Протоколы для изучения привязки золота катионов (Au(III)) к бычьим сывороточным альбумином (БСА), а также характеризующие конформационные зависимых уникальный BSA-Au флуоресценции представлены различные конформации.
Цель представленных протоколов является изучение процесса привязки Au(III) BSA, уступая конформации изменения индуцированной красной флуоресценцией (λет = 640 Нм) BSA-Au(III) комплексов. Этот метод корректирует рН, чтобы показать, что появление красной флуоресценцией коррелирует с рН индуцированной равновесия переходы BSA конформации. Красной флуоресцентной BSA-Au(III) комплексы могут быть сформированы только с корректировка pH на уровне или выше 9.7, который соответствует «A-form» конформацию BSA. Протокол для регулировки BSA Au молярное соотношение и контролировать ход времени процесс привязки Au(III) описано. Минимальное количество Au(III) за BSA, производить красной флуоресценцией, это меньше чем 7. Мы описываем протокола в шаги, чтобы продемонстрировать наличие нескольких сайтов связывания Au(III) в BSA. Во-первых, путем добавления медь (Cu(II)) или никель (Ni(II)) катионов следуют Au(III), этот метод открывает привязки сайта для Au(III), что это не красный Флюорофор. Во-вторых изменяя BSA, тиоловых укупорки агентов, раскрывается другой сайт nonfluorophore формирование Au(III) привязки. В-третьих изменение конформации BSA раскалывание и укупорки дисульфидными облигаций, проиллюстрированы возможные Au(III) привязки сайта. Протокол, описанный для управления BSA конформации и Au(III) привязки, обычно может применяться для изучения взаимодействия других белков и катионов металлов.
BSA-Au соединения выставке ультрафиолетового (УФ)-возбудимых красной флуоресценцией, с замечательным Стокса сдвига, первоначально синтезирован СЕ и др. 1. уникальный и стабильной красной флуоресценции можно найти различные приложения в таких областях, как зондирования2,3,4,5,6,7изображений или наномедицины8 ,9,10,11,12,13. Это вещество широко изучена многими исследователями в области нано науки в последние годы14,,1516. BSA-Au соединение было истолковано как Au25 нанокластерами. Цель представленных метода — это соединение в деталях изучить и понять происхождение красной флуоресценцией. Следуя представленного подхода, наличие нескольких сайтов связывания Au и происхождение флуоресценции, альтернативой сингл сайт нуклеации АС25 нанокластерами, можно проиллюстрировать. Этот же подход могут быть использованы для изучения, как другие белки17,18,19 complexed с Au(III) можно изменить их неотъемлемой флуоресцентные свойства.
Синтез соединения BSA-Au красно люминесцентные требует узкой контроля Молярная соотношения BSA АС (BSA:Au) для максимальной интенсивности флуоресценции и местоположение пики возбуждения выбросов карта (EEM)20. Может быть показано, что для Au(III) для привязки, существуют несколько сайтов связывания включая аспарагин фрагмента (или фрагмент Asp, первые четыре аминокислотных остатков на N-го BSA)21,22. 34й аминокислоты BSA (КМС-34) показано также для координации Au(III) и участвовать в механизме красный fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III))20. Рассекая все Cys Cys дисульфидными облигаций и покрывая все тиолов, красной флуоресценцией является не производится ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III)). Это говорит о необходимости Cys Cys дисульфидными облигаций как Au(III) привязки сайта для получения красной флуоресценцией.
Методы химии белка не было широко используется для изучения BSA-Au(III) комплексов в нано научного сообщества. Однако было бы полезно использовать эти методы, чтобы понять некоторые аспекты этих комплексов, а также получить подробное понимание сайтов связывания Au(III) в BSA. Эта статья призвана показать некоторые из этих методов.
BSA-Au(III) соединений, подготовленных при рН 12 экспонат красной флуоресценции в выбросах волны λет= 640 Нм при возбуждении с ультрафиолетового (УФ) света λex= 365 Нм (рис. 1A). Появление красной флуоресценцией представляет собой медленный процесс и займет нескольк…
The authors have nothing to disclose.
С.е. отмечает поддержку от герцога фонд специальной инициативы, Wells Fargo фонд, Фонд PhRMA, а также запуска средства из университета Северной Каролины, Шарлотта.
Bovine Serum Albumin (BSA), 96% | Sigma-Aldrich | A5611 | |
gold (III) chloride trihydrate, 99.9% | Sigma-Aldrich | 520918 | |
Copper (II) chloride dihydrate, 99.999% | Sigma-Aldrich | 459097 | |
Nickel (II) chloride hexahydrate, 99.9% | Sigma-Aldrich | 654507 | |
N-Ethylmaleimide (NEM), >99.0% | Sigma-Aldrich | 4259 | |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP), >98.0% | Sigma-Aldrich | C4706 | |
Sodium hydroxide, >98.0% | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Urea, 99.5% | Chem-Implex Int'l | 30142 | |
Phospate buffered saline (PBS) | Corning | MT21040CV | |
Ammonium bicarbonate, 99.5% | Sigma-Aldrich | 9830 |