هندسة الأنسجة ظهارة صباغ الشبكية زرع مناسبة المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية
Summary
يصف لنا طريقة لمهندس نسيج شبكية تتكون من الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية المستمدة من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية المستزرعة على رأس أغشية السلي البشرية وإعدادها للتطعيم في نماذج حيوانية.
Abstract
العديد من الحالات المرضية للعين يؤثر على الأداء الوظيفي و/أو بقاء ظهارة صباغ الشبكية (RPE). وتشمل هذه بعض أشكال التهاب الشبكية الصباغي (RP) والمتعلقة بالعمر البقعي (AMD). خلية العلاج واحدة من الاستراتيجيات العلاجية الواعدة المقترحة لعلاج هذه الأمراض، مع تشجيع الفعل النتائج الأولية في البشر. ومع ذلك، طريقة إعداد الاختلاس أثرا كبيرا على أن النتائج الفنية فيفو. والواقع أن الخلايا RPE المطعمة كتعليق خلية وظيفية أقل من نفس الخلايا التي زرعها كنسيج شبكية. هنا، نحن تصف طريقة بسيطة واستنساخه لمهندس RPE الأنسجة وإعداده لغرس في فيفو . هي المصنف RPE الخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية pluripotent على دعم بيولوجية، الغشاء الذي يحيط بالجنين البشري (لحم الخنزير). بالمقارنة مع السقالات مصطنعة، هذا الدعم له ميزة وجود غشاء الطابق السفلي الذي يقع بالقرب من غشاء بروخ حيث يتم إرفاق الذاتية RPE الخلايا. ومع ذلك، ليس من السهل التلاعب بها، ووضعنا عدة استراتيجيات لاستزراع المناسبة لها، والتحضير لتطعيم فيفو.
Introduction
RPE أمر حاسم للبقاء على قيد الحياة والتوازن من photoreceptors التي كان من أحكام المرتبطة بها1. تغيير الظروف المرضية عدة وظائف و/أو البقاء على قيد الحياة، بما في ذلك البرنامج العادي وأية أم دي.
RP هي مجموعة من الطفرات monogenic الموروثة التي تؤثر على وظائف خلايا RPE أو فوتوريسيبتورس أو كلاهما2،3. ومن المقدر أن الطفرات التي تؤثر على وجه التحديد RPE الخلايا 5 في المائة من البرنامج العادي2. أية أم دي شرط آخر حيث يتم تبديل طبقة RPE، فقدان الرؤية في نهاية المطاف إلى المركزية الرائدة. أية أم دي سببه التفاعلات المعقدة بين العوامل الوراثية والبيئية ويؤثر على المسنين4،،من56. ووفقا للتوقعات، ستكون أية أم دي مصدر قلق للمرضى 196 مليون في العالم بحلول عام 20207. لهذه الاضطرابات، يوجد لا يوجد علاج فعال، وواحدة من الاستراتيجيات المقترحة هو زرع خلايا RPE جديدة بغية التعويض عن الخلايا RPE الموجودة مسبقاً لا يعمل الميت/8.
وضع صياغة للمنتج النهائي تكون المطعمة ضروري لضمان أفضل النتائج الفنية. الخلايا RPE حقن كتعليق خلية، على الرغم من كونها طريقة سهلة ومباشرة للتسليم، تثير مخاوف بشأن البقاء على قيد الحياة، والتكامل، ووظائف9،10،،من1112 , 13-العلماء حاليا بتطوير أكثر الصيغ المعقدة لتسليم المهندسة نسيج الشبكية9،،من1314،،من1516. وفي هذا السياق، قمنا بتطوير أسلوب الأصلي لتوليد في المختبر الأنسجة RPE التي يمكن أن تستخدم لزرع9.
وتستخدم المصارف خلية RPE المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ES) في هذا البروتوكول. إلا أن الخلية بديل RPE المصارف من مصادر مختلفة من الخلية (الخلايا الجذعية pluripotent التي يتسبب فيها الإنسان، وخلايا أولية RPE، إلخ) وميزت بطريقة مختلفة هي أيضا مناسبة لهذا البروتوكول. ويشمل التمييز الموجه البروتوكولات باستخدام السيتوكينات و/أو الجزيئات الصغيرة17،،من1819،20،،من2122.
لزرعها، ينبغي إعداد الأنسجة المهندسة على سقالة. في السنوات القليلة الماضية، وضعت السقالات مختلفة استناداً إلى بوليمر أو على مصفوفة من أصل بيولوجي13،،من2324. هنا، هو الركيزة البيولوجية المستخدمة لحم الخنزير، ولكن يمكن تنفيذ ركائز أخرى، مثل المعراة Bruch الأغشية،. الأسلوب الموصوفة هنا يحتوي على ميزة استخدام سقالة بيولوجية التي أكثر صلة بالبيئة الأصلية RPE.
تستزرع المستمدة من الخلايا خلايا RPE ES الإنسان لمدة 4 أسابيع على الأقل من أجل تنظيم تماما كأحادي الطبقة المرصوفة بالحصى. في هذه المرحلة، ظهارة الحصول على وظيفية والاستقطاب9. وأخيراً، كما هذا النسيج التجاعيد بسهولة، أنه مضمن في طبقة رقيقة من الناقل المائية لإعطائها أكثر صلابة ومرونة وحمايته أثناء إجراء حقن. ويتم حينئذ تخزين هذا المنتج عند 4 درجة مئوية حتى التطعيم.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصفت لنا طريقة لاستزراع خلايا RPE على سقالة بيولوجية وإعداده لغرس في نماذج حيوانية. واحدة من الخطوات الحاسمة للبروتوكول هو الحفاظ على اتجاه هام على طول هذا الإجراء حتى إدراجه في الجيلاتين. في الواقع، تتم إزالة ظهارة الأصلي للغشاء وأن الغشاء يصبح عرضه9. الخلايا RPE يجب أن يكون الم…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يود أن يشكر جيروم لارغيرو وفاليري فانو (مستشفى سانت لويس، باريس، فرنسا) لمساهمتها أثناء إقامة للطريقة الموضحة هنا.
أيد منح مقدمة من وكالة الاستخبارات الوطنية هذا العمل [جبيبس: ANR-2010–RFCS005؛ سايتريبير: وكالة الاستخبارات الوطنية-16-CE17-008-02]، لوس أنجليس من أجل مؤسسة “بحوث ميديكال” [برنامج الهندسة الحيوية-DBS20140930777] ومن “أحياء لابيكس” [ANR-10-لابكس-73] “أوليفييه جورو” ومونفيل Christelle. أيده نيوراتريس، بحوث متعدية بنية أساسية (يشرف دعفينير) بيوثيرابيس في علوم الأعصاب [ANR-11-إينبس-0011] وإينجيستيم، البنية التحتية الوطنية (يشرف دعفينير) الشركة الهندسية ل pluripotent و المتمايزة الخلايا الجذعية [ANR-11-إينبس-000] إلى مونفيل Christelle. كريم بن مبارك أيده زمالات من ستيمبل خافت وإحياء لابيكس [ANR-10-لابكس-73]. الجذعية جزء من معهد “الأمراض النادرة التي” تدعمها “الرابطة الفرنسية” مكافحة ليه ميوباثيس (AFM) بيوثيرابيس-Téléthon.
Materials
| Sterile biosafety cabinet | TechGen International | Not applicable | |
| Liquid waste disposal system for aspiration | Vacuubrand | BVC 21 | |
| CO2-controlled +37 °C cell incubator | Thermo Electron Corporation | BVC 21 NT | |
| 200 µL pipette: P200 | Gilson | F144565 | |
| 1 mL pipette: P1000 | Gilson | F144566 | |
| Pipet aid | Drummond | 75001 | |
| +4 °C refrigerator | Liebherr | Not applicable | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fine scissors | WPI | 501758 | |
| Forceps (x2) | WPI | 555227F | |
| Water bath | Grant subaqua pro | SUB6 | |
| Precision balance | Sartorius | CP225D | |
| Centrifuge | Eppendorff | 5804 | |
| Microscope | Olympus | SC30 | |
| Horizontal Rocking Shaker | IKA-WERKE | IKA MTS 214D | |
| Vortex | VWR | LAB DANCER S40 | |
| Disposable Scalpel | WPI | 500351 | |
| plastic paraffin film | VWR | PM992 | |
| 0.200 µm single use syringe filter | SARTORIUS | 16532 | |
| Syringe without needle 50 mL | Dutscher | 50012 | |
| Bottles 250mL | Dutscher | 28024 | |
| 15 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352097 | |
| 50 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352098 | |
| culture insert | Scaffdex | C00001N | |
| 60 mm cell culture disches: B6 | Dutscher | 353004 | |
| 12 well cell culture plate | Corning | 3512 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3506 | |
| Razor blades | Ted Pella, Inc | 121-9 | |
| Cyanoacrylate glue | Castorama | 3178040670105 | |
| PBS 1X (500 mL) | Sigma | D8537 | |
| Thermolysine | Roche | 5339880001 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965-026 | |
| KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) | Invitrogen | 12618-013 | |
| MEM-NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-035 | |
| b-mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| CO2-independent medium | GIBCO | 18045-054 | |
| Gelatin | MERCK | 104078 | |
| human amniotic membrane | Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) | Not applicable |
Riferimenti
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Gehrs, K. M., Anderson, D. H., Johnson, L. V., Hageman, G. S. Age-related macular degeneration–emerging pathogenetic and therapeutic concepts. Annals of Medicine. 38 (7), 450-471 (2006).
- Swaroop, A., Chew, E. Y., Rickman, C. B., Abecasis, G. R. Unraveling a multifactorial late-onset disease: from genetic susceptibility to disease mechanisms for age-related macular degeneration. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 19-43 (2009).
- Khandhadia, S., Cherry, J., Lotery, A. J. Age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 724, 15-36 (2012).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ben M’Barek, K., Regent, F., Monville, C. Use of human pluripotent stem cells to study and treat retinopathies. World Journal of Stem Cells. 7 (3), 596-604 (2015).
- Ben M’Barek, K., et al. Human ESC-derived retinal epithelial cell sheets potentiate rescue of photoreceptor cell loss in rats with retinal degeneration. Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt’s macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Hsiung, J., Zhu, D., Hinton, D. R. Polarized human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cell monolayers have higher resistance to oxidative stress-induced cell death than nonpolarized cultures. Stem Cells Translational Medicine. 4 (1), 10-20 (2015).
- Diniz, B., et al. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (7), 5087-5096 (2013).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Thomas, B. B., et al. Survival and functionality of hESC-derived retinal pigment epithelium cells cultured as a monolayer on polymer substrates transplanted in RCS rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (6), 2877-2887 (2016).
- Borooah, S., et al. Using human induced pluripotent stem cells to treat retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 37, 163-181 (2013).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise review: Making stem cells retinal: Methods for deriving retinal pigment epithelium and implications for patients with ocular disease. Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells as a tool to model a form of Leber congenital amaurosis. Cellular Reprogramming. 15 (3), 233-246 (2013).
- Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS Cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
- Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10950-10955 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Ilmarinen, T., et al. Ultrathin polyimide membrane as cell carrier for subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium. PloS One. 10 (11), e0143669 (2015).
- Thumann, G., Schraermeyer, U., Bartz-Schmidt, K. U., Heimann, K. Descemet’s membrane as membranous support in RPE/IPE transplantation. Current Eye Research. 16 (12), 1236-1238 (1997).
- Kiilgaard, J. F., Scherfig, E., Prause, J. U., la Cour, M. Transplantation of amniotic membrane to the subretinal space in pigs. Stem Cells International. 2012, 716968 (2012).
- Capeans, C., et al. Amniotic membrane as support for human retinal pigment epithelium (RPE) cell growth. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (3), 271-277 (2003).
- Ohno-Matsui, K., et al. The effects of amniotic membrane on retinal pigment epithelial cell differentiation. Molecular Vision. 11, 1-10 (2005).
- Paolin, A., et al. Amniotic membranes in ophthalmology: long term data on transplantation outcomes. Cell and Tissue Banking. 17 (1), 51-58 (2016).
- Hu, Y., et al. A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer. Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).
- Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent stem cell-based therapies in combination with substrate for the treatment of age-related macular degeneration. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: The Official Journal of the Association. 32 (5), 261-271 (2016).
- Song, M. J., Bharti, K. Looking into the future: Using induced pluripotent stem cells to build two and three dimensional ocular tissue for cell therapy and disease modeling. Brain Research. 1638 (Pt A), 2-14 (2016).
- Ramsden, C. M., et al. Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future). Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
- Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
- Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Transplantation of the RPE in AMD. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (5), 516-554 (2007).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
