力の単一分子分光法のための蛋白質の共有結合固定

1. 機能性シラン カップリング剤によるタンパク質の固定化 注:図 1は、この議定書に適用される表面の化学上の概要を示します。 注意: 次のプロトコルで腐食性、皮膚刺激性のプロパティを持つ別の化学物質が使用されます。適切な (耐酸性) 手袋、安全ゴーグルと白衣を着用し、蒸気の吸入を避けるためにソリューションを準備している間ヒューム フードの下で動作します。 シラン カップリング剤とシリコン窒化カンチレバーや、ガラス表面の高機能化 粗塵を削除し、イソプロパノールと糸くずの精度でスライド ガラスから汚染ワイプ、スライドを (省略可能) 必要なサイズにカットします。注: ガラス、横にある固体の表面できます石英、シリカ、アルミニウム、銅、スズ、チタン、鉄、クロム、ジルコニウム、ニッケル、亜鉛の酸化物。注意: スライド ガラスを切るシャープなエッジがあります。 場所のガラス スライド染色瓶に塩酸でいっぱい (33 %hcl) 二重蒸留水 (ddH2O) 3-5% (v/v) で希釈し、適切なふた付きの瓶を閉じて、室温で 90 分用超音波洗浄槽にそれを置きます。メモ: 使用される jar は、直径 6 cm、65 〜 70 mL のおおよそのサイズ。Jar の希釈 HCl の適切な量は 5 mL を含む 50 mL 33 %hcl と ddH2o ・ 45 mLHCl は効果的に非結合金属イオン、特にナトリウム、カリウム、カルシウムを削除し、水酸基飽和ガラス表面を生成するために、シリコンを低減します。注意: 塩酸は腐食性、皮膚刺激性です。十分な酸抵抗力がある手袋を着用、安全メガネおよび研究室コート蒸気の吸入を避けるためにソリューションを準備している間ヒューム フードの下で動作します。 AFM 先端の上向きできれいなガラスのスライドにプローブをカンチレバーし、紫外線の少なくとも 90 分上から光を照射窒化ケイ素を配置します。メモ: 単一分子力分光法、0.01、0.1 N m-1の名目のバネ定数のカンチレバーは適しています。紫外光を用いたカンチレバー表面の照射は有機汚染物質、主に脂肪物質を削除し、1 つの側面に親水性にレンダリングします。反対側を重く汚染された – 場合は、ないはずや SMF 計測カンチレバー プローブのサプライヤーのボックス – 新鮮な使用される場合それ影響を与える可能性があります。多くの研究34で使用されています、ピラニアのソリューションを使用して全体のカンチレバー チップの徹底的なクリーニングを助けるかもしれない。注意: 紫外光は目に有害であります。したがって、カンチレバー プローブの照射は、UV の光不透過性室で実施されなければなりません。ピラニア ソリューションは、反応性の高い皮膚、紙、その他の有機物を燃やすことができます。プラスチック製の容器は使用しないでください。料理や少量の有機表面汚染 (例えば、前の使用から) とも jar ファイルに配置されている場合は、急速に反応があります。 DdH2O ガラス表面乾燥し、戻って別の 10 分の超音波風呂、瓶を置きますをさせることがなく染色瓶に塩酸が複数回、塩酸を洗って、適切にそれぞれ 10 分の 2 つの水を交換交換酸。 一方で、エトキシ (またはメトキシ) シラン ポリエチレン グリコール酸を溶解 (Si (OC2H5)3-ペグ-COOH) 混合物のエタノールと ddH2O (v/v 95%/5%、酢酸で調整 pH 4.6) に最終濃度 0.1 mg mL-1。エタノールの蒸発を避けるために密封ソリューションを格納します。注: シラン カップリング剤は、水分と温度に敏感です。したがって、低温 (-20 ° C) および乾燥した条件の下で不活性ガス (N2)、下はこのフィールドに格納する必要があります。フラスコを開く前に、シランが水和反応を最小限に抑えるために部屋の温度に達していることを確認してください、それによって反応基の不活性化。多数のさまざまな機能グループと異なるスペーサーの長さ Heterobifunctional ペグ カップリング剤があります。ランダム固定蛋白質を介しての遊離アミノ基 (NH2) エトキシ/メトキシシラン追加機能グループは、このプロトコルで記述としては NHS エステルで必要があります。NHS エステルとシラン剤の購入、横にこのような NHS エステルを得るために簡単な方法、カルボキシル基のグループをアクティブ化する (-COOH) と 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) と NHS (1.2.1 を参照してください。 と 1.2.2。)。注意: エタノールは可燃性と皮膚の刺激です。酢酸は、可燃性、腐食性です。皮膚や目に反応性シランを取得しないように注意してください。適切な手袋、安全ゴーグルと白衣を着用し、蒸気の吸入を避けるためには発煙のフードの下で働きます。 2 つの独立したペトリ皿にシラン溶液を注ぐ、それぞれ 1 つのシャーレに準備されたカンチレバー プローブとスライド ガラスを配置、密閉するエタノールの蒸発を避けるためで 90 分間静止を孵化させなさい (例えばパラフィルム)部屋の温度。注: ペトリ皿の最適なサイズは、カンチレバー プローブの数と修飾する必要がありますガラスのサイズに依存します。良いハンドリングと低試薬量の直径のサイズは 50 〜 60 ミリメートルです。カンチレバーの気液界面を貫通しながらカンチレバーの望ましくない曲げ加工を避けるために空気-水界面に 90 ° の角度で開催される必要があります。スライド ガラス (しかしないカンチレバー プローブ) の潜伏は、軌道シェーカーで必要に応じて実施することができます。 非連結のシラン化合物類を完全に洗浄する純粋なエタノールを含む 3 つの連続したビーカーのカンチレバーとガラス スライドをすすいでください。注: 気液界面を貫通しながらカンチレバーの望ましくない曲げ加工を避けるためにカンチレバーは 90 ° の角度で開催される必要があります。 染色瓶ときれいなガラスのスライドと 110 ° c 30 分治療で片持ちに機能ガラス スライドを配置します。注: 熱硬化共有結合性シロキサン結合の形成と水の除去を誘導します。ガラスとスライドは 1 つの側面にのみ機能化、コーティング面を適切に示す確認します。 シラン処理ガラス サンプルを格納し、カンチレバー プローブ真空デシケータ 1 週間。注: プロトコルはここで一時停止することができます。 シラン処理ガラスとシリコン窒化カンチレバーに蛋白質の乱数固定注: カンチレバーの望ましくない曲げないカンチレバー プローブを負うべき 90 ° の角度で任意の気液界面を貫通しながら。 準備ソリューション含む 42 mg mL-1 EDC のと 20 mg mL-1 NHS に標準リン酸緩衝生理食塩水 (PBS; 137 mM NaCl、KCl 2.7 mM、10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4、pH 7.4)。注意: EDC は腐食性、皮膚刺激性、眼に対する重篤な損傷を引き起こすことができます。適切な手袋、安全ゴーグルと白衣を着用します。 ソリューションを持つシラン コーティング ガラス スライドをカバー EDC/NHS 溶液の一滴シラン処理カンチレバー プローブを入れ、室温で 10 分間インキュベートします。注: カンチレバー プローブの孵化、オリジナルの片持箱は適しています。Carboxyls の遊離アミノ基を介してタンパク質カップルに (-COOH) heterobifunctional シラン ペグ エージェントの – COOH のグループは広く使われている EDC/NHS 化学でアクティブ化します。EDC は、生理的な pH は次のステップでアミンに効率的な活用を可能にする「安定的」NHS エステルを形成カルボン酸に NHS をカップルします。 過剰な EDC/NHS を完全に洗浄するために 3 つの連続したビーカーで PBS で徹底的に片持ちとガラス スライドをすすいでください。注: この洗浄工程は残りの EDC/NHS が架橋タンパク質として重要なは、それによりその機能を変更します。 活性ガラス スライドを孵化し、カンチレバー プローブ室温湿式チャンバー内で目的タンパク質溶液の滴で。タンパク質の濃度と潜伏期間は実験の要件を満たすように適応する必要があります。一般に、1 0.5 mg mL-1とインキュベーション時間 30 分から 2 時間の間に集中はほとんどの蛋白質に適しています。(スライド ガラス) のフィブロネクチンと (カンチレバー) 上毛 1 ヒント タンパク質 RrgA の場合 1.5 μ M と 3 μ M のモル濃度, と 2 h のインキュベーション時間十分です。 スライド ガラスを洗うし、カンチレバーの自由な蛋白質を洗浄するために 3 つの連続したビーカーで PBS で徹底的にプローブします。 トリス (ヒドロキシメチル) 残りの NHS エステル飽和-トリス緩衝生理食塩水 (TBS; 50 mM トリス、150 mM の NaCl、pH 7.6) 室温で 20 分間でプローブを配置することによって aminomethan。注: この手順削減トリスのアミノ基がカンチレバーと基板表面に残りの活性 COOH のグループにバインドできるので、タンパク質の AFM の先端の機能面とガラスの間の望ましくない共有結合します。 スライド ガラスを洗浄し、カンチレバー プローブ徹底的に PBS と店別ペトリ皿でそれらは使用するまで PBS で覆われています。注: サンプル新鮮な準備する必要があります、同じ日を使用します。 2. 原子間力顕微鏡による単一分子力分光法 注: この作業の JPK インスツル メンツから原子間力顕微鏡を用いて、セット力 RampDesigner で定義された力距離曲線を得るためにの ups。 熱雑音法35片校正注: 片持ち校正用製造元のマニュアルの手順に従ってください。ほとんどは、公称カンチレバー形状 (長さ、幅、厚さ) から計算は通常、非常に信頼性ではありませんおおよそばね定数サプライヤー状態を片持ち。正しいばね定数が重要な 3 通で下記片校正を実施と光レバー感度の平均値を使用し、バネ定数をお勧めします。実験と光レバー感度を使用して、その後 (pN) を強制し、ばね定数を平均値変換中ボルト (V) でカンチレバーのたわみ量を記録することができます。レーザー位置は片持梁 (反映されたレーザーの位置はフォト ダイオードに再調整することができます) に変更ない限り、ばね定数と光レバー感度は、実験の前後に決定できます。 原子間力顕微鏡の試料ホルダーのクリーンでフレッシュなガラス スライドを修正し、PBS バッファーでそれをカバーします。注: 校正実施されなければならない (例えばガラス) ハード面と実際の実験として同じバッファー。 カンチレバー ホルダーで準備されたカンチレバー プローブを修正、AFM ヘッドに配置し、PBS バッファーのドロップでカンチレバーを慎重に濡れています。注: カンチレバーのぬれは、キャリブレーション ガラス スライドとカンチレバーのそれにより望ましくない曲げの PBS バッファーに浸透中に現れる表面張力を減らします。 PBS バッファーがまだ校正面から離れて、カンチレバーが完全に浸漬されるまでゆっくりと校正表面に向かって片を移動します。 AFM のトップ ビュー光学顕微鏡を使用して、(可能なら) または倒立顕微鏡原子間力顕微鏡 AFM のレーザーをカンチレバーの裏側に位置する下に。レーザーをカンチレバー先端がある近くの終わり近くスポットの場所。注: レーザー スポットは、片持ち梁の終点近くにする必要がありますが、それはまだカンチレバーに完全にする必要があります。光学顕微鏡が利用できない場合可視光レーザ ダイオード、赤外レーザー ダイオードのレーザー検出器カード一枚の紙を使用して、原子間力顕微鏡の頭の下に置くし、カンチレバーがあるカンチレバー チップのエッジに向かってレーザー スポットを移動、紙や検出器のカードにスポットが表示されるまで。レーザーを縁に平行移動します。スポットが消えたら、カンチレバー ・ アームです。線形カンチレバーの紙/検出器カードと移動 (紙/カードから消える) レバー腕に再びなるまでに戻ってそれに表示されるまでレバー腕の終わりに場所を移動します。三角形、カンチレバーの 2 本の腕間の中間にスポットを置き、紙/カードから見えなくなるまで、片持ち梁の端に向かって移動します。カンチレバーの長い軸に垂直にスポットを移動することによってカンチレバーの真ん中にあることを確認します。 反射レーザー光がフォト ダイオードの中心部に配置されているような方法で AFM の 4 象限検出器フォト ダイオードの位置を調整します。注: 手順に従います: 検出ダイオード近くマイクロメータ ネジを使用してすべての 4 つの象限から合計信号を最大まで水平および垂直方向に、ダイオードを移動します。垂直偏向信号がゼロになるまで、垂直方向にダイオードを移動し、横方向の偏向信号がゼロになるまで水平方向にダイオードを移動します。シリコン窒化カンチレバー通常ゴールド コーティング、したがって 2 つの異なる熱膨張係数とバイメタルです。これは、結果、ソリューションで特に熱ドリフト (垂直偏向信号で明らかに)。測定中にこのドリフトの低減、キャリブレーションを開始する前に、数分間平衡システム全体をしましょう。 Afm によるソフトウェアのキャリブレーション マネージャーを開き、熱雑音による片持ち感度とカンチレバーのばね定数を次のように調整。 慎重に基板表面に接近し、力距離曲線を記録します。 先端が基板表面との接触が撤回フォース カーブの急勾配の部分に直線のあてはめによる nm/V の光レバー感度を決定します。感度 pN/nm にカンチレバーのばね定数を変換できるようにします。注: 収縮曲線の傾きは、ピエゾ旅行距離対です。(nm/V で測定) フォト ダイオード電圧の変化。 任意の表面の減衰を除外するためにカンチレバー約 100 μ m 以上の表面からカンチレバーのいくつかの熱雑音スペクトルを記録します。 熱雑音スペクトルの原子間力顕微鏡のソフトウェアによって提供される高調波発振器をあてはめによる pN/V におけるカンチレバーのばね定数を決定します。 ゆっくりとカンチレバーを撤回、ソリューションから撤退します。 代替ガラス表面は固定された蛋白質を含む試料表面とカンチレバー校正に使用されます。確認カンチレバーと試料表面 (とそれによって蛋白質) スライド ガラスを変化させながら乾燥しないでください。 相互作用力の単一蛋白質のレベルの実験 PBS バッファーが基板表面からまだ、カンチレバーが完全に覆われるまで、ゆっくりとサンプル表面に向かって湿ったカンチレバーを移動します。注意: 実験中に熱ドリフトの低減、力の分光測定を開始する前に、数分間設定システム全体をさせてください。 表面に近づくし、試料表面の 250 の pN の接触力とさまざまな場所で複数の力距離カーブ (≥ 500) の 1 の接触時間を記録 s、2 μ m の撤回長さと収縮速度 1 μ m s-1。注: 一般的な力分光法による調整では、製造元のマニュアルに従ってください。バリエーション: 後退速度は、5 μ m s-1と 0.1 の間増加荷重に応じて 406 動力学的データを計算する変えることができます。時間依存の結合強化を分析する対話時間を変えることができます。収縮速度を一定に保つには、代わりに 1 つは力定数 (力クランプ モード) を維持可能性があります。 データ分析注: データ処理ソフトウェアを使用してデータ解析を行った。固定された蛋白質、接触時間または収縮速度、またはないかどうかフット プリントを設立、他の可変パラメーターに応じて力距離曲線には複数の異なる情報が含まれて。データ分析と解釈、さまざまな SMF 実験によって大きく異なる、したがって、ここでは詳しくは説明しませんが。RrgA と Fn の相互作用に関しては次のプロトコルは、SMF データの分析のための最初のステップをすることができます。 開いているバッチを強制的にスキャンのアイコンを選択して測定力曲線ファイルを開き、力距離曲線を次のように処理します。 (Re) 調整感度の調整とばね定数による V たわみアイコンを選択して直接比例した力 (F) をカンチレバーのたわみ量 (V) に変換します。注: 片持ち校正は実験前に実施された、値がスキャン ファイルに保存され、V たわみの校正中に自動的に使用されます。実験後、キャリブレーションを行った、測定値に変更することができます既定の値が使用されます。 基線の減算のアイコンを選択してゼロの力のレベルを設定するために表面まで力曲線の領域で撤回チャネルのベースラインを減算します。注: いくつかのケースで収縮がなく同じ一定の力値、カーブがオフセット + チルトを選択して削除できる線形傾斜を表示ことがあります。 先端がポイント決定のお問い合わせアイコンを選択して、サンプルと接触する取得ポイントを定義します。 チップ-試料分離アイコンを選択して、tip サンプル分離に高さ信号を変換します。接触点位置を減算、に加えてこの手順は片持基板表面と AFM 先端間の距離を計算する曲げを減算します。注: 拡張可能なワームような鎖モデルと相互作用の長さの決定のような高分子弾性モデルをフィッティングのための片持ち梁の曲げ修正チップ-試料の分離が必要です。力負荷力曲線と z 圧電速度の勾配から速度を決定するには、裸眼フォース カーブを使用してください。 破断距離 70 nm (伸ばされた PEG スペーサーの長さ)36非特異的な相互作用を整理し、選択して選択したピークに拡張可能なワーム様チェーン モデルを適用する上で発生する力のピークの力距離トレースを画面、高分子鎖モデルに合うアイコンと拡張ワームのようなチェーン モデルを選んだ。収縮力曲線のピークはこのモデルを搭載して、破断荷重、長さが得られるポリマーの弾性パラメーターと共に。 力と長さの分布を示すヒストグラムとしてデータを表示します。ヒストグラムの少なくとも 100 のバインド解除イベントを使用します。