JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetica

إنتاج الجينات الحذف في الإشريكيّة القولونية بتوصيل P1 مع أشرطة الكاسيت المهربة مقاومة المضادات الحيوية

Published: September 01, 2018
doi:
10.3791/58267
, ,
1Evolution and Genetics, Department of Biosciences,University of Oslo

Summary

وهنا يقدم بروتوكول لاستخدام الموجودة مسبقاً بنيات الحذف كاسيت مقاومة المضادات الحيوية كأساس لتحقيق طفرات الحذف في سلالات كولاي الأخرى. يمكن تعبئة هذه الطفرات الحذف وإدراجها في محور المقابلة من سلالة المستلم باستخدام توصيل عاثية P1.

Abstract

نهج أول دراسة مهمة الجينات غير معروف في البكتيريا خلق المغلوب هذا الجين. هنا، يمكننا وصف بروتوكول قوية وسريعة لنقل طفرات الجينات الحذف من سلالة الإشريكيّة القولونية واحد إلى آخر باستخدام توصيل المعمم مع عاثية P1. يتطلب هذا الأسلوب أن الطفرة تكون انتقائية (مثلاً، استناداً إلى اضطرابات الجينات باستخدام غرز كاسيت المضادات الحيوية). مثل هذه الأشرطة المضادات الحيوية يمكن تعبئتها من سلالة مانحة وأدخلت سلالة المستفيدة من تهم بسرعة وتوليد متحولة حذف جينات بسهولة. يمكن تصميم كاسيت المضادات الحيوية تشمل فلبس التعرف على المواقع التي تسمح بختان الإناث الكاسيت ريكومبيناسي الخاصة بالموقع لإنتاج المغلوب نظيفة مع تسلسل ندبة ~ 100-قاعدة-زوج-منذ فترة طويلة في الجينوم. إظهار البروتوكول بانقطاع الجين تاما الترميز عاملاً الجمعية المعنية في نشوء حيوي أوتوترانسبورتير، واختبار تأثير هذا المغلوب على نشوء حيوي ووظيفة هما أوتوترانسبورتير تريميريك أدهيسينس. على الرغم من حذف الجينات بتوصيل P1 قصوره، بسهولة وسرعة تنفيذه جعلها بديلاً جذاباً لأساليب أخرى لحذف الجينات.

Introduction

نهج أول مشترك لدراسة وظيفة الجين هو أداء الطفرات المغلوب ومراعاة النمط الظاهري الناتج عن ذلك. وهذا يسمى أيضا علم الوراثة العكسي. بكتيريا كولاي كانت العمود الفقري للبيولوجيا الجزيئية للسنوات السبعين الأخيرة، أو حتى، بسبب السهولة في استزراع وبه الانقياد للتلاعب بالجينات1. وقد وضعت عدة أساليب لإنتاج الجينات الحذف في كولاي، بما في ذلك علامة تبادل الطفرات2،3 ، وفي الآونة الأخيرة، ريكومبينيرينج باستخدام λ الأحمر أو ET راك نظم4،5 , 6.

في نظام مستخدمة على نطاق واسع، وتحل محلها متواليات ترميز الجينات الفردية كاسيت مقاومة للمضادات الحيوية التي يمكن فيما بعد أن اقتطعت من5،كروموسوم7. يتم استبدال تسلسل الترميز، على سبيل المثال بكاسيت مقاومة كاناميسين (أساسه)، الذي يحيط به فلبس (حزب العمل الفيجي) الاعتراف بالمواقع المستهدفة (معاهدة سجل الأفلام) على كلا جانبي. يتم التعرف على مواقع FRT قبل recombinase حزب العمل الفيجي، الذي يتوسط جزئ خاصة بالموقع بين المواقع FRT مما يؤدي إلى حذف الكاسيت كان. وبهذه الطريقة، يمكن تحقيق حذف كامل لتسلسل الجين المعطى للترميز، تاركين وراءهم تسلسل ندبة الحد أدنى فقط من حوالي 100 قاعدة أزواج (bp) (الشكل 1).

فقط على مدى عقد من الزمان، وقد وضعت ما يسمى مجموعة كيو. هذه هي مكتبة بكتيرية استناداً إلى أحد مختبرات قياسية السلالة K12 كولاي ، حيث تم حذفها تقريبا جميع الجينات غير الضرورية على حدة بواسطة λ جزئ الأحمر7،8. وقد استنساخ ضمن هذه المجموعة كل تسلسل ترميز واحد استبداله كاسيت مقاومة كان المهربة. جمع كيو ثبت أن تكون أداة مفيدة للعديد من التطبيقات9. واحد مثل هذا الطلب هو إنتاج طفرات الحذف في سلالات كولاي الأخرى. يمكن تعبئة الكاسيت كان من استنساخ حذف معين قبل عموما ترانسدوسينج باكتيريوفاجيس، مثل P110،،من1112،،من1314. ثم يمكن استخدام أسهم بالعاثية أعدت من سلالة من هذا القبيل لتصيب مستلم سلالة كولاي من الفائدة، حيث تردد منخفض ولكن موثوق بها كان المنطقة المحتوية على كاسيت يمكن إدراجها في جينوم المتلقي من جزئ مثلى (الشكل 2). يمكن تحديد ترانسدوكتانتس للنمو عن طريق الوسائط التي تحتوي على أساسه. وفي أعقاب ذلك، إذا كان المطلوب هو إزالة كاسيت المقاومة للمضادات الحيوية، يمكن توفيره recombinase حزب العمل الفيجي إلى سلالة ترانسدوكتانت في ترانس. بعد علاج بلازميد المحتوية على حزب العمل الفيجي، الذي يحمل علامة مقاومة الأمبيسلّين (أمبير)، يتم فحص الحيوانات المستنسخة أساسه ومراعية لامبير ل، والختان الصحيح لتسلسل البرية من نوع الترميز وكاسيت كان يتم التحقق من قبل مستعمرة [بكر].

هنا، يقدم بروتوكول مفصلاً، تصف كل خطوة من الخطوات في إنتاج المغلوب سلالة كولاي استناداً إلى الاستراتيجية المبينة أعلاه. على سبيل مثال، يظهر حذف من الجينات تاما . بترميز تاما بروتين بيتا لبرميل غشاء خارجي الذي هو جزء من النقل والجمعية الوحدة النمطية (TAM)، الذي تشترك في نشوء حيوي لبعض البروتينات أوتوترانسبورتير وبيلي15،،من1617. ثم استخدم هذه السلالة المغلوب لدراسة تأثير الحذف تاما على نشوء حيوي هما أوتوترانسبورتير تريميريك أدهيسينس (TAAs) وأدهيسين واليرسينيا يادا كولاي الغلوبولين المناعي (Ig)-ملزمة “ﻷعمالهم عيبد” 18،19.

Protocol

1-سلالات والبلازميدات السلالات البكتيرية استخدام سلالات BW25113 كولاي 5، JW4179 (BW25113 tamA::kan)7، BL21(DE3)20و BL21ΔABCF21. انظر الجدول للمواد للحصول على مزيد من المعلومات. باكتيريوفاجيس اس?…

Representative Results

جيل من تاما المغلوب من BL21ΔABCF: وقد استخدمت سابقا الاستراتيجية المبينة أعلاه لإنتاج سلالة مشتقة من BL21(DE3)، سلالة مختبر قياسية المستخدمة لإنتاج البروتين، وهو الأمثل لإنتاج البروتين الغشاء الخارجي ودعا BL21ΔABCF21. ويفتقر إلى أرب…

Discussion

توصيل P1 طريقة سريعة وقوية وموثوق بها لتوليد الجينات الحذف في كولاي. وهذا يتجلى هنا ترانسدوسينج متحولة حذف تاما من سلالة مانحة كيو إلى مستلم المستمدة من BL21. المراحل الرئيسية في عملية توصيل يتم إنتاج ترانسدوسينج ليستي، توصيل نفسها، وختان كاسيت المقاومة أساسه، والتحقق من المغلوب ب…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم الحصول على سلالات مجموعة كيو من المشروع بيوريسورسي الوطني (رجال، اليابان): كولاي. ونحن نشكر “ديرك لينكه” (قسم العلوم البيولوجية، جامعة أوسلو) على دعمه المستمر. تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحوث منحة النرويج الشباب الباحث 249793 (لجاك ليو جيم).

Materials

Strains
E. coli BW25113 NIG ME6092 Wild-type strain of Keio collection
E. coli BL21(DE3) Merck 69450-3 Expression strain
E. coli BL21DABCF Addgene 102270 Derived from BL21(DE3)
E. coli JW4179 NIG JW4179-KC tamA deletion mutant
P1 vir NIG HR16 Generally transducing bacteriophage
Plasmids
pCP20 CGSC 14177 conditionally replicating plasmid with FLP
pASK-IBA2 IBA GmbH 2-1301-000 expression vector
pEibD10 N/A N/A for production of EibD; plasmid available on request
pET22b+ Merck 69744-3 expression vector
pIBA2-YadA N/A N/A for production of YadA; plasmid available on request
Chemicals
Acetic acid ThermoFisher 33209
Agar BD Bacto 214010
Agarose Lonza 50004
Ampicillin Applichem A0839
Anhydrotetracycline Abcam ab145350
anti-collagen type I antibody COL-1 Sigma C2456
Bovine collagen type I Sigma C9791
Calcium chloride Merck 102382
Chloroform Merck 102445
Di-sodium hydrogen phosphate VWR 28029
DNA dye Thermo S33102
DNA molecular size marker New England BioLabs N3232S
DNase I Sigma DN25
dNTP mix New England Biolabs N0447
ECL HRP substrate Advansta K-12045
EDTA Applichem A2937
Glycerol VWR 24388
goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz sc-2005
goat anti-rabbit IgG-HRP Agrisera AS10668
HEPES VWR 30487
Isopropyl thiogalactoside VWR 43714
Kanamycin Applichem A1493
Lysozyme Applichem A4972
Magnesium chloride VWR 25108
Manganese chloride Sigma 221279
N-lauroyl sarcosine Sigma L9150
Skim milk powder Sigma 70166
Sodium chloride VWR 27808
tamA forward primer Invitrogen N/A Sequence 5'-GAAAAAAGGATATTCAGGAGAAAATGTG-3'
tamA reverse primer Invitrogen N/A Sequence 5'-TCATAATTCTGGCCCCAGACC-3'
Taq DNA polymerase New England Biolabs M0267
Tri-sodium citrate Merck 106448
Tryptone VWR 84610
Tween20 Sigma P1379
Yeast extract Merck 103753
Equipment
Agarose gel electrophoresis chamber Hoefer SUB13
Bead beater Thermo FP120A-115
CCD camera Kodak 4000R
Electroporation cuvettes Bio-Rad 165-2089
Electroporation unit Bio-Rad 1652100
Gel imager Nippon Genetics GP-03LED
Incubating shaker Infors HT Minitron
Incubator VWR 390-0482
Microcentrifuge Eppendorf 5415D
Microwave oven Samsung CM1099A
PCR machine Biometra Tpersonal
PCR strips Axygen PCR-0208-CP-C
pH meter Hanna Instruments HI2211-01
PVDF membrane ThermoFisher 88518
SDS-PAG electrophoresis chamber ThermoFisher A25977
Tabletop centrifuge Beckman Coulter B06322
Vortex mixer Scientific Industries SI-0236
Water bath GFL D3006
Wet transfer unit Hoefer TE22
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Blount, Z. D. The unexhausted potential of E. coli. eLife. 4, e05826 (2015).
  2. Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-4622 (1989).
  3. Link, A. J., Phillips, D., Church, G. M. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization. Journal of Bacteriology. 179 (20), 6228-6237 (1997).
  4. Sawitzke, J. A., Thomason, L. C., Costantino, N., Bubunenko, M., Datta, S., Court, D. L. Recombineering: in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond. Methods in Enzymology. 421, 171-199 (2007).
  5. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  6. Muyrers, J. P., Zhang, Y., Stewart, A. F. Techniques: Recombinogenic engineering–new options for cloning and manipulating DNA. Trends in Biochemical Sciences. 26 (5), 325-331 (2001).
  7. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
  8. Yamamoto, N., et al. Update on the Keio collection of Escherichia coli single-gene deletion mutants. Molecular Systems Biology. 5, 335 (2009).
  9. Baba, T., Huan, H. -. C., Datsenko, K., Wanner, B. L., Mori, H. The applications of systematic in-frame, single-gene knockout mutant collection of Escherichia coli K-12. Methods in Molecular Biology. 416, 183-194 (2008).
  10. Chattopadhyay, M. K., Tabor, C. W., Tabor, H. Polyamines are not required for aerobic growth of Escherichia coli: preparation of a strain with deletions in all of the genes for polyamine biosynthesis. Journal of Bacteriology. 191 (17), 5549-5552 (2009).
  11. Xie, X., Wong, W. W., Tang, Y. Improving simvastatin bioconversion in Escherichia coli by deletion of bioH. Metabolic Engineering. 9 (4), 379-386 (2007).
  12. Maeda, T., Sanchez-Torres, V., Wood, T. K. Escherichia coli hydrogenase 3 is a reversible enzyme possessing hydrogen uptake and synthesis activities. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (5), 1035-1042 (2007).
  13. Meehan, B. M., Landeta, C., Boyd, D., Beckwith, J. The disulfide bond formation pathway is essential for anaerobic growth of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 199 (16), (2017).
  14. Niba, E. T. E., Naka, Y., Nagase, M., Mori, H., Kitakawa, M. A genome-wide approach to identify the genes involved in biofilm formation in E. coli. DNA Research. 14 (6), 237-246 (2008).
  15. Heinz, E., et al. Conserved features in the structure, mechanism, and biogenesis of the inverse autotransporter protein family. Genome Biology and Evolution. 8 (6), 1690-1705 (2016).
  16. Selkrig, J., et al. Discovery of an archetypal protein transport system in bacterial outer membranes. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (5), 506-510 (2012).
  17. Stubenrauch, C., et al. Effective assembly of fimbriae in Escherichia coli depends on the translocation assembly module nanomachine. Nature Microbiology. 1 (7), 16064 (2016).
  18. Leo, J. C., Goldman, A. The immunoglobulin-binding Eib proteins from Escherichia coli are receptors for IgG Fc. Molecular Immunology. 46 (8-9), 1860-1866 (2009).
  19. Mühlenkamp, M., Oberhettinger, P., Leo, J. C., Linke, D., Schütz, M. S. Yersinia adhesin A (YadA) – Beauty & beast. International Journal of Medical Microbiology. 305 (2), 252-258 (2015).
  20. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
  21. Meuskens, I., Michalik, M., Chauhan, N., Linke, D., Leo, J. C. A new strain collection for improved expression of outer membrane proteins. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 464 (2017).
  22. Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).
  23. Grosskinsky, U., et al. A conserved glycine residue of trimeric autotransporter domains plays a key role in Yersinia adhesin A autotransport. Journal of Bacteriology. 189 (24), 9011-9019 (2007).
  24. Leo, J. C., et al. The structure of E. coli IgG-binding protein D suggests a general model for bending and binding in trimeric autotransporter adhesins. Structure. 19 (7), 1021-1030 (1993).
  25. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).
  26. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
  27. Leo, J. C., Oberhettinger, P., Linke, D. Assessing the outer membrane insertion and folding of multimeric transmembrane β-barrel proteins. Methods in Molecular Biology. , 157-167 (2015).
  28. Mikula, K. M., Leo, J. C., Łyskowski, A., Kedracka-Krok, S., Pirog, A., Goldman, A. The translocation domain in trimeric autotransporter adhesins is necessary and sufficient for trimerization and autotransportation. Journal of Bacteriology. 194 (4), 827-838 (2012).
  29. Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L., Ausubel, F. M. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. , (2007).
  30. Franklin, N. C. Mutation in gal U gene of E. coli blocks phage P1 infection. Virology. 38 (1), 189-191 (1969).
  31. Jeong, H., et al. Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3). Journal of Molecular Biology. 394 (4), 644-652 (2009).
  32. Greene, E. C. DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination. Journal of Biological Chemistry. 291 (22), 11572-11580 (2016).
  33. Watt, V. M., Ingles, C. J., Urdea, M. S., Rutter, W. J. Homology requirements for recombination in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (14), 4768-4772 (1985).
  34. Ho, T. D., Waldor, M. K. Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 gal mutants are sensitive to bacteriophage P1 and defective in intestinal colonization. Infection and Immunity. 75 (4), 1661-1666 (2006).
  35. Ikeda, H., Tomizawa, J. I. Transducing fragments in generalized transduction by phage P1. I. Molecular origin of the fragments. Journal of Molecular Biology. 14 (1), 85-109 (1965).
  36. Murooka, Y., Harada, T. Expansion of the host range of coliphage P1 and gene transfer from enteric bacteria to other Gam-negative bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 38 (4), 754-757 (1979).
  37. Goldberg, R. B., Bender, R. A., Streicher, S. L. Direct selection for P1-sensitive mutants of enteric bacteria. Journal of Bacteriology. 118 (3), 810-814 (1974).
  38. O’Connor, K. A., Zusman, D. R. Coliphage P1-mediated transduction of cloned DNA from Escherichia coli to Myxococcus xanthus: use for complementation and recombinational analyses. Journal of Bacteriology. 155 (1), 317-329 (1983).

Tags

P1 TransductionGene DeletionEscherichia ColiAntibiotic Resistance CassetteKnockout MutantPhageBacterial CultureLysogeny BrothCentrifugationChloroformSodium Citrate

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Saragliadis, A., Trunk, T., Leo, J. C. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (139), e58267, doi:10.3791/58267 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image