تقييم الواجهة متشابك لخلايا تي البشرية الأولية من الدم والأنسجة اللمفاوية
Summary
ويصف البروتوكول تقنية لدراسة قدرة خلايا تي البشرية [بولكلونل] أولية على شكل متشابك واجهات استخدام بليرس الدهن مستو. نحن نستخدم هذه التقنية لإظهار القدرة على تشكيل المشبك التفاضلية للبشرية من خلايا تي الأولية المستمدة من العقد الليمفاوية والدم المحيطي.
Abstract
وكان الفهم الحالي لديناميات والسمات الهيكلية لواجهات متشابك تي خلية مصممة إلى حد كبير من خلال استخدام بليرس مستو المدعومة من الزجاج و في المختبر-استنساخ خلايا تي المشتقة أو خطوط1،2 ،،من34. كيفية تطبيق هذه النتائج على الخلايا تي البشرية الأولية المعزولة من الدم أو اللمفاوية الأنسجة غير معروف، جزئيا بسبب صعوبات كبيرة في الحصول على عدد كاف من الخلايا لتحليل5. هنا علينا أن نعالج هذا من خلال تطوير أسلوب استغلال الشرائح التدفق متعدد القنوات لبناء بليرس الدهن المستوية التي تحتوي على جزيئات تفعيل والالتصاق. وتشجع ارتفاع منخفض للشرائح تدفق الترسيب السريع الخلية من أجل مزامنة المرفقات الخلية: بلير، مما يسمح للباحثين لدراسة دينامية تشكيل واجهة متشابك والحركية من الإفراج عن حبيبات. نقوم بتطبيق هذا النهج في تحليل واجهة متشابك من عدد قليل من 104 إلى 105 الابتدائي cryopreserved تي الخلايا المعزولة من العقد الليمفاوية (LN) والدم المحيطي (الجريدة الرسمية). وتكشف النتائج أن أسلوب بلير الدهن مستو رواية تمكن دراسة الخصائص الفيزيائية لخلايا تي البشرية الأولية المستمدة من الدم والأنسجة في سياق الصحة والمرض.
Introduction
المعرفة العلمية بالسمات الهيكلية لخلايا تي المناعية الاشتباكات العصبية وارتباطها بالنشاط الوظيفي لخلايا تي تم إنشاؤها أساسا من دراسة خطوط الخلايا واستنساخ المشتقة من الجريدة الرسمية. بقدر ما تتصل هذه النتائج الأولية تي الخلايا التي تم الحصول عليها من الدم أو الأنسجة اللمفاوية البشرية ما زال غير واضح، كما الواجهات متشابك من خلايا تي المقيمين في الأنسجة اللمفاوية وغيرها لا قد تم تحليلها حتى الآن. الأهم من ذلك، توحي البيانات الناشئة أن خلايا تي المقيم في الأنسجة والمستمدة من الجهاز الليمفاوي قد اختلافات كبيرة في النمط الظاهري والنشاط الوظيفي مقارنة بتلك التي في الجريدة الرسمية6،7. هذا وقد وطدت كذلك الحاجة إلى فهم أفضل ميزات واجهة متشابك تي خلية في خلايا تي البشرية الأساسية.
وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير نهج مقياس مصغر رواية استغلال بليرس دهن صلب الشرائح تدفق الأقنية تمكننا من إجراء تصوير واجهات تي-خلية/بلير مع أقل من 105 الابتدائي تي الخلايا المعزولة من الجريدة الرسمية البشرية و LN. يسمح هذا الأسلوب الرواية دراسة الخصائص الفيزيائية الأساسية البشرية تي خلية واجهات متشابك من أجل نموذج أفضل وفهم التفاعلات في فيفو خلية خلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
رواية الأسلوب الموصوفة هنا يستخدم مماثلة الكواشف اللازمة لبناء بليرس مستو في خلية تدفق التقليدية5 ويمكن تطبيقها بنجاح على القيام بتصوير الخلية تي البشرية الأولية – بلير واجهات3،4 ،15. الأسلوب يقدم تخفيضاً كبيرا في استخدام ج?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل بمنحه R01AI118694 المعاهد الوطنية للصحة لمايكل ر. بيتس، التي تشمل جائزة الفرعي 566950 إلى يوري سيكوليف. ونحن نشكر “سيدني كيميل سرطان مركز بيويماجينج الموارد المشتركة” لدعمهما الممتاز.
Materials
| CD4 T cell isolation kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-533 | |
| CD8 T cells Isolation Kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-495 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| DOGS NTA | Avanti Polar Lipids | 790528C | |
| Biotinyl Cap PE | Avanti Polar Lipids | 870273C | |
| Human Serum Albumin | Octapharma USA | NDC 68982-643-01 | |
| sticky-Slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky-Slides | ibidi | 10812 | |
| Bioptech FCS2 Chamber | Bioptech | 060319-2-03 | |
| anti-CD3 antibody | Thermo Fisher Scientific | 16-0037-81 | OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC |
| anti- CD28 antibody | Genetex | GTX14664 | 9.3 clone |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Biotin-PEO4-NHS | Thermo Fisher Scientific | 21329 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5 | |
| Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10235 | |
| Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10238 | |
| Amersham Cy5 NHS Ester | GE Life Science | PA15101 | |
| pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
| pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection | ATCC | 37409 | |
| Serum free Drosophial media Insect-XPRESS | Lonza | 12-730Q | |
| Hybridoma YN1/1.7.4 | ATCC | CRL1878 | The hybridoma secrets antibody against ICAM-1. |
| Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B | Sigma-Aldrich | C9142 | Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody. |
| MasterFlex tangential flow concentrator | Cole-Parmer | 77601-60 7592-40 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Centramate Lab Tangential Flow Systems | Pall Laboratory | FS002K10 OS010T12 FS005K10 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30210 | |
| Dialysis tubing | Spectra/Por | 131384 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | |
| mouse anti-human antibody against CD107a | BD Bioscences | 555798 | Clone H4A3 |
| Ansell Natural Blue Gloves | Fisher Scientific | 19-014-539 | |
| Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps | Thermo Fisher Scientific | 6320-0010 | |
| Streptavidin | ProZyme | SA10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60x oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table | |
| TIRF microscope | Andor | Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS) | |
| MetaMorph Premier Image Analysis Software | Molecular devices |
Riferimenti
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Somersalo, K., et al. Cytotoxic T lymphocytes form an antigen-independent ring junction. Journal of Clinical Investigation. 113, 49-57 (2004).
- Beal, A. M., et al. Protein kinase C theta regulates stability of the peripheral adhesion ring junction and contributes to the sensitivity of target cell lysis by CTL. The Journal of Immunology. 181, 4815-4824 (2008).
- Beal, A. M., et al. Kinetics of early T cell receptor signaling regulate the pathway of lytic granule delivery to the secretory domain. Immunity. 31, 632-642 (2009).
- Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , (2007).
- Reuter, M. A., et al. HIV-Specific CD8(+) T Cells Exhibit Reduced and Differentially Regulated Cytolytic Activity in Lymphoid Tissue. Cell Reports. 21, 3458-3470 (2017).
- Buggert, M., et al. Limited immune surveillance in lymphoid tissue by cytolytic CD4+ T cells during health and HIV disease. PLoS Pathogens. 14, e1006973 (2018).
- Carrasco, Y. R., Fleire, S. J., Cameron, T., Dustin, M. L., Batista, F. D. LFA-1/ICAM-1 interaction lowers the threshold of B cell activation by facilitating B cell adhesion and synapse formation. Immunity. 20, 589-599 (2004).
- Anikeeva, N., et al. Distinct role of lymphocyte function-associated antigen-1 in mediating effective cytolytic activity by cytotoxic T lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 6437-6442 (2005).
- Steblyanko, M., Anikeeva, N., Campbell, K. S., Keen, J. H., Sykulev, Y. Integrins Influence the Size and Dynamics of Signaling Microclusters in a Pyk2-dependent Manner. The Journal of Biological Chemistry. 290, 11833-11842 (2015).
- Anikeeva, N., Lebedeva, T., Sumaroka, M., Kalams, S. A., Sykulev, Y. Soluble HIV-specific T-cell receptor: expression, purification and analysis of the specificity. Journal of Immunological Methods. 277, 75-86 (2003).
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Riddell, S. R., Greenberg, P. D. The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 128, 189-201 (1990).
- Lin, S. J., Yu, J. C., Cheng, P. J., Hsiao, S. S., Kuo, M. L. Effect of interleukin-15 on anti-CD3/anti-CD28 induced apoptosis of umbilical cord blood CD4+ T cells. European Journal of Haematology. 71, 425-432 (2003).
- Anikeeva, N., Sykulev, Y. Mechanisms controlling granule-mediated cytolytic activity of cytotoxic T lymphocytes. Immunologic Research. 51, 183-194 (2011).
- Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463, 963-967 (2010).
