Bewertung der synaptischen Schnittstelle der primären menschlichen T-Zellen aus peripherem Blut und Lymphgewebe
Summary
Das Protokoll beschreibt eine Technik, um die Fähigkeit der primären polyklonale menschlichen T-Zellen synaptische Schnittstellen mit planaren Lipid Bilayer bilden zu studieren. Wir verwenden diese Technik, um die differenzielle Synapse Bildung Fähigkeit der menschlichen primäre T Zellen aus Lymphknoten und peripheren Blut zu zeigen.
Abstract
Das gegenwärtige Verständnis der Dynamik und strukturellen Merkmale der T-Zellen synaptischen Schnittstellen wurde weitgehend bestimmt durch den Einsatz von Glas-gestützte planar Bilayer und in-Vitro-abgeleiteten T-Zell-Klone oder Linien1,2 ,3,4. Wie diese Erkenntnisse für die primären menschlichen T-Zellen aus Blut isoliert oder lymphatischen gelten Gewebe ist nicht bekannt, teilweise erhebliche Schwierigkeiten, eine ausreichende Anzahl von Zellen für die Analyse5. Hier begegnen wir dies durch die Entwicklung einer Technik, die Nutzung von Folien, Multichannel-Fluss um planare Lipid Bilayer mit Aktivierung und Adhäsion Moleküle bauen. Die geringe Höhe der Fluss Folien fördert schnelle Zelle Sedimentation, um Zelle: Bilayer Anlage, wodurch Forscher studieren die Dynamik der synaptischen Schnittstelle Bildung und die Kinetik der Granulat-Version synchronisieren. Wir wenden diesen Ansatz zur Analyse der synaptischen Schnittstelle von so wenig wie 104 bis 105 primäre kryokonservierten T-Zellen isoliert von Lymphknoten (LN) und peripherem Blut (PB). Die Ergebnisse zeigen, dass die neuartige planar Lipid Bilayer Technik die Studie die biophysikalischen Eigenschaften des primären menschlichen T-Zellen aus Blut und Gewebe im Zusammenhang mit Gesundheit und Krankheit abgeleitet ermöglicht.
Introduction
Wissenschaftlicher Erkenntnisse über die strukturellen Merkmale des T-Zell-immun-Synapsen und ihre Verknüpfung, die funktionelle Aktivität der T-Zellen erzeugt worden ist, in erster Linie aus der Studie von Zelllinien und Klone von PB abgeleitet. Inwieweit diese Ergebnisse beziehen sich auf primäre T-Zellen entnommen Blut oder lymphatischen Gewebe bleibt unklar, wie die synaptischen Schnittstellen von T-Zellen, die ihren Wohnsitz in den lymphatischen und anderen Geweben bisher nicht analysiert wurden. Wichtig ist, neue Daten deuten darauf hin, dass Gewebe-Resident und lymphatischen Organ abgeleitet T-Zellen möglicherweise erhebliche Unterschiede in ihren Phänotyp und funktionelle Aktivität im Vergleich zu denen in PB6,7. Dies hat die Notwendigkeit, besser zu verstehen, die Funktionen der T-Zell-synaptischen Schnittstelle in primären menschlichen T-Zellen weiter verfestigt.
Zu diesem Zweck entwickelten wir eine neuartige Mini-Ansatzes Ausnutzung Lipid Bilayer eingebaut Multichannel-Fluss Folien ermöglichen die Darstellung der T-Zelle/Bilayer Schnittstellen mit weniger als 105 primäre T-Zellen aus menschlichen PB und LN isoliert ausführen Diese neuartige Technik ermöglicht die Studie die biophysikalischen Eigenschaften des primären menschlichen T-Zellen synaptischen Schnittstellen um besser zu modellieren und in Vivo Zell-Zell-Interaktionen zu verstehen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die neuartige Technik, die hier beschriebenen nutzt ähnliche Reagenzien erforderlich, um planare Bilayer in den herkömmlichen Flow Zelle5 bauen und kann erfolgreich eingesetzt werden, um die Darstellung der primären menschlichen T-Zell-Bilayer Schnittstellen3,4 durchführen ,15. Die Technik bietet eine deutliche Reduzierung der fluoreszierende Moleküle Nutzung und erfordert 10 – 20 x weniger T-Zell…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die R01AI118694 NIH Grant, Michael R. Betts, worunter Sub Award 566950, Yuri Sykulev. Wir danken der Sidney Kimmel Cancer Center Bioimaging geteilt Ressource für ihre hervorragende Unterstützung.
Materials
| CD4 T cell isolation kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-533 | |
| CD8 T cells Isolation Kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-495 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| DOGS NTA | Avanti Polar Lipids | 790528C | |
| Biotinyl Cap PE | Avanti Polar Lipids | 870273C | |
| Human Serum Albumin | Octapharma USA | NDC 68982-643-01 | |
| sticky-Slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky-Slides | ibidi | 10812 | |
| Bioptech FCS2 Chamber | Bioptech | 060319-2-03 | |
| anti-CD3 antibody | Thermo Fisher Scientific | 16-0037-81 | OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC |
| anti- CD28 antibody | Genetex | GTX14664 | 9.3 clone |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Biotin-PEO4-NHS | Thermo Fisher Scientific | 21329 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5 | |
| Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10235 | |
| Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10238 | |
| Amersham Cy5 NHS Ester | GE Life Science | PA15101 | |
| pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
| pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection | ATCC | 37409 | |
| Serum free Drosophial media Insect-XPRESS | Lonza | 12-730Q | |
| Hybridoma YN1/1.7.4 | ATCC | CRL1878 | The hybridoma secrets antibody against ICAM-1. |
| Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B | Sigma-Aldrich | C9142 | Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody. |
| MasterFlex tangential flow concentrator | Cole-Parmer | 77601-60 7592-40 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Centramate Lab Tangential Flow Systems | Pall Laboratory | FS002K10 OS010T12 FS005K10 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30210 | |
| Dialysis tubing | Spectra/Por | 131384 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | |
| mouse anti-human antibody against CD107a | BD Bioscences | 555798 | Clone H4A3 |
| Ansell Natural Blue Gloves | Fisher Scientific | 19-014-539 | |
| Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps | Thermo Fisher Scientific | 6320-0010 | |
| Streptavidin | ProZyme | SA10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60x oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table | |
| TIRF microscope | Andor | Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS) | |
| MetaMorph Premier Image Analysis Software | Molecular devices |
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