Производство гена удалений в Escherichia coli , P1 трансдукция с подакцизных антибиотикорезистентности кассеты
Summary
Здесь мы представляем собой протокол для использования уже существующих антибиотикам сопротивление кассета удаления конструкции как основу для принятия удаления мутантов в других штаммов E. coli . Такие перегласовки удаления могут быть мобилизованы и вставлен в соответствующий Локус штамм получателей с помощью P1 бактериофага трансдукции.
Abstract
Первый подход для изучения функции неизвестных генов бактерий является создание плей офф этого гена. Здесь мы описываем надежный и быстрый протокол для передачи мутации гена удаления из одного штамма кишечной палочки в другой с помощью обобщенного трансдукции бактериофага P1. Этот метод требует, чтобы мутация выбора (например, на основе гена сбоев с помощью антибиотиков кассеты вставок). Таких антибиотиков кассеты могут быть мобилизованы из штамма доноров и введена в получателей штамм интерес к быстро и легко создавать ген мутанта удаления. Антибиотик кассеты могут быть разработаны включить Флиппазы признание сайты, которые позволяют иссечение кассеты по участкам рекомбиназа производить чистую нокаут с только ~ 100-base пара длинный шрам последовательности генома. Мы продемонстрировать протокола путем стучать вне Джин Тама , кодирования фактор Ассамблеи, занимающихся биогенеза autotransporter и проверить эффект от этого плей офф на биогенеза и функции двух адгезины trimeric autotransporter. Хотя гена удаления трансдукции P1 имеет свои ограничения, легкость и скорость ее реализации сделать его привлекательной альтернативой для других методов удаления ген.
Introduction
Первый общий подход для изучения функции гена — для выполнения нокаут-мутагенеза и наблюдать результате фенотип. Это также называется обратной генетики. Бактерия E. coli была рабочая лошадка молекулярной биологии за последние 70 лет или так, благодаря простоте его культивирования и его ответственностью генетические манипуляции1. Несколько методов были разработаны производить Джин удалений в E. coli, включая маркер обмен мутагенеза2,3 и, совсем недавно, recombineering, используя λ красный или Rac ET систем4,5 , 6.
В широко используется система кодирования последовательностей отдельных генов заменяются антибиотикорезистентности кассету, которая позже может быть подакцизным хромосома5,7. Кодирования последовательности заменяются, например кассета сопротивления канамицин (Кан), который окружен Флиппазы (FLP) признание целевой (ФРТ) сайты с обеих сторон. FRT сайты признаны рекомбиназа ФЛП, которая опосредует участкам рекомбинация между сайтами ФРТ, ведущих к удаления кассеты Кан. Таким образом может быть достигнуто полное удаление данного гена кодирующая последовательность, оставив только минимальный шрам последовательность приблизительно 100 пар оснований (ВР) (рис. 1).
Чуть более десяти лет назад так называемый Keio коллекция была разработана. Это бактериальный Библиотека, на базе стандартного лаборатории штамм E. coli K12, где почти все несущественные гены индивидуально были удалены λ красный рекомбинации7,8. Клоны в этой коллекции имеют один кодирующая последовательность, заменены подакцизных кассеты сопротивления Кан. Коллекции Keio оказалась полезным инструментом для многих приложений9. Одним из таких приложений является производство удаления мутантов в других штаммов E. coli . Кан кассету с клон данного исключения могут быть мобилизованы путем обычно преобразователя бактериофагов, таких как P110,11,12,,1314. Фаговые складе, подготовленных от такого напряжения может затем использоваться для заразить получателя штамм E. coli интерес, где с частотой низкий, но надежный Кан кассеты содержащих региона могут быть включены в геноме получателя, гомологичная рекомбинация (Рисунок 2). Transductants могут быть выбраны для роста на Кан содержащих носителе. После этого если удаление антибиотикорезистентности кассеты, ФЛП рекомбиназа могут поставляться штамм transductant в транс. После отверждения ФЛП содержащих плазмида, который носит маркер сопротивления ампициллин (Amp), Кан и Amp чувствительных клоны проверяются для, и правильный иссечение одичал тип кодирования последовательности и кассеты с Кан проверяются колонии PCR.
Здесь представлен подробный протокол, описывающих каждый из этапов в производстве нокаут-штамм E. coli , основанный на изложенной выше стратегии. В качестве примера показано удаление Джин Тама . Тама кодирует белок β-баррель внешней мембраны, который является частью транспорта и сборки модуля (TAM), который участвует в биогенеза некоторых белков autotransporter и пили15,16,17. Этот штамм нокаут-затем был использован для изучения эффекта удаления Тама биогенеза два trimeric autotransporter адгезинов (ТААС), Yersinia адгезина яда и иммуноглобулина E. coli (Ig)-привязка ТАА EibD 18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Трансдукция P1 является быстрый, надежный и надежный метод для генерации гена удалений в E. coli. Здесь это подтверждается преобразователя Тама удаления мутант из штамма доноров Keio BL21-производные получателю. Основные этапы в процессе трансдукции являются производство преобразо?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Кэйо коллекции штаммов были получены от национального проекта Биоресурс (Ниг, Япония): E. coli. Мы благодарим Дирк Линке (Департамент Biosciences, Университет Осло) за его неизменную поддержку. Эта работа финансировалась исследовательским советом Норвегии молодой исследователь Грант 249793 (Jack C. Leo).
Materials
| Strains | |||
| E. coli BW25113 | NIG | ME6092 | Wild-type strain of Keio collection |
| E. coli BL21(DE3) | Merck | 69450-3 | Expression strain |
| E. coli BL21DABCF | Addgene | 102270 | Derived from BL21(DE3) |
| E. coli JW4179 | NIG | JW4179-KC | tamA deletion mutant |
| P1 vir | NIG | HR16 | Generally transducing bacteriophage |
| Plasmids | |||
| pCP20 | CGSC | 14177 | conditionally replicating plasmid with FLP |
| pASK-IBA2 | IBA GmbH | 2-1301-000 | expression vector |
| pEibD10 | N/A | N/A | for production of EibD; plasmid available on request |
| pET22b+ | Merck | 69744-3 | expression vector |
| pIBA2-YadA | N/A | N/A | for production of YadA; plasmid available on request |
| Chemicals | |||
| Acetic acid | ThermoFisher | 33209 | |
| Agar | BD Bacto | 214010 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Ampicillin | Applichem | A0839 | |
| Anhydrotetracycline | Abcam | ab145350 | |
| anti-collagen type I antibody COL-1 | Sigma | C2456 | |
| Bovine collagen type I | Sigma | C9791 | |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | |
| Chloroform | Merck | 102445 | |
| Di-sodium hydrogen phosphate | VWR | 28029 | |
| DNA dye | Thermo | S33102 | |
| DNA molecular size marker | New England BioLabs | N3232S | |
| DNase I | Sigma | DN25 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| ECL HRP substrate | Advansta | K-12045 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycerol | VWR | 24388 | |
| goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
| goat anti-rabbit IgG-HRP | Agrisera | AS10668 | |
| HEPES | VWR | 30487 | |
| Isopropyl thiogalactoside | VWR | 43714 | |
| Kanamycin | Applichem | A1493 | |
| Lysozyme | Applichem | A4972 | |
| Magnesium chloride | VWR | 25108 | |
| Manganese chloride | Sigma | 221279 | |
| N-lauroyl sarcosine | Sigma | L9150 | |
| Skim milk powder | Sigma | 70166 | |
| Sodium chloride | VWR | 27808 | |
| tamA forward primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-GAAAAAAGGATATTCAGGAGAAAATGTG-3' |
| tamA reverse primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-TCATAATTCTGGCCCCAGACC-3' |
| Taq DNA polymerase | New England Biolabs | M0267 | |
| Tri-sodium citrate | Merck | 106448 | |
| Tryptone | VWR | 84610 | |
| Tween20 | Sigma | P1379 | |
| Yeast extract | Merck | 103753 | |
| Equipment | |||
| Agarose gel electrophoresis chamber | Hoefer | SUB13 | |
| Bead beater | Thermo | FP120A-115 | |
| CCD camera | Kodak | 4000R | |
| Electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2089 | |
| Electroporation unit | Bio-Rad | 1652100 | |
| Gel imager | Nippon Genetics | GP-03LED | |
| Incubating shaker | Infors HT | Minitron | |
| Incubator | VWR | 390-0482 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microwave oven | Samsung | CM1099A | |
| PCR machine | Biometra | Tpersonal | |
| PCR strips | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
| pH meter | Hanna Instruments | HI2211-01 | |
| PVDF membrane | ThermoFisher | 88518 | |
| SDS-PAG electrophoresis chamber | ThermoFisher | A25977 | |
| Tabletop centrifuge | Beckman Coulter | B06322 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Water bath | GFL | D3006 | |
| Wet transfer unit | Hoefer | TE22 |
Riferimenti
- Blount, Z. D. The unexhausted potential of E. coli. eLife. 4, e05826 (2015).
- Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-4622 (1989).
- Link, A. J., Phillips, D., Church, G. M. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization. Journal of Bacteriology. 179 (20), 6228-6237 (1997).
- Sawitzke, J. A., Thomason, L. C., Costantino, N., Bubunenko, M., Datta, S., Court, D. L. Recombineering: in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond. Methods in Enzymology. 421, 171-199 (2007).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Muyrers, J. P., Zhang, Y., Stewart, A. F. Techniques: Recombinogenic engineering–new options for cloning and manipulating DNA. Trends in Biochemical Sciences. 26 (5), 325-331 (2001).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
- Yamamoto, N., et al. Update on the Keio collection of Escherichia coli single-gene deletion mutants. Molecular Systems Biology. 5, 335 (2009).
- Baba, T., Huan, H. -. C., Datsenko, K., Wanner, B. L., Mori, H. The applications of systematic in-frame, single-gene knockout mutant collection of Escherichia coli K-12. Methods in Molecular Biology. 416, 183-194 (2008).
- Chattopadhyay, M. K., Tabor, C. W., Tabor, H. Polyamines are not required for aerobic growth of Escherichia coli: preparation of a strain with deletions in all of the genes for polyamine biosynthesis. Journal of Bacteriology. 191 (17), 5549-5552 (2009).
- Xie, X., Wong, W. W., Tang, Y. Improving simvastatin bioconversion in Escherichia coli by deletion of bioH. Metabolic Engineering. 9 (4), 379-386 (2007).
- Maeda, T., Sanchez-Torres, V., Wood, T. K. Escherichia coli hydrogenase 3 is a reversible enzyme possessing hydrogen uptake and synthesis activities. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (5), 1035-1042 (2007).
- Meehan, B. M., Landeta, C., Boyd, D., Beckwith, J. The disulfide bond formation pathway is essential for anaerobic growth of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 199 (16), (2017).
- Niba, E. T. E., Naka, Y., Nagase, M., Mori, H., Kitakawa, M. A genome-wide approach to identify the genes involved in biofilm formation in E. coli. DNA Research. 14 (6), 237-246 (2008).
- Heinz, E., et al. Conserved features in the structure, mechanism, and biogenesis of the inverse autotransporter protein family. Genome Biology and Evolution. 8 (6), 1690-1705 (2016).
- Selkrig, J., et al. Discovery of an archetypal protein transport system in bacterial outer membranes. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (5), 506-510 (2012).
- Stubenrauch, C., et al. Effective assembly of fimbriae in Escherichia coli depends on the translocation assembly module nanomachine. Nature Microbiology. 1 (7), 16064 (2016).
- Leo, J. C., Goldman, A. The immunoglobulin-binding Eib proteins from Escherichia coli are receptors for IgG Fc. Molecular Immunology. 46 (8-9), 1860-1866 (2009).
- Mühlenkamp, M., Oberhettinger, P., Leo, J. C., Linke, D., Schütz, M. S. Yersinia adhesin A (YadA) – Beauty & beast. International Journal of Medical Microbiology. 305 (2), 252-258 (2015).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
- Meuskens, I., Michalik, M., Chauhan, N., Linke, D., Leo, J. C. A new strain collection for improved expression of outer membrane proteins. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 464 (2017).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).
- Grosskinsky, U., et al. A conserved glycine residue of trimeric autotransporter domains plays a key role in Yersinia adhesin A autotransport. Journal of Bacteriology. 189 (24), 9011-9019 (2007).
- Leo, J. C., et al. The structure of E. coli IgG-binding protein D suggests a general model for bending and binding in trimeric autotransporter adhesins. Structure. 19 (7), 1021-1030 (1993).
- Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
- Leo, J. C., Oberhettinger, P., Linke, D. Assessing the outer membrane insertion and folding of multimeric transmembrane β-barrel proteins. Methods in Molecular Biology. , 157-167 (2015).
- Mikula, K. M., Leo, J. C., Łyskowski, A., Kedracka-Krok, S., Pirog, A., Goldman, A. The translocation domain in trimeric autotransporter adhesins is necessary and sufficient for trimerization and autotransportation. Journal of Bacteriology. 194 (4), 827-838 (2012).
- Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L., Ausubel, F. M. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. , (2007).
- Franklin, N. C. Mutation in gal U gene of E. coli blocks phage P1 infection. Virology. 38 (1), 189-191 (1969).
- Jeong, H., et al. Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3). Journal of Molecular Biology. 394 (4), 644-652 (2009).
- Greene, E. C. DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination. Journal of Biological Chemistry. 291 (22), 11572-11580 (2016).
- Watt, V. M., Ingles, C. J., Urdea, M. S., Rutter, W. J. Homology requirements for recombination in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (14), 4768-4772 (1985).
- Ho, T. D., Waldor, M. K. Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 gal mutants are sensitive to bacteriophage P1 and defective in intestinal colonization. Infection and Immunity. 75 (4), 1661-1666 (2006).
- Ikeda, H., Tomizawa, J. I. Transducing fragments in generalized transduction by phage P1. I. Molecular origin of the fragments. Journal of Molecular Biology. 14 (1), 85-109 (1965).
- Murooka, Y., Harada, T. Expansion of the host range of coliphage P1 and gene transfer from enteric bacteria to other Gam-negative bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 38 (4), 754-757 (1979).
- Goldberg, R. B., Bender, R. A., Streicher, S. L. Direct selection for P1-sensitive mutants of enteric bacteria. Journal of Bacteriology. 118 (3), 810-814 (1974).
- O’Connor, K. A., Zusman, D. R. Coliphage P1-mediated transduction of cloned DNA from Escherichia coli to Myxococcus xanthus: use for complementation and recombinational analyses. Journal of Bacteriology. 155 (1), 317-329 (1983).
