade sistemleri vardır, böcek hücre baculovirus-aracılı ifade sistem en çoğunlukla teknikleri yapısal olarak katlanmış büyük ölçekli rekombinant ökaryotik proteinler protein kristalizasyon1için büyük miktarlarda üretmek için kullanılır.
İfade vektörel çizimler baculovirus ifade sisteminin güçlü polyhedrin veya yüksek bir verim rekombinant proteinler hücre içi2,3üretmek için P10 organizatörü içerecek şekilde tasarlanmıştır. Rekombinant baculovirus yapmak için faiz gen Autographa californica multi-nucleopolyhedroviral genom polyhedrin (polh) odağı içeren bir böcek vektörü klonlanmış. Elde edilen yapı sonra sıralı ve onun doğru açık okuma çerçevesi (ORF) doğrulanır. Doğru yapı sonra transfection sürecinde ana bilgisayar böcek hücresine tanıttı. Gen ilgi viral Genom tarafından Homolog rekombinasyon eklenir. Bu olay rekombinant üretmek için hangi sonra çoğaltır virüs parçacıkları1budded rekombinant viral genom üretiminde sonuçlanır.
İfade sisteminde en sık kullanılan böcek hücreleri Sf9 ve yüksek beş (Hi5) hücrelerdir. Spodoptera frugiperda, pupa yumurtalık hücrelerinden elde edilen Sf21, klonal bir izole Sf9 hücrelerdir ve ebeveyn Trichoplusia ni yumurtalık hücre satırı TN-3684,5dan türetilmiş bir klonal izole Hi5 hücrelerdir. Hi5 hücreleri genellikle rekombinant proteinler6daha yüksek miktarlarda üretmek için seçili iken eş transfections, virüs amplifikasyon ve plak deneyleri Sf9 hücreleri üzerinde yapılmaktadır. Hi5 hücreleri mutasyona uğramış virüs üretmek için onların eğilimi nedeniyle üretimi ve virüs ettiklerinizden amplifikasyon için uygun değildir fazlalaştı. Geleneksel olarak, 25-30 ° C sıcaklık aralığı böcek hücreleri ekimi için iyi olarak kabul edilir. Ancak, 27-28 ° C en uygun sıcaklık böcek hücre büyüme ve enfeksiyon7,için8olduğu bildirilmiştir.
Giriş Gen önceki bir güçlü sinyal sırasında salgılanan proteinler yüksek ifade için gereklidir. Sinyal sıra verimli bir şekilde çevrilmiş Rekombinant protein endoplazmik retikulum protein salgılanması ve translasyonel modifikasyonlar uygun katlama ve sabitleme3için gerekli için deliklere. Protein GP64/67, bal arısı melittin ve diğerleri, baculovirus örtmek gibi sinyal peptid dizileri, baculovirus-aracılı ifade sistemleri3salgı rekombinant proteinlerin ifadesi kolaylaştırmak için seçildi. GP67 sinyal peptid getirilmesi ile karşılaştırıldığında içsel sinyal peptid hedef gen9kullanarak salgılanan bir Rekombinant protein, ifade verimini artırmak için gösterilmiştir. Hemolin bir bakteri enfeksiyonu10indüklenen dev ipek güve Hyalophora cecropia, hemolymph proteindir. İndüklenen ifade nispeten yüksek seviyede nedeniyle, gen sinyal peptid dizisi rekombinant proteinlerin salgılanmasını ifade baculovirus-böcek hücre sisteminde arabuluculuk için kullanılabilir.
A. thaliana Tracheary öğesi farklılaşma inhibitör faktör reseptör (TDR) ve polen reseptör kinaz her ikisi de proteinler11,12 bitki lösin yönünden zengin tekrar reseptör benzeri kinaz (LRR-RLK) ailesine ait 3 (PRK3) . Yapısı ve fonksiyonu, bu ailenin diğer bitki salgılanan proteinler yapısal ve biyokimyasal karakterizasyonu kolaylaştırmak için bitki reseptör protein, de eğitim için baculovirus-böcek hücre ifade sistem için değiştirildi protein verim kalitesi ve üretim geliştirmek. Ekstrasellüler etki alanları TDR ve PRK3 başarıyla baculovirus-böcek hücre ifade sisteminde iki değiştirilmiş ifade vektörel çizimler kullanarak ifade edilmiştir. Her iki ekstrasellüler etki alanı TDR ve PRK3 proteinlerin kristalize. Ya bir GP67 ya da hemolin sinyal dizisi düzenleyici ve birden çok klonlama arasında dahil ederek ifade ve arıtma rekombinant salgılanan bitki proteinleri iki değiştirilmiş baculovirus ifade vektörel çizimler ile büyük miktarda Bu makale raporları siteleri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çeşitlilik içinde büyüklük ve istikrar proteinlerin biyolojik sistemlerde mevcut binlerce göz önüne alındığında, bu kez bir araştırma için ampirik laboratuvar hangi Contegra ifade sistem karar vardır belirli bir protein ifade için seçilecek. E. coli ifade sistem kez up19ölçeklemek için ilk kısa yaşam döngüsü nedeniyle protein ifade bakterilerin düşük maliyetli Kültür Medya ve göreceli kolaylığı için seçimdir. Ancak, E. coli kullanarak 60 kDa …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Guozhou Xu için Kuzey Carolina Eyalet Üniversitesi yeni öğretim başlangıç fonlar tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Incubator shaker | VWR | Model Excella E25 | 27 oC |
| Incubator | VWR | Model 2005 | 27 oC |
| Centrifuge | BECKMAN | Model J-6 | with a swing bucket rotor |
| Herculase II Fusion DNA Polymerase | Agilent | 600677-51 | For PCR amplification of DNA |
| Thermal Cycler | BIO-RAD | Model C1000 Touch | For PCR amplification of DNA |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Model I 24 | For growing baceria culture |
| Customer DNA synthesis | GENSCRIPT | ||
| BamHI (HF) | New England Biolabs | R3136S | Restriction Endonuclease |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | Restriction Endonuclease |
| NotI (HF) | New England Biolabs | R3189S | Restriction Endonuclease |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Restriction Endonuclease |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202T | DNA ligation |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | DNA purification from Agorase gel |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid DNA purification from bacteria culture |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | 15510-019 | For DNA gel electropherosis |
| MAX Efficiency DH5α competen cell | Invitrogen | 18-258-012 | For transformation of DNA ligation mixture |
| Lennox L LB Broth | Research Product International Corp. | L24066-5000.0 | For making bacteria culture |
| Ampicillin sodium salt | Thermo Fisher Scientific | 11593-019 | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Thermo Fisher Scientific | 15160-054 | Antibiotics |
| Tetracycline | Thermo Fisher Scientific | 64-75-5 | Antibiotics |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710-064 | Antibiotics |
| MAX Efficiency DH10Bac competent cells | Thermo Fisher Scientific | 10361-012 | For making bacmid DNA |
| S.O.C. Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544-034 | For DNA transformation |
| CellFECTIN II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362-101 | Insect cell transfection reagent |
| Bac-to-Bac Expression System | Thermo Fisher Scientific | 10359-016 | Baculovirus-insect cells expression kit |
| Bluo-gal | Thermo Fisher Scientific | 15519-028 | For isolation of recominant Bacmid DNA |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | 15529-019 | For isolation of recominant Bacmid DNA |
| pFastBac1 | Thermo Fisher Scientific | 10360014 | Baculorirus expression vector |
| Sf9 cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 monolayer cells |
| Hi5 cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | High Five insect cells |
| Grace’s insect medium, unsupplemented | Thermo Fisher Scientific | 11595030 | Sf9 cell transfection minimum medium |
| Grace’s insect medium, supplemented | Thermo Fisher Scientific | 11605102 | Sf9 monolayer cell culture complete medium |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher Scientific | 10902104 | Sf9 suspension cell culture medium without FBS |
| Express Five SFM | Thermo Fisher Scientific | 10486025 | Hi5 cell culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 ml (10,000 I.U./ml) |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | 100 ml |
| FBS Certified | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | 500 ml |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 08-772-1B | Flat-bottom |
| 150 mm plates | Thermo Fisher Scientific | 353025 | 100/case |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 500 tubes/bag |
| 15 ml conical screw cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1475-0511 | 25 tubes/bag |
| 50 ml conical screw cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1500-1211 | 25 tubes/bag |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | NiNTA resin |
| pH-indicator strips | EMD Millipore Corporation | 1.09535.0001 | pH 0 – 14 |
Riferimenti
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnology Progress. 30, 1-18 (2014).
- Khan, S., Ng, M. L., Tan, Y. J. Expression of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 3a protein and the assembly of coronavirus-like particles in the baculovirus expression system. Methods in Molecular Biology. 379, 35-50 (2007).
- Possee, R. D., King, L. A. Baculovirus Transfer Vectors. Methods in Molecular Biology. 1350, 51-71 (2016).
- Vaughn, J. L., Goodwin, R. H., Tompkins, G. J., McCawley, P. The establishment of two cell lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae). In Vitro. 13, 213-217 (1977).
- Hink, W. F. Established insect cell line from the cabbage looper, Trichoplusia ni. Nature. 226, 466-467 (1970).
- Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cellular & Development Biology – Animal. 29A, 388-390 (1993).
- Wickham, T. J., Nemerow, G. R. Optimization of growth methods and recombinant protein production in BTI-Tn-5B1-4 insect cells using the baculovirus expression system. Biotechnology Progress. 9, 25-30 (1993).
- Davis, T. R., Trotter, K. M., Granados, R. R., Wood, H. A. Baculovirus expression of alkaline phosphatase as a reporter gene for evaluation of production, glycosylation and secretion. Nature Biotechnology. 10, 1148-1150 (1992).
- Murphy, C. I., et al. Enhanced expression, secretion, and large-scale purification of recombinant HIV-1 gp120 in insect cell using the baculovirus egt and p67 signal peptides. Protein Expression and Purification. 4, 349-357 (1993).
- Sun, S. C., Lindstrom, I., Boman, H. G., Faye, I., Schmidt, O. Hemolin: an insect-immune protein belonging to the immunoglobulin superfamily. Science. 250, 1729-1732 (1990).
- Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. Differential CLE peptide perception by plant receptors implicated from structural and functional analyses of TDIF-TDR interactions. PLoS One. 12, e0175317 (2017).
- Chakraborty, S., Pan, H., Tang, Q., Woolard, C., Xu, G. The Extracellular Domain of Pollen Receptor Kinase 3 is structurally similar to the SERK family of co-receptors. Scientific Reports. 8, 2796 (2018).
- Khorana, H. G. Total synthesis of a gene. Science. 203, 614-625 (1979).
- Bahl, C. P., Marians, K. J., Wu, R. A general method for inserting specific DNA sequences into cloning vehicles. Gene. 1, 81-92 (1976).
- Xu, W., Zhang, Y. Isolation and Characterization of Vaccine-Derived Polioviruses, Relevance for the Global Polio Eradication Initiative. Methods in Molecular Biology. 1387, 213-226 (2016).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166, 557-580 (1983).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Reddy, B. G., et al. Expression and purification of the alpha subunit of the epithelial sodium channel, ENaC. Protein Expression and Purification. 117, 67-75 (2016).
- Harris, T. J., Emtage, J. S. Expression of heterologous genes in E. coli. Microbiological Sciences. 3, 28-31 (1986).
- Kaur, J., Kumar, A., Kaur, J. Strategies for optimization of heterologous protein expression in E. coli: Roadblocks and reinforcements. International Journal of BIological Macromolecules. 106, 803-822 (2018).
- Guo, Y., Yang, F., Tang, X. An Overview of Protein Secretion in Yeast and Animal Cells. Methods in Molecular Biology. 1662, 1-17 (2017).
- Blight, M. A., Chervaux, C., Holland, I. B. Protein secretion pathway in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 5, 468-474 (1994).
- Idiris, A., Tohda, H., Kumagai, H., Takegawa, K. Engineering of protein secretion in yeast: strategies and impact on protein production. Applied Microbiology and Biotechnology. 86, 403-417 (2010).
- Wormald, M. R., Dwek, R. A. Glycoproteins: glycan presentation and protein-fold stability. Structure. 7, R155-R160 (1999).
- Geisler, C., Mabashi-Asazuma, H., Jarvis, D. L. An Overview and History of Glyco-Engineering in Insect Expression Systems. Methods in Molecular Biology. 1321, 131-152 (2015).
- Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. X-ray crystallographic studies of the extracellular domain of the first plant ATP receptor, DORN1, and the orthologous protein from Camelina sativa. Acta Crystallographica Section F: Structural BIology and Crystallization Communications. 72, 782-787 (2016).
- Aricescu, A. R., Owens, R. J. Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 23, 345-356 (2013).
- Reuter, L. J., Bailey, M. J., Joensuu, J. J., Ritala, A. Scale-up of hydrophobin-assisted recombinant protein production in tobacco BY-2 suspension cells. Plant Biotechnology Journal. 12, 402-410 (2014).
- Dohi, K., et al. Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured plant cells. Archives of Virology. 151, 1075-1084 (2006).
