Engineering-Transplantation geeignet retinalen Pigment Epithel Gewebe abgeleitet aus humanen embryonalen Stammzellen
Summary
Wir beschreiben eine Methode um eine netzhautgewebe bestehend aus retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gezüchtet auf menschliche amniotic Membranen und deren Vorbereitung für die Verpflanzung in Tiermodellen zu konstruieren.
Abstract
Mehreren pathologische Zuständen des Auges beeinträchtigen die Funktionalität bzw. das Überleben des retinalen Pigmentepithels (RPE). Dazu gehören einige Formen der Retinitis Pigmentosa (RP) und Altersbedingte Makula-Degeneration (AMD). Zelltherapie ist eines der vielversprechendsten therapeutischen Strategien vorgeschlagen, diese Krankheiten bereits ermutigende Zwischenstand beim Menschen zu heilen. Die Methode der Zubereitung des Transplantats hat jedoch erhebliche Auswirkungen auf die funktionellen Ergebnisse in Vivo. RPE-Zellen als eine Zellsuspension gepfropft sind nämlich weniger funktional als die gleichen Zellen als eine netzhautgewebe transplantiert. Hier beschreiben wir eine einfache und reproduzierbare Methode, Ingenieur RPE Gewebe und deren Vorbereitung für eine Implantation in Vivo . RPE Zellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen sind auf eine biologische Unterstützung, die menschlichen amniotic Membrane (Schinken) ausgesät. Im Vergleich zu künstlichen Gerüste, hat diese Unterstützung den Vorteil, dass eine Basalmembran, die in der Nähe der Bruch-Membran ist wo endogene RPE-Zellen verbunden sind. Jedoch seine Manipulation ist nicht einfach, und wir mehrere Strategien für seine ordnungsgemäße Kultivierung und Vorbereitung für die Verpflanzung in Vivoentwickelt.
Introduction
RPE ist entscheidend für das Überleben und die Homöostase der Photorezeptoren mit denen sie eng verbunden1ist. Verschiedene pathologische Zustände verändern seine Funktionalität und/oder überleben, darunter RP und AMD.
RP ist eine Gruppe von geerbten monogenen Mutationen, die die Funktionen der Photorezeptoren oder RPE-Zellen oder beide2,3betreffen. Es wird geschätzt, dass Mutationen, die betreffen speziell die RPE Zellen machen 5 % der RP2. AMD ist eine weitere Bedingung wo die RPE-Schicht verändert ist, führende letztlich zu zentralen Sehverlust. AMD wird durch das komplexe Zusammenspiel von genetischen und umweltbedingten Faktoren verursacht und wirkt sich auf die ältere4,5,6. Prognosen zufolge wird AMD eine Sorge um 196 Millionen Patienten weltweit durch 20207sein. Bei diesen Erkrankungen keine wirksame Heilung gibt, und eine der vorgeschlagenen Strategien ist die Transplantation von neuen RPE-Zellen um Toten/nicht funktionsfähige vorbestehenden RPE Zellen8zu kompensieren.
Die Formulierung des Endproduktes, veredelt werden ist wichtig, um die besten funktionellen Ergebnisse sicherzustellen. RPE-Zellen als eine Zellsuspension, trotz des Seins eine einfach Art der Lieferung, injiziert Bedenken bezüglich deren Überleben, Integration und Funktionalität9,10,11,12 , 13. Wissenschaftler entwickeln jetzt mehr komplexe Rezepturen liefern entwickelt netzhautgewebe9,13,14,15,16. In diesem Zusammenhang entwickelten wir eine originelle Methode zur in-vitro- RPE Gewebe zu generieren, die für die Transplantation9verwendet werden könnten.
RPE zellbanken abgeleitet von menschlichen embryonalen Stammzellen (ES) sind in diesem Protokoll verwendet. Jedoch Alternative RPE Zellen Banken aus verschiedenen Zelle Quellen (Human-induzierte pluripotente Stammzellen, primäre RPE-Zellen usw.)und differenziert mit einer anderen Methode eignen sich auch für dieses Protokoll. Freuen Sie sich auf gezielte Differenzierung Protokolle mit Zytokinen und/oder kleine Moleküle17,18,19,20,21,22.
Um transplantiert werden, sollte das technische Gewebe auf einem Gerüst vorbereitet werden. In den letzten Jahren wurden verschiedene Gerüste basierend auf ein Polymer oder eine Matrix von biologischen Ursprungs13,23,24entwickelt. Hier, die biologische Substrat verwendet ist der Schinken, aber andere Substrate wie entblößt Bruch Membranen umgesetzt werden könnte. Die hier beschriebene Methode hat den Vorteil der Verwendung einer biologischen Gerüst, das für die RPE nativen Umgebung relevant ist.
Menschlichen ES Zellen gewonnenen RPE-Zellen sind für mindestens 4 Wochen kultiviert, um voll und ganz als ein Kopfsteinpflaster Monolage organisiert werden. In diesem Stadium das Epithel erhalten ist funktional und9polarisiert. Da dieses Gewebe leicht Falten, wird sie schließlich in einer dünnen Schicht aus einem Hydrogel-Träger, mehr Steifigkeit und Elastizität zu geben und zu schützen während der Injektion eingebettet. Dieses Produkt wird dann bei 4 ° C bis Pfropfung gespeichert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschrieb eine Methode für die Kultur der RPE-Zellen auf eine biologische Gerüst und deren Vorbereitung für die Implantation in Tiermodellen. Einer der kritischen Schritte des Protokolls ist die Wartung der Orientierung des Schinkens entlang des Verfahrens bis zu seiner Aufnahme in Gelatine. In der Tat, das native Epithel der Membran entfernt, und die Basalmembran wird ausgesetzt9. Die RPE-Zellen müssen auf diese Basalmembran ausgesät werden. Bei der Vorbereitung für die Einbettung von G…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Jérôme Larghero und Valérie Vanneaux (Hôpital Saint Louis, Paris, Frankreich) während der Einrichtung des hier beschriebenen Verfahrens für ihre Beiträge danken.
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem ANR [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], der Fondation Pour la Recherche Médicale [Bioengineering Programm – DBS20140930777] und von LABEX WIEDERZUBELEBEN [ANR-10-LABX-73] Olivier Goureau und Christelle Monville. Es wurde von NeurATRIS, eine translationale Forschungsinfrastruktur (Investissements Avenir) für Biotherapies in Neurowissenschaften [ANR-11-INBS-0011] und INGESTEM, die nationale Infrastruktur (Investissements Avenir) engineering für pluripotente unterstützt und differenzierten Stammzellen [ANR-11-INBS-000], Christelle Monville. Karim Ben M’Barek wurde durch Stipendien aus DIM Stempole und LABEX WIEDERZUBELEBEN [ANR-10-LABX-73] unterstützt. -Stem ist Teil des Instituts für seltene Krankheiten, die von der Association Française Contre Les Myopathien (AFM) unterstützt Biotherapies-Téléthon.
Materials
| Sterile biosafety cabinet | TechGen International | Not applicable | |
| Liquid waste disposal system for aspiration | Vacuubrand | BVC 21 | |
| CO2-controlled +37 °C cell incubator | Thermo Electron Corporation | BVC 21 NT | |
| 200 µL pipette: P200 | Gilson | F144565 | |
| 1 mL pipette: P1000 | Gilson | F144566 | |
| Pipet aid | Drummond | 75001 | |
| +4 °C refrigerator | Liebherr | Not applicable | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fine scissors | WPI | 501758 | |
| Forceps (x2) | WPI | 555227F | |
| Water bath | Grant subaqua pro | SUB6 | |
| Precision balance | Sartorius | CP225D | |
| Centrifuge | Eppendorff | 5804 | |
| Microscope | Olympus | SC30 | |
| Horizontal Rocking Shaker | IKA-WERKE | IKA MTS 214D | |
| Vortex | VWR | LAB DANCER S40 | |
| Disposable Scalpel | WPI | 500351 | |
| plastic paraffin film | VWR | PM992 | |
| 0.200 µm single use syringe filter | SARTORIUS | 16532 | |
| Syringe without needle 50 mL | Dutscher | 50012 | |
| Bottles 250mL | Dutscher | 28024 | |
| 15 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352097 | |
| 50 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352098 | |
| culture insert | Scaffdex | C00001N | |
| 60 mm cell culture disches: B6 | Dutscher | 353004 | |
| 12 well cell culture plate | Corning | 3512 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3506 | |
| Razor blades | Ted Pella, Inc | 121-9 | |
| Cyanoacrylate glue | Castorama | 3178040670105 | |
| PBS 1X (500 mL) | Sigma | D8537 | |
| Thermolysine | Roche | 5339880001 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965-026 | |
| KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) | Invitrogen | 12618-013 | |
| MEM-NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-035 | |
| b-mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| CO2-independent medium | GIBCO | 18045-054 | |
| Gelatin | MERCK | 104078 | |
| human amniotic membrane | Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) | Not applicable |
Riferimenti
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