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Genetica

Proteína endógena Tagging en humanos inducida por células madre pluripotentes utilizando CRISPR/Cas9

Published: August 25, 2018
doi:
10.3791/58130
, , , , ,
1Allen Institute for Cell Science

Summary

Se describe aquí es un protocolo para etiquetar endógeno expresado proteínas con las etiquetas fluorescentes en las células de vástago humanas pluripotentes inducidas mediante CRISPR/Cas9. Células supuestamente editadas se enriquecen con clasificación de celda de fluorescencia activada y se generan líneas de células clonales.

Abstract

Se presenta un protocolo para la generación de células de madre humanas pluripotentes inducidas (hiPSCs) que endógeno expresan proteínas fusionadas para etiquetas fluorescentes N o C terminal en-marco. El sistema CRISPR/Cas9 procariota (Cluster corto regularmente otro palindrómico 9 repeticiones/CRISPR-asociados) puede utilizarse para introducir secuencias exógenas grandes de loci genómicos mediante reparación de homología dirigida (HDR). Para lograr el deseado knock-in, este protocolo emplea la ribonucleoproteína (RNP)-enfoque donde proteínas tipo salvaje Cas9 de Streptococcus pyogenes , sintética guía parte 2-RNA (gRNA) y un plásmido de la plantilla de donantes se entregan a las células a través de electroporación. Células supuestamente editadas expresando las proteínas fluorescencia etiquetas se enriquecen por célula de fluorescencia activada (FACS) de clasificación. Líneas clonales entonces se generan y pueden ser analizadas para los resultados de edición precisa. Mediante la introducción de la etiqueta fluorescente en el locus genómico del gen de interés, la localización subcelular resultante y la dinámica de la proteína de fusión puede ser estudiada bajo control regulador endógeno, una mejora clave sobre sobreexpresión convencional sistemas. El uso de hiPSCs como sistema modelo para el etiquetado de genes proporciona la oportunidad de estudiar las proteínas etiquetadas en diploides, nontransformed las células. Desde hiPSCs pueden diferenciarse en múltiples tipos de células, este enfoque brinda la oportunidad de crear y estudiar proteínas etiquetadas en una variedad de contextos celulares isogénicas.

Introduction

El uso de estrategias de edición del genoma, especialmente CRISPR/Cas9, para estudiar los procesos celulares se está convirtiendo en cada vez más accesible y valiosa1,2,3,4,5, 6 , 7. una de las muchas aplicaciones de CRISPR/Cas9 es la introducción (a través de reparación (HDR) de la homología dirigida) de grandes secuencias exógenas como GFP en loci genómicos específicos que luego sirven de reporteros para la actividad de un gen o proteína producto8 . Esta técnica puede utilizarse para unirse a una secuencia de la proteína fluorescente a un marco de lectura abierto endógeno donde la proteína resultante de la fusión endógeno regulado puede ser utilizada para visualizar la localización subcelular y la dinámica de la proteína de interés5 ,6,9,10,11. Mientras que proteínas endógeno etiquetas ofrecen muchas ventajas en comparación con la sobreexpresión sistemas, introduciendo grandes secuencias en el genoma humano es un proceso ineficiente, por lo general exigen una selección o una estrategia de enriquecimiento para obtener una población de células que puede ser fácilmente estudiados5,12.

Este protocolo describe la inserción de una secuencia de ADN que codifican una proteína fluorescente (FP) en un locus genómico deseado. El protocolo incluye diseño y entrega del plásmido de la plantilla de donante y el complejo ribonucleoproteína (RNP) (proteína de tipo salvaje S. pyogenes Cas9 combinada con ARN sintético de CRISPR (crRNA) y activación de trans crRNA (tracrRNA)). También se describe es el enriquecimiento de células supuestamente editados vía celular de fluorescencia activada (FACS) de clasificación y el proceso de generación de línea clonal de la célula. Hasta la fecha, se ha utilizado este método para generar líneas hiPSC con monoallelic o etiquetas (raramente) bi-alélicos proteína verde fluorescente (GFP) etiquetado 25 proteínas que representan estructuras celulares principales. Las células editadas resultantes de estos esfuerzos se han confirmado la inserción genética esperada, expresar una proteína de fusión localizar correctamente, y mantener la pluripotencialidad y un cariotipo estable12 (y datos no publicados). Este método también se ha utilizado para generar múltiples otro single y dual (dos proteínas diferentes etiquetadas en la misma célula) editan poblaciones de hiPSCs (datos no publicados).

IPSCs humanos derivados de un donante sano fueron elegidos para estos esfuerzos de edición del genoma porque, a diferencia de muchas líneas de celulares convencionales, son diploides, karyotypically estable, no transformado y proliferativa. Estas propiedades proporcionan un modelo atractivo para estudiar la biología de la célula fundamental y el modelado de la enfermedad. Además, el potencial de diferenciación de hiPSCs proporciona la oportunidad de estudiar varias etapas del desarrollo en paralelo a través de diversos linajes y tipos celulares utilizando células isogénicas incluidos organoides, tejidos y modelos de la “enfermedad en un plato”13 ,14,15. Aunque este protocolo fue desarrollado para hiPSCs (línea WTC), puede ser informativo para el desarrollo de protocolos con otras líneas de células de mamífero.

Protocol

1. in Silico diseño de crRNA y donantes plantilla de plásmido para FP Knock-in Obtener la secuencia de referencia anotado de NCBI16 o el Browser del genoma de UCSC17 (p. ej., formato GenBank) del gen de interés e importarlo en un software de Bioinformática de la opción. Si se conoce la secuencia del genoma del anfitrión para contener variantes en relación a la referencia, se incluyen las ahora a ajustar la secuencia de referencia en el software de Bioinformática (ver discusión). Localizar el sitio de inserción de punto de congelación deseado. Para etiquetas de C-terminal, se introducirá la secuencia para la etiqueta de punto de congelación entre la base última de la último codón y la primera base del codón de parada. Para el N-terminal de etiquetado, la secuencia para la etiqueta FP se introducirán generalmente entre la base pasada del codón de inicio y la primera base del codón siguiente. En algunos casos, como cuando el codón de inicio es un exón codón solo, o donde existe una secuencia de la señal cerca de la terminal de la proteína, el sitio de inserción de FP deseado podrá estar situado en una posición 3ʹ más, lo sigue siendo en el marco. Uso 50 bp a cada lado del sitio de inserción deseada como la secuencia de entrada para cualquier herramienta de diseño de crRNA disponible para el público. Una vez que se identifican objetivos de crRNA de 2-4 cerca del sitio de inserción, anotar los sitios de Unión crRNA y secuencias adyacentes de protospacer de adorno (PAM) (NGG) en el software de Bioinformática. Estos crRNAs se utilizará para inducir roturas trenzados doble (véase la discusión para más orientación sobre el diseño de crRNA).Nota: Secuencias de crRNA de aduana pueden presentarse para síntesis con un vendedor comercial (recomendado), o la secuencia puede utilizarse como punto de partida para diseñar una estrategia de síntesis de clonación o in vitro , que está fuera del alcance de este protocolo (ver discusión ). Para iniciar el plásmido de la plantilla de donantes, utilice 1 kb de secuencia río arriba del sitio de inserción deseada como el brazo de homología 5ʹ (debe incluir el codón de inicio para las inserciones de la N-terminal) y 1 kb de secuencia corriente abajo del sitio de inserción deseada como la 3ʹ brazo de homología (deberá incluir el codón para inserciones c-terminal). Bases entre los dos brazos de homología son típicamente no se omite. Incluyendo variantes específicas de la línea celular en los brazos de homología conservará estas variantes genéticas en las células editadas resultantes. Entre los dos brazos de homología, inserte la secuencia de la FP (u otra secuencia de knock-in) y la secuencia de la máquina para hacer chorizos (ver la discusión para más orientación sobre enlazadores). Etiquetas N-terminal, la secuencia de vinculador debe ser directamente 3ʹ de FP; para etiquetas de terminal C, la secuencia de vinculador debe ser directamente 5ʹ de la FP. Interrumpir crRNA sitios de Unión en el plásmido de la plantilla de donante para evitar corte de Cas9 de secuencia donante (ver discusión de consideraciones cuando se alteran los sitios de unión de crRNA). Si es posible, la interrupción de la PAM a una secuencia que no sea NGG o NAG es preferida. Como alternativa, introducir mutaciones de punto en tres bases en la región de la semilla de la crRNA (proximal al PAM 10 bases) predice suficientemente interrumpir enlace crRNA. Algunos sitios de Unión crRNA se interrumpen por la introducción de la secuencia de la FP en el plásmido de la plantilla de donantes; Asegúrese de que no PAM, o la región de Unión intacto todavía existe en estos casos.Nota: In silico plásmido plantilla de donantes puede presentarse para síntesis de gene por un proveedor comercial, o puede ser utilizado como punto de partida para diseñar una estrategia de clonación, que está fuera del alcance del presente Protocolo. Una columna vertebral simple pUC19 como pUC57 es suficiente. 2. ribonucleoproteína (RNP) transfección para CRISPR/Cas9 mediada Knock-in en hiPSCs Nota: En este protocolo, el término ‘gRNA’ describe crRNA sintético y tracrRNA correctamente suspende de nuevo, cuantificado y pre-complejado por las instrucciones del fabricante (véase Tabla de materiales). Completar todos los medios con 1% penicilina estreptomicina. Pautas generales de cultivo de la línea de hiPSC WTC se describen más detalladamente en el explorador del celular de Allen18,19. HiPSCs WTC se utilizan en el presente Protocolo, pero con la optimización adecuada de la transfección, electroporación de RNP y plásmido de plantilla de donantes puede ser adaptado con éxito a otros tipos celulares. Preparar acciones de trabajo de 10 μm de gRNA y tipo salvaje S. pyogenes Cas9 proteína2,20; mantener en hielo. Preparar 1 μg/μl trabajo stock de plásmido de la plantilla del donante; mantener a temperatura ambiente (RT). Utilice el tampón de pH 8.0 TE para todas las diluciones. Preparar una placa de cultivo de tejidos 6 bien recubiertos por la matriz con 5 mL de medio fresco crecimiento suplementado con inhibidor de roca 10 μm (Ri) por pozo. Mantenga la placa con los medios de comunicación en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO2 hasta que esté listo a las células de la placa después del procedimiento de transfección (máximo 2 h).Nota: Todas las placas de recubrimiento de matriz utilizadas en este protocolo se realizan mediante la adición de que un volumen de helado Matrigel diluido 1:30 en frío medio DMEM/F12 según el Instituto Allen para el protocolo de la ciencia celular para el cultivo de la WTC hiPSC línea19. Mediante un reactivo de disociación sola célula suave como se recomienda en la Tabla de materiales, de paso hiPSCs en unicelulares suspensión y conteo de las células utilizando un contador de células automatizado o hemocitómetro.Nota: Un protocolo detallado para el WTC hiPSC línea aquí se puede encontrar en el explorador del celular de Allen19. Brevemente, lave las células una vez con RT DPBS y tratar con reactivo de disociación durante 3-5 minutos. Entonces triturate células en suspensión unicelular por pipeteo suave y de pellets por centrifugación. Resuspender el precipitado de células vivas en medios de cultivo suplementados con 10 μm Ri. Preparar una alícuota de 1.84 x 106 células para cada condición experimental a ser transfectadas en tubos separados 1,5 mL.Nota: Todos los volúmenes se calculan para un volumen de reacción total 4.5 μL en un volumen de 100 μl electroporación, veces 2,3 reacciones. Este representa el duplicado de la transfección y exceso por error de pipeteo. Preparar los ribonucleoproteína (RNP) complejo tubos para cada condición experimental añadiendo 2.88 μl de 10 μm gRNA y 2.88 μl de 10 μm Cas9 a un tubo de 1,5 mL. Incubar a temperatura ambiente durante un mínimo de 10 minutos (máximo 1 h). Pellet uno célula alícuota (preparada en el paso 2.3.1) 211 x g durante 3 min a RT. aspirar sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 220 μl de buffer de electroporación del fabricante. Añadir 220 μl resuspendido células de paso 2.5 a 1.5 mL RNP complejo tubo preparado en el paso 2.4. Añada 4.60 μL del plásmido de plantilla 1 donante μg/μl al tubo de 1,5 mL preparado en el paso 2.4. Utilice la punta nucleofection y pipeta para mezclar el contenido del tubo 2 – 3 veces, luego transferir 100 μl de la suspensión para el aparato de electroporación preparado. Evitar la introducción de burbujas en la punta. 1300 V por 1 pulso de 30 ms se aplica. Transferir suavemente la suspensión en la placa de 6 pozos preparada de paso 2.2 con un movimiento de remolino. Dispersar las células moviendo suavemente la placa de lado a lado y frente a la parte posterior. Usando una punta nueva de nucleofection, repita los pasos 2.8-2.9 con los restantes 100 μl de la suspensión y transferencia en un segundo pozo de la placa 6-bien preparado. Repita los pasos 2.4 a través de 2.10 por cada gRNA y donantes plantilla plásmido combinación, gRNA no metas, plásmido de plantilla de donantes sólo y controles único tampón. Tenga cuidado al cambiar de pipeta y nucleofection consejos para evitar la contaminación cruzada. Incube las células transfected a 37 ° C y 5% CO2. Cambiar los medios de comunicación a los medios de crecimiento regular (no Ri) a las 24 h y continúe alimentando hiPSCs cada 24 h durante 72-96 h, confluencia de monitoreo. Cuando hiPSCs alcanza 60-80% de confluencia, proceda al paso 3.Nota: Muerte de las células pesado (> 70%, estimado) es normal 24-48 h después de transfección. 3. enriquecimiento de FACS de hiPSCs supuestamente editado Nota: Al ordenar las células madre, adaptar parámetros fijados del instrumento para promover la supervivencia celular como se sugiere en la discusión. Brevemente, utilice la boquilla más grande posible (130 μm), un caudal bajo (≤ 24 μl/min), fluido de vaina y sin conservantes (como solución salina, véase Tabla de materiales) y muestra bajo presión (10 psi). Antes de comenzar un experimento de FACS, cambiar los medios de comunicación a medios de cultivo suplementados con 10 μm Ri e incubar las células a 37 ° C y 5% CO2 para 2-4 h para promover la supervivencia después de FACS. Utilizando un reactivo de disociación sola célula suave como se recomienda en la Tabla de materiales, hiPSCs pasaje en suspensión unicelular en medios de cultivo suplementados con 10 μm Ri19. Filtrar suspensión hiPSC con filtro de malla de 35 μm en tubos de poliestireno fondo redondo. Ordenar las células mediante dispersión hacia delante y la dispersión de lado (incluyendo la altura y anchura) desechos y dobletes. Uso directo, búfer sólo controlar células para configurar la puerta de la FP-positivos, tales que < 0.1% de las células sólo buffer caen dentro de la puerta. Ordenar toda la población de FP-positivas las células en un tubo de polipropileno de 1.5-15 mL que contiene 0.5-2 mL de medio de crecimiento RT complementado con el μm 10 Ri.Nota: Polipropileno reduce la posibilidad de la adhesión celular al plástico. Centrifugar las células colectadas a 211 x g durante 3 min a TA. Cuidadosamente aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 200 μL de medio de crecimiento suplementado con 10 μm Ri. Traslado hasta 3.000 células ordenadas a un único pozo de una placa de 96 pocillos recubiertos de matriz fresca19.Nota: Con la instalación del instrumento adecuado, las células pueden también ordenarse (a granel) directamente en un único pozo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos recubiertos por la matriz que contiene 200 μL de medio de crecimiento suplementado con 10 μm Ri a una densidad recomendada de 1.000-3.000 células por pocillo para hiPSC. Incube las células clasificadas en 37 ° C y 5% CO2. Cambiar los medios de comunicación a medios de cultivo suplementados con 5 μm Ri a las 24 h. A las 48 h comenzar alimentación medios de crecimiento normal de las células (no Ri) cada 24 h durante 72-96 h, confluencia de monitoreo. Supervivencia después de FACS se estima superior al 50% si un mínimo de 500 células se siembra en un pozo de una placa de 96 pocillos. Cuando hiPSCs llegar a 60-80% de confluencia y muestran morfología maduro (centros de Colonia suave, bien empaquetado), paso en una placa de formato grande como un plato 24-well, luego de una placa de 24 pocillos en una placa de 6 pozos. Cuando hiPSCs en una placa de 6 pozos llegar a 60-80% de confluencia y mostrar madurez morfología, ampliar a una placa de 100 mm, volver a la placa para imágenes, criopreservar o semilla de en clon cosecha densidad (paso 4)19. 4. generar supuestamente editado Clonal hiPSC líneas Mediante un reactivo de disociación sola célula suave como se recomienda en la Tabla de materiales, pasajes hiPSCs en suspensión unicelular y determinar el número de células por mL19. Células de semilla 10.000 de la población corregida de hiPSCs en un plato de cultivo de tejidos frescos recubiertos de matriz 100 mm utilizando medios de cultivo suplementados con 10 μm Ri19. Cambiar los medios de comunicación a medios de cultivo sin Ri 24 h después de la siembra y alimentación hiPSCs con medios de cultivo frescos cada 24 h durante 5-7 días. Cuando hiPSCs han formado colonias que son visibles macroscópicamente (aproximadamente 500 μm) son suficientemente grandes como para ser aislado. Preparar una placa de 96 pocillos recubiertos de matriz matriz exceso de aspiración y añadiendo 100 μl de medio de crecimiento suplementado con 10 μm Ri por bien19. En una pipeta de uso un P-200 microscopio disección, o similar, para raspar suavemente y aspirar las colonias individuales de la superficie de la placa. Volumen de transferencia (~ 20-100 μL) que contiene la Colonia a un único pozo de la placa de 96 pocillos preparado en el paso 4.3. Después de todas las colonias han sido transferidas, Incube la placa en una incubadora de cultivo de tejidos a 37˚C y 5% CO2. Cambiar los medios de comunicación a los medios de crecimiento regular (no Ri) a las 24 h y seguir alimentando las células cada 24 h durante 72-96 h hasta colonias aproximadamente se han triplicado en tamaño (aproximadamente 1500 μm).Nota: Escoger 24-96 colonias por crRNA utilizado en la transfección se recomienda. Supervivencia de los clones aislados es mayor a 95%. Utilizando un reactivo de disociación sola célula suave como se recomienda en la Tabla de materiales, pasaje hiPSC clones en una nueva placa de 96 pocillos recubiertos por la matriz siguiente19. Utilizando un aspirador de 8 canales, quitar y desechar el medio de la primera columna de la placa de 96 pocillos. Usando una pipeta multicanal P-200, añadir ~ 200 μL de DPBS a la primera columna de la placa de 96 pocillos para lavar las células. Utilizando un aspirador de 8 canales, retire y deseche la DPBS lavado de la primera columna de la placa de 96 pocillos. Usando una pipeta multicanal P-200, agregar 40 μl de reactivo de disociación a la primera columna de la placa de 96 pocillos. Repita los pasos 4.5.1-4.5.3 para hasta un total de seis columnas de la placa de 96 pocillos, cambiar puntas para asegurarse no Cruz-contaminar pozos. Colocar la placa en la incubadora de 37 ° C durante 3-5 minutos desde el momento en que se agregó el reactivo de disociación a la primera columna (paso 4.5.3).Nota: Se recomienda sólo paso un máximo de 6 columnas (48 pozos) a la vez por el tiempo que toma realizar estos pasos. Cuando se realiza este protocolo por primera vez, empezar con solo pases una o dos columnas a la vez. Limitar el número de columnas pasados al mismo tiempo asegura que las células no se queden en el reactivo de disociación durante demasiado tiempo, que puede ser perjudicial a hiPSCs. Cuando las células de la primera columna de la placa han comenzado a levantar la parte inferior de la placa, utilice una pipeta multicanal P-200 agregar 160 μl de DPBS a la primera columna de la placa de 96 pocillos y triturate suavemente las células en las “12:00” , “3:00”, “6:00” y “9:00” posiciones de cada pozo. Transferir todo el volumen de suspensión celular (200 μL) a una placa de 96 V-fondo-bien. Repita el paso 4.5.5 para las columnas restantes de células que tienen reactivo de disociación cambiar sugerencias en cuanto a no Cruz-contaminar pozos. Girar la placa V-inferior en una centrifugadora a 385 x g durante 3 min a TA. Usando una pipeta multicanal P-200, quite con cuidado el sobrenadante y resuspender las células en 200 μL de medio de crecimiento fresco complementada con el μm 10 Ri por pozo. Repita para todos los pozos, cambio de consejos en cuanto a no contaminar de Cruz. Transferencia de la suspensión celular a una placa de 96 pocillos recubiertos de matriz fresca19. Incube la placa en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C y 5% CO2. Cambiar los medios de comunicación a los medios de crecimiento regular (no Ri) a las 24 h y seguir alimentando las células cada 24 h durante 72-96 h, hasta que la mayoría de los clones llega a 60-80% de confluencia.Nota: Este paso ayuda a difundir las células y permiten mayor crecimiento en toda la zona de la placa de 96 pocillos. Clones de observar e identificar una relación de split apropiado para cada clon individual en la placa de 96 pocillos (p. ej., 1:10 o 1:8). Mediante un reactivo de disociación sola célula suave como se sugiere en la Tabla de materiales, pasaje hiPSC clones en una nueva matriz recubierta placa de 96 pocillos (medidas 4.5.1-4.5.8) transferir una proporción de la suspensión de células apropiada para cada clon. Incube la placa en una incubadora de cultivo de tejidos a 37˚C y 5% CO2. Cambiar los medios de comunicación a los medios de crecimiento regular (no Ri) a las 24 h y seguir alimentando las células cada 24 h durante 72-96 h, hasta que la mayoría de los clones llega a 60-80% de confluencia y muestra morfología maduro.Nota: Cada clon puede tienen una relación de split diferentes debido a la tasa de crecimiento ligeramente diferente o supervivencia del paso anterior, por lo que este pasaje ayuda a normalizar el número de células por pocillo de cada clon para el congelación paso a seguir. Debido a las diferentes tasas de supervivencia y crecimiento, algunos clones pueden cubran o no crecer durante estos pases pasos. Guardar el resto de la suspensión celular y pellets para el aislamiento del gDNA por centrifugación las células en una placa de 96 V-inferior-bien en 385 x g durante 3 min a RT. eliminar sobrenadante y proceder al aislamiento del gDNA usando un kit de 96 pocillos o almacenar placa de células concentradas en – 20 ° c por hasta thr semanas de EE. 5. crioconservación de líneas de células clonales en formato placa de 96 pocillos Mediante un reactivo de disociación unicelular, pasaje hiPSC clones como describieron anteriormente (medidas 4.5.1-4.5.7). Aspirar el sobrenadante con una pipeta multicanal P-200 y vuelva a suspender en 60 μL de medio de crecimiento suplementado con 10 μm Ri. Repita para todos los pozos; cambiar sugerencias en cuanto a no contaminar de Cruz. Transferencia 30 μl de la suspensión celular a una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos recubiertos no matriz. Entonces rápidamente añadir 170 μl buffer de congelación (véase Tabla de materiales) a cada pozo, sin mezclar. Repetición por transferir los restantes 30 μl de la suspensión a una hermana la placa y agregar 170 μl congelación del almacenador intermediario.Nota: Este proceso se realiza en hermana duplicada placas de modo que existe una población de back-up de células después de descongelar una de las placas individuales. Poner las células cryopreserved en solamente cada otra columna de una placa de 96 pocillos permite descongelar más rápido (paso 5.6). Envolver la placa con parafilm y coloque en una caja de espuma de poliestireno de RT con tapa. Colocar el conjunto en un congelador de-80 ° C. Después de 24 h placas pueden ser transferidas fuera de la caja de la espuma de poliestireno y almacenadas a – 80˚C por hasta cuatro semanas.Nota: Mientras que las células se almacenan temporalmente a-80 º C, ensayos de control de calidad genética se pueden realizar con gDNA extraída de las células obtenidas en el paso 4.6.1 para identificar los clones para descongelar y propagar más lejos, como discutido en trabajos previamente publicados 12. brevemente, un copia número gota digital análisis de PCR puede utilizarse para identificar clones que contienen uno o dos ejemplares de GFP y sin integración de columna vertebral plásmido donante plantilla. Una combinación de análisis PCR de punto final y Sanger secuenciación pueden entonces identificar clones que contienen una inserción precisa. Para descongelar, llevar toda la placa a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos, mirando cuidadosamente para que las pelotillas de hielo derretir. Pozos en el borde de la placa tienden a descongelar primero. Cuando se derrite la pelotilla del hielo del clon deseado, suavemente la transferencia entera 200 μl a un tubo cónico de 15 mL que contiene 3 mL de medio de crecimiento RT suplementado con 10 μm Ri y centrifugar a 211 x g durante 3 min a TA. Aspirar el sobrenadante y resuspender pildoradas células en 1 mL de medio de crecimiento RT complementado con el μm 10 Ri. Transferencia a una placa de 24 pocillos recubiertos de matriz fresca e incubar a 37˚C y 5% CO2. Cambiar los medios de comunicación a los medios de crecimiento regular (no Ri) a las 24 h y seguir alimentando las células cada 24 h durante 72-96 h hasta que el clon llega a 60-80% de confluencia y morfología madura19.

Representative Results

El objetivo de este experimento fue fusible mEGFP (monomeric GFP mejorada) a la proteína lamin nuclear del B1 al introducir la secuencia de mEGFP al final 5ʹ de los genes LMNB1 (N-terminal de la proteína). Un enlazador (secuencia de aminoácidos SGLRSRAQAS) fue elegido en base a construcciones anteriores de cDNA de la colección de proteína fluorescente Michael Davidson21. Porque la región de unión de crRNA en el plásmido de la plantilla de donantes para cada crRNA del candidato fue interrumpida después de la inserción en silico de mEGFP y la secuencia de vinculador, ningunas mutaciones de punto debía ser alterar el potencial reconocimiento de crRNA y escote por Cas9 de la secuencia del donante (figura 1). La secuencia de la donante contenía armas de homología de 1 kb que flanquean ambos extremos de la secuencia mEGFP-linker. La resultante 2.734 bp de DNA fue clonado en un backbone pUC57, secuencia verificada, y el plásmido resultante de plantilla de donantes se purificó mediante una preparación libre de endotoxina maxi. El plásmido de plantilla de donantes y complejo RNP fueron transfectadas, células supuestamente editadas se enriquecieron, y la localización de la proteína de la fusión nuclear mEGFP de lamin B1 fue confirmada por microscopía de fluorescencia (figura 2). Sólo los resultados de la transfección de crRNA1 se describen aquí, aunque ambas secuencias crRNA producción poblaciones supuestamente editado12. En comparación con el control negativo, que no contuvo ningún gRNA, proteína Cas9 o plásmido de plantilla de donantes en la reacción de electroporación (sólo tampón), el crRNA1 LMNB1 transfectadas las células contuvieron 0,95% células de mEGFP-positivo que representa supuestamente editado mEGFP-nuclear lamin B1 población (figura 3a). Este resultado estaba dentro de la gama de las knock-in eficiencias observadas a través de muchos loci genómicos utilizando este método, previamente divulgados12. Las células mEGFP-positivas fueron aisladas por FACS y reflejadas por microscopia vivo para confirmar la localización prevista de la mEGFP nuclear lamin B1 proteína de la fusión de la envoltura nuclear. Después de enriquecimiento de la FACS, aproximadamente el 90% de las células ordenadas de la población de crRNA1 LMNB1 fueron mEGFP-positivo (según lo determinado por microscopía), lo que sugiere que algunas células de mEGFP-negativo Co purificadas con las células GFP-positivas durante el procedimiento de clasificación. Este fue un aceptable nivel de enriquecimiento que permitió la cosecha de 96 clones que podría entonces ser genéticamente para la edición de éxito. Generalmente, un atajo para el enriquecimiento de éxito es 50% positivo GFP. La mayoría de la población de células clasificadas muestra fluorescencia en la envoltura nuclear (nuclear periferia) en células nondividing y a una lámina nuclear extendido en el citoplasma durante mitosis proporcionando la confianza en el correcto genómica edita en el LMNB1 lugar geométrico. La población enriquecida contiene células con señal brillante o tenue. Esta diferencia en la intensidad de la señal puede reflejar una combinación de correcto e incorrecto editar los resultados y destaca la utilidad de generar una línea clonal genéticamente validada por otros estudios (ver discusión) (figura 3b)12. Generación de línea clonal, genéticamente validado las células demostradas intensidad uniforme de la GFP en experimentos de microscopía (Figura 3C). Figura 1 . Diseño estrategia para el N-terminal GFP marcado de genes LMNB1. La etiqueta GFP fue diseñada para 5ʹ de inserción del N-terminal del primer exón de LMNB1 localizado en el cromosoma 5. 5ʹ y 3ʹ homología brazos son 1 kb y la reunión entre el codón de inicio (ATG) y el segundo codón (brazos de homología sólo parcialmente representados en la figura). Dos candidatos crRNAs fueron diseñados para guiar Cas9 hender como cerca del sitio de inserción previsto como posible, sin dejar de ser única en el genoma. Secuencia de mEGFP y un enlazador de aminoácidos fueron insertados solo 3ʹ del codón de inicio (secuencia mEGFP y el vinculador no a escala). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2 . Flujo de trabajo para la producción endógena con la etiqueta líneas clonales hiPSC. Componentes de la transfección, incluyendo el complejo RNP Cas9/crRNA/tracrRNA (se muestra como roja proteína Cas9 con crRNA de oro y púrpura tracrRNA), el plásmido de la plantilla de donante que contiene los brazos de homología (tiene, se muestra en oro) y FP + secuencia de vinculador (mostrado en verde), fueron electroporated. Después de 4 días, las células positivas de FP supuestamente editado fueron enriquecidas por FACS y ampliadas como una población de siembra todas las células ordenadas en un único pozo de una placa de 96 pocillos (~ 1.000 células) y luego amplió en cultura hasta una población de varios millones las células podrían ensayarse como la “población enriquecida” (ver protocolo paso 3.8). El rendimiento de las células positivas de FP diferencia por experimento de debido a las tasas variables de HDR12; un enriquecimiento exitoso puede incluir típicamente ~ 300-5.000 células después de transfección de aproximadamente 1.6 x 106 caderas. Estudios preliminares de proyección de imagen confirmaron la señal y la localización de la proteína de fusión en la población enriquecida. Las colonias fueron seleccionadas manualmente en una placa de 96 pocillos para la expansión y criopreservación. Más detección genómica de control de calidad utilizando gota digital PCR (ddPCR) y otros ensayos basados en PCR entonces fue utilizado para identificar clones correctamente editados, como se describió anteriormente12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3 . Enriquecimiento de poblaciones celulares supuestamente editado. (A) parcelas de citometría de flujo de la LMNB1 editado transfección después de cuatro días de las células. El eje y muestra la intensidad de la GFP y el eje x muestra dispersión hacia adelante. Puertas de clasificación se establecieron en función del control sólo buffer. Desde hiPSCs son sensibles a la perturbación, live/dead mancha fue omitida y una puerta muy conservador de FSC/SSC fue utilizada en su lugar. (B) después de enriquecimiento, la población de Cr1 LMNB1 editado las células demostradas ~ 90% de células con GFP localizar a la envoltura nuclear (esperado LMNB1 localización). La población contenía células de distinta intensidad GFP, así como algunas células GFP-negativo. Barras de escala son 10 micrones. (C) generación de línea clonal, las células demostraron una intensidad uniforme de la GFP, con algunas diferencias dependientes del ciclo celular. Barra de escala es de 20 micras.

Discussion

El método presentado aquí para generar endógenamente regula fusiones de la proteína fluorescente en hiPSCs es un enfoque versátil y potente para la generación de líneas celulares de gene editado con aplicaciones que van desde la proyección de imagen de células vivas a diversos estudios funcionales y ” modelos de la enfermedad en un plato”usando derivados del paciente hiPSC líneas13,14,15. Mientras que este método ha sido utilizado para introducir grandes etiquetas FP a N – o C-terminal de proteínas endógenas, potencialmente podría utilizarse para introducir otras etiquetas o pequeños cambios genéticos a modelo o correcto el enfermedad-causar mutaciones22,23 . Para rellenos pequeños, puede reducirse el tamaño del brazo de homología, pero el enfoque general a la edición en este método puede aplicar24,25. Mientras que el uso de hiPSCs se recomienda por su gran utilidad, con cuidado de optimización, este protocolo puede adaptarse para editar los genomas de otras líneas de células de mamífero.

Hora de identificar un gen de interés para el etiquetado FP, estimaciones de abundancia de la transcripción (de microarrays o datos de RNA-Seq) es un buen punto de partida para evaluar si se expresa un gen o isoforma de interés, aunque los niveles de transcripción no siempre se correlacionan con niveles de proteína. La estrategia de enriquecimiento FACS descrita aquí funcionará mejor para los genes que se expresan por lo menos moderadamente bien en el tipo de la célula de interés. Esta estrategia ha tenido éxito en la selección para fusiones que muestran patrones de punteado o discreta localización como centrin, desmoplaquina y paxillin donde la relación señal a fondo es muy bajo12,19. Genes que muy no se expresan o se expresan únicamente en tipos celulares derivados pueden requerir estrategias de selección adicional.

El punto de partida para crRNA y donantes plasmid plantillas utilizadas en líneas celulares humanas debe ser el genoma humano de referencia (GRCh38). Dado que los genomas de diferentes líneas celulares pueden variar de la misma especie, y porque CRISPR/Cas9 es específica de secuencia, es muy útil identificar variantes específicas de la línea de la célula (polimorfismos de nucleótido único o inserciones/deleciones (indels)) difiere del genoma de referencia e incorporar en el diseño. Esto asegura que crRNAs será compatible con el genoma del anfitrión y que los brazos de homología plásmido donante plantilla conservará las variantes específicas de la línea celular. Es una estrategia sugerida incorporar variantes homocigóticas en brazos de homología de plásmido de plantilla de crRNAs y donantes durante el proceso de diseño. La incorporación de variantes heterozigóticas es opcional. Los reactivos específicos utilizan para gran knock-en experimentos y otras consideraciones principales de este protocolo se discuten a continuación.

Proteína de Cas9

El principal beneficio de usar proteína Cas9 es que introduciendo la Cas9 y gRNA como una complejo RNP se ha demostrado para dar lugar a una duración limitada de la actividad de nucleasa comparado con enfoques basados en el plásmido donde expresión de la Cas9 y gRNA puede continuar por días y conducir a mayor en y fuera del objetivo actividad26,27. Un beneficio adicional de usar proteína Cas9 es que está disponible para unirse una vez dentro de las células. Esto contrasta con los métodos más convencionales de Cas9 mRNA o plásmido Cas9/gRNA que requieren transcripción, traducción y procesamiento26,28la proteína. Wildtype S. pyogenes Cas9 proteína ya está disponible de muchas fuentes comerciales.

Guía de ARN

Hay muchas herramientas disponibles para la búsqueda de objetivos de crRNA cerca del sitio de inserción deseado de FP que tienen cero o pocos predicha de-objetivos en el anfitrión genoma29,30,31,32. Eficiencias en HDR y la precisión de los resultados HDR varían ampliamente entre los objetivos de la crRNA en un locus dado12. Por este motivo, prueba varios crRNAs (2-4 y preferentemente dentro de 50 bp del sitio de inserción deseada) por locus se recomienda ya que esto puede aumentar la probabilidad de que un exitoso experimento de edición. Posibilidades actuales para la entrega de gRNA incluyen sintética parte 2-crRNA y tracrRNA, gRNAs solo sintético (sgRNAs), en vitro transcribe sgRNAs, o la entrega de un plásmido a las células que expresan lo sgRNA de un promotor U6. Este protocolo no fue optimizado para actividad de escote alto. Sin modificar parte 2-crRNA y tracrRNA (véase Tabla de materiales) fueron utilizados con el objetivo de generar líneas de células mono-alélica FP-agregó mientras causando la perturbación menor potencial a las células.

Plásmido de plantilla de donantes

Porque algunos de la homología del brazo secuencia siempre en el donante plásmidos de la plantilla se incorporarán en el genoma del anfitrión durante el evento HDR, mutaciones de punto a los sitios de reconocimiento de crRNA deben introducirse para evitar más escote por Cas9 después de HDR. Muchas veces el simple cambio disruptivo es mutar la secuencia de PAM. Ya que algunas secuencias no-canónico de PAM todavía pueden ser reconocidos por tipo de salvaje Cas9 de S. pyogenes , es mejor evitar el uso de NGG, NAG o NGA33. Cuando mutando el brazo de homología, evitar las mutaciones no sinónimas y la introducción de codones raros. Si no es posible un cambio sinónimo a la secuencia de PAM, considerar tres sinónimas mutaciones de punto en la región de la semilla (10 bp proximal a PAM) del sitio de Unión crRNA. Debe tener extremo cuidado al hacer estos cambios en la región no traducida (UTR) de 5ʹ, puesto que estas regiones pueden contener secuencias reguladoras importantes. Consultar una base de datos de conservación genética tales como pistas de genómica comparativa de navegador de genoma de UCSC pueden orientar en estos casos, como cambios a las bases no conserva pueden tolerarse mejor que cambia a bases altamente conservado17. A veces la mera inserción de la secuencia FP es suficiente para alterar el sitio de unión de crRNA (como en la figura 1); sin embargo, debe revisarse la secuencia recién anexada para la persistencia de crRNA vinculante y secuencias de PAM.

Enlazadores de aminoácidos entre la FP y la proteína nativa se recomiendan conservar la función de la proteína de fusión34. A menudo un vinculador del aminoácido puede ser elegido por su particular carga o tamaño. Si una fusión de cDNA con un diseño similar a la específica endógena proteína de fusión se ha estudiado bien, que la misma secuencia de vinculador puede utilizarse para CRISPR/Cas9 knock-in experimento12,19. Si dicha información está disponible, un enlazador corto como GTSGGS también ha sido utilizado con éxito12. Otros estudios han demostrado éxito con una secuencia de vinculador ácido 3-amino pequeño genérico para una variedad de objetivos35.

Transfección y el enriquecimiento de la FACS

Muchos reactivos de transfección comercialmente disponibles están formulados para la entrega de ciertos tipos de moléculas a las células, mientras que un sistema de electroporación puede utilizarse para proporcionar reactivos con una amplia gama de composición, tamaño y carga. Además de ser un método común de transfección para duro para transfectar células como hiPSCs, electroporación también conlleva el beneficio de entrega de los tres componentes para FP CRISPR/Cas9-mediada knock-in como se describe en este método. Electroporación fue encontrada para producir los mejores resultados en comparación con otros reactivos disponibles en el mercado en el desarrollo de este método (datos no mostrados) y también ha sido utilizado por otros para RNP entrega26,28,36 .

Cuando se utiliza este protocolo para la edición hiPSCs, especial debe tener cuidado para asegurar un manejo suave de las células antes y después del gene de la edición de proceso para la supervivencia celular óptima y mínima diferenciación espontánea. En particular, los métodos de enriquecimiento FACS deben adaptarse para la clasificación de las células madre mediante el uso de la boquilla más grande posible (130 μm), una baja tasa de flujo (≤24 μl/min), fluido de vaina sin conservantes (como solución salina, véase Tabla de materiales) y muestra bajo presión (10 bar). En lugar de sola celda de clasificación, que da como resultado subóptimo viabilidad en células madre, el FACS enriquecido hiPSCs son ordenados a granel y ampliados como una población para optimizar integridad celular viabilidad y célula de vástago. Sin embargo, clasificación de la célula puede ser apropiado para menos tipos de células sensibles. Para promover la supervivencia celular, las células son volvió a cultura no más de una hora después de la cosecha para el enriquecimiento del FACS y mantenerse a temperatura ambiente durante el proceso de clasificación. Para algunos tipos de células, también puede mejorar supervivencia de la célula por incubación de las células en hielo (4° C) durante todo el proceso de clasificación.

La expansión masiva de células positivas de FP ofrece una oportunidad para evaluar la población de análisis para la localización de la proteína de fusión antes de generar líneas clonales. Mientras que la población enriquecida resultante de células puede ser suficiente para algunos estudios, estas poblaciones con frecuencia Mostrar señal de FP de intensidad variable. Las líneas clonales aisladas tienen señal uniforme (figura 3), lo que los hace más apropiados para experimentos funcionales12.

Generación de línea clonal de la célula

A lo largo del edición y clonal línea proceso de generación, es importante controlar la morfología de la célula. hiPSC colonias cultivadas en condiciones libres de alimentador deben exhibir bordes lisos y un centro bien lleno, incluso12,18,19. Deben observarse las células diferenciadas en menos del 5% de la cultura. Al escoger colonias individuales, elegir aquellos exhiben buena morfología. En la placa de 96 pocillos pases a eventos, ver clones de morfología y deje de aquellos que han invadido ya que podría conducir a la diferenciación o ser un indicio de inestabilidad genética.

Generación de líneas celulares clonales permite la confirmación genética de edición precisas, que es importante porque Cas9 inducido de doble cadena se rompe en el genoma son a menudo reparado impreciso a pesar de la incorporación de la etiqueta en el lugar deseado. Ensayos de PCR previamente descritos mostraron que acumulativamente en diez lugares geométricos genomic únicos muchos (45%) de los clones expresando su punto de congelación sufrida de la integración de columna vertebral de plásmido donante en el lugar geométrico del objetivo o (raramente) al azar en el genoma12. Además, clones de 23% de GFP-positivas (n = 177) en loci únicos diez fueron encontrados para abrigar mutaciones en o cerca del sitio de corte de crRNA esperado en el alelo sin etiquetar, probablemente debido a NHEJ12. Este análisis genético de muchas líneas clonales (~ 100 clones/edit) subrayaron la importancia de la validación genética que no es posible en una población celular desde FP-expresión y localización de la proteína de fusión prevista solo no garantizan la precisa edición12 . Además, estos ensayos basados en PCR no se puede realizar en una población enriquecida de células con certeza, justificando la necesidad de generación de línea clonal antes análisis significativo pueden ser completado. Confirmación genética de la etiqueta FP insertada y verificación de la integridad genética del alelo sin editar (en una copia editada mono-alélica) son necesarias para edición precisa en el locus específico más allá de la expresión de la etiqueta.

Una baja tasa de ediciones bi-alélicos y la falta de mutaciones fuera de objetivo (como ensayado por Sanger y secuenciación del exoma) se han observado hasta la fecha con este método (datos no publicados)12. Esto es consistente con estudios previos que describe el uso de corta duración RNP CRISPR/Cas9 experimentos26,27. La falta de líneas de células clonales con bi-alélicos ediciones también puede ser específicas de locus o debido a la incapacidad de la célula para tolerar dos tagged copias de una proteína esencial según lo sugerido de los experimentos previamente publicados donde fueron supuestas células editadas bi-alélicos observado para un lugar geométrico (LMNB1), pero no otro (TUBA1B)12. Líneas celulares clonales completamente validado BI-alélicos se han generado con este método para etiqueta ST6 beta-galactósido alfa-2, 6-sialyltransferase 1 (ST6GAL1) y miembro de RAB5A RAS oncogene family (RAB5A) mEGFP19.

Más allá de confirmar la precisión de la edición del genoma, hay una variedad de ensayos de control de calidad que pueden utilizarse para caracterizar la línea clonal e identificar clones que cumplan todas células, genómica, y criterios biológicos de la célula para utilizan en el futuro estudios . Estudios biológicos y funcionales de células pueden utilizarse para confirmar la adecuada expresión, localización y función de la proteína de fusión12. La comparación a los controles parentales sin editar le ayudará a evaluar la influencia del proceso de edición en función, dinámica y localización. Otros ensayos como análisis de crecimiento y pruebas de estabilidad genomic también pueden ayudar a determinan si la proteína etiquetada es perturbador a la celda. Cuando utilice hiPSC en este protocolo, evaluación de marcadores de pluripotencia y diferenciación potencial puede ser crítico en la determinación de un clon que es valioso para abajo estudios12. Porque extendida cultura de hiPSC se ha demostrado que la inestabilidad genética, monitoreo de la tasa de crecimiento y cariotipo de líneas celulares clonales es también importante12,37. Sin embargo, la final intención de uso de las células editadas en última instancia determinará el nivel y la amplitud de control de calidad análisis y variará según la aplicación.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Daphne Dambournet para muchas discusiones profundas y asesoramiento sobre gene edición, Thao para Ilustración, Angelique Nelson para la lectura crítica del manuscrito y Andrew Tucker para generar la línea de celular de Lamin B1 etiquetado mEGFP. Queremos reconocer la células madre y genes Editing y equipos de desarrollo de ensayos en el Instituto Allen para la ciencia de la célula por su contribución a la gene de edición y control de calidad. La línea WTC que utilizamos para crear nuestra línea celular editado gene fue proporcionada por el Bruce R. Conklin Laboratory en los Institutos Gladstone y UCSF. Agradecemos el Instituto Allen para fundador de ciencia celular, Paul G. Allen, por su visión, ánimo y apoyo.

Materials

Geneious R9 Biomatters, or similar bioinformatics software for in silico donor plasmid design
TE Buffer pH 8.0 IDT, or similar 11-01-02-05
HERAcell VIOS 160i CO2 incubator, or similar ThermoFisher Scientific, or similar 51030408
Pipettes (1000 µL, 200 µL, 20 µL, 10 µL, 2 µL) Rainin, or similar
Pipette tips (1000 µL, 200 µL, 20 µL) Rainin, or similar
Multi-channel Pipette (200 µL) Rainin, or similar
Serological pipetes (25 mL, 10 mL, 5 mL) Costar, or similar
BRAND 8-Channel Manifold for Quiksip, Autoclavable Millipore Sigma, or similar BR704526-1EA use with non-filtered pipet tips, such as Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10, below
Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10 Thermo Fisher, or similar 3501-05
XP2 Pipette Controller Drummond, or similar 4-000-501
Disposable Pasteur Pipets VWR, or similar 53300-567
Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet CELLGARD, or similar NU-481
Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced Corning 354230 lot tested before use with hiPSC
DMEM/F12 (-phenol red) Gibco 11039-021 cold, for diluting Matrigel 1:30
mTeSR1 Complete Media StemCell Technologies 85850 recommended growth media for WTC hiPSC line
Penicillin-streptomycin Gibco 15070-063
WTC hiPSC line Coriell GM25256 the hiPSC line used in this protocol is available through Coriell
Tissue culture dish 100 mm Falcon 353003
6-well Cell Culture Plate CELLSTAR 657160
StemPro Accutase Gibco A11105-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) no calcium, no magnesium Gibco 14190144
15 mL polystyrene conical Sarstedt 62.554.100
Y-27632 (ROCK Inhibitor) StemCell Technologies 72308
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic crRNA, unmodified (custom sequence) Dharmacon Custom0247
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA Dharmacon U-002005-05
Recombinant wild-type Streptococcus pyogenes Cas9-NLS purified protein, 40 µM University of California-Berkeley QB3 Macrolab
Custom donor plasmid (PriorityGENE) Genewiz donor insert design was synthesized and cloned into pUC57 backbone by Genewiz
DNA LoBind Tube 1.5 mL Eppendorf 22431021
NucleoBond Xtra Maxi EF Clontech 740424.50
Neon Transfetion System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 100 µL kit ThermoFisher Scientific MPK10096
5 mL Polystyrene Round-bottom Tube with Cell Strainer Cap Falcon 352235
15 mL High Clarity Polyproylene Conical Tube Falcon 352196
FACSAriaIII Fusion BD Biosciences 656700
FACSDiva software BD Biosciences
FlowJo version 10.2 TreeStar
NERL Blood Bank Saline ThermoFisher Scientific 8504 used as preservative-free FACS Buffer
Olympus SZX7 Stereo Microscope, or similar Olympus, or similar
Tissue culture plate, 96-well Falcon 353072
96 well Cell Culture Plate, V-Bottom CELLSTAR 351180
CryoStor CS10 Sigma C2874-100ML used as cryopreservation buffer for cells in 96-well plate format
Parafilm Bemis PM-996
24 well Cell Culture Plate CELLSTAR 662160
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Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (138), e58130, doi:10.3791/58130 (2018).
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