JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetica

البروتين الذاتية في الإنسان التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent باستخدام كريسبر/Cas9

Published: August 25, 2018
doi:
10.3791/58130
, , , , ,
1Allen Institute for Cell Science

Summary

الموصوفة هنا بروتوكول لعلامات اندوجينوسلي أعرب عن البروتينات مع العلامات الفلورية في الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent باستخدام كريسبر/Cas9. خلايا تم تحريرها مزعومة هي أثري fluorescence تنشيط الخلية الفرز ويتم إنشاء خطوط الخلايا الاستنساخ.

Abstract

ويرد على بروتوكول لتوليد الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسكس) التي تنصهر فيها البروتينات الذاتية التعبير عن العلامات الفلورية الطرفي ن أو ج في الإطار. يمكن استخدام نظام كريسبر/Cas9 بدائية (متفاوت المسافات قصيرة بانتظام إينتيرسباسيد 9 يكرر/كريسبر-المرتبطة المتناوب) لإدخال تسلسل خارجية كبيرة في المكاني الجينوم عن طريق إصلاح التماثل الموجهة (HDR). يستخدم هذا البروتوكول لتحقيق المطلوب تدق في، ribonucleoprotein (رنب)-على أساس النهج التي يتم فيها تسليم البروتين البرية نوع Cas9 العقدية المقيّحة والاصطناعية 2-جزء دليل الحمض النووي الريبي (جرنة) بلازميد قالب من الجهات مانحة للخلايا عن طريق انهانسر. يتم إثراء مزعومة تحرير الخلايا معربا عن البروتينات المعلمة فلوريسسينتلي fluorescence تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية). ثم يتم إنشاء خطوط الاستنساخ ويمكن تحليلها لنتائج التحرير الدقيق. بإدخال علامة نيون في موضع الجينوم الجينات للفائدة، يمكن دراسة التعريب سوبسيلولار الناجمة عن ذلك وديناميات البروتين الانصهار تحت الرقابة التنظيمية الذاتية، تحسنا رئيسيا في أوفيريكسبريشن التقليدية نظم. استخدام هيبسكس كنظام نموذجي لوضع علامات على الجينات يتيح الفرصة لدراسة البروتينات الموسومة في الخلايا ضعفاني، نونترانسفورميد. حيث يمكن أن تكون متباينة هيبسكس إلى أنواع متعددة من الخلايا، هذا النهج يتيح الفرصة لإنشاء ودراسة البروتينات الموسومة في مجموعة متنوعة من السياقات الخلوية اسوي.

Introduction

استخدام استراتيجيات تحرير الجينوم، لا سيما كريسبر/Cas9، دراسة العمليات الخلوية أصبحت متزايدة موجوداً وقيمة1،2،3،،من45، 6 , 7-واحدة من العديد من التطبيقات من كريسبر/Cas9 هو المقدمة (عن طريق إصلاح التماثل الموجهة (HDR)) من التسلسلات خارجية كبيرة مثل التجارة والنقل في المكاني الجينوم محددة ثم بمثابة الصحفيين لنشاط منتج الجين أو البروتين8 . يمكن استخدام هذا الأسلوب الانضمام إلى تسلسل البروتينات فلورية إلى إطار قراءة مفتوح ذاتية التي يمكن أن تستخدم فيها البروتين الانصهار التنظيم اندوجينوسلي الناجمة عن ذلك تصور التعريب سوبسيلولار والقوى المحركة للبروتين للاهتمام5 ،،من69،،من1011. بينما البروتينات اندوجينوسلي المعلمة توفر العديد من المزايا مقارنة بأنظمة أوفيريكسبريسيون، إدراج تسلسل كبيرة في مجال المجين البشري هو عملية غير فعالة عادة مطالبين التحديد أو استراتيجية الإثراء للحصول على عدد خلايا التي يمكن يمكن بسهولة درس5،12.

ويصف هذا البروتوكول إدراج تسلسل الحمض النووي ترميز بروتين فلوري (FP) إلى محور الجينوم المرجوة. ويتضمن البروتوكول تصميم وإنجاز بلازميد قالب المانحين، وريبونوكليوبروتين (رنب) معقدة (نوع البرية المقيّحة س. Cas9 البروتين جنبا إلى جنب مع “الجيش الملكي النيبالي كريسبر” الاصطناعية (كرنا) وعبر تفعيل كرنا (تراكرنا)). ووصف أيضا هو تخصيب الخلايا مزعومة تم تحريرها عن طريق الأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)، وعملية توليد خط خلية الاستنساخ. حتى الآن، وقد استخدمت هذا الأسلوب لإنشاء خطوط هيبسك مع مونواليليك أو علامات البروتين ثنائية-الاليلي (نادراً) الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء) وسم البروتينات الخمسة والعشرين الذين يمثلون هياكل الخلوية الرئيسية. وقد تأكدت المحررة الخلايا الناتجة من هذه الجهود الإدراج الوراثية المتوقعة، والتعبير عن بروتين انصهار إضفاء الطابع المحلي بشكل صحيح، والحفاظ على بلوريبوتينسي و12 تناذر مستقرة (وبيانات غير منشورة). كما استخدمت هذا الأسلوب لإنشاء متعددة أخرى المفرد والمزدوج (معلم في نفس الخلية البروتينات المختلفة اثنين) تحرير سكان هيبسكس (بيانات غير منشورة).

إيبسكس البشرية المستمدة من إحدى الجهات مانحة صحية اختيرت لهذه الجهود تحرير الجينوم لأنه، خلافا للعديد من خطوط الخلايا التقليدية، مثنوية كاريوتيبيكالي مستقرة، غير متحولة والتكاثري. هذه الخصائص توفر نموذجا جذاباً لدراسة بيولوجيا الخلية الأساسية والنمذجة المرض. وعلاوة على ذلك، يوفر إمكانيات التمايز هيبسكس الفرصة لدراسة مراحل تنموية متعددة في نفس الوقت عبر مختلف الأنساب وأنواع الخلايا باستخدام خلايا اسوي بما في ذلك أورجانويدس، والأنسجة، ونماذج “المرض في طبق”13 ،،من1415. في حين كان وضع هذا البروتوكول هيبسكس (خط برجي مركز التجارة العالمي)، قد يكون مفيدة لوضع بروتوكولات استخدام خطوط خلايا الثدييات الأخرى.

Protocol

1. في السيليكون تصميم كرنا و “المانحة قالب بلازميد” لتنظيم الأسرة طريقة الكبس الحصول على التسلسل المرجعي المشروح من نكبي16 أو “مستعرض الجينوم التسخن”17 (مثلاً، شكل بنك الجينات) من الجينات للفائدة واستيراده إلى برامج المعلوماتية الحيوية للاختيار. إذا كان من المعروف تسلسل جينوم مضيف يحتوي على متغيرات بالنسبة إلى الإشارة، تشمل تلك الآن ضبط تسلسل الإشارة في البرامج المعلوماتية الحيوية (انظر المناقشة). حدد موقع الإدخال FP المرجوة. للعلامات ج-الطرفية، سيجري إدخال تسلسل العلامة FP بين الماضي قاعدة كودون آخر وقاعدة أول كودون التوقف. للطرفي ن علامات، سيؤخذ بالتسلسل للعلامة FP عادة بين الماضي قاعدة كودون بداية وقاعدة أول كودون القادم. في بعض الحالات، مثل عندما يكون كودون بداية إكسون كودون واحد، أو حيث يوجد تسلسل إشارة قرب المحطة البروتين، قد يقع في موقع الإدراج FP المطلوب في موقف 3ʹ أكثر، طالما أنها لا تزال في الإطار. استخدام 50 بي بي على كل جانب من الموقع المطلوب الإدراج كتسلسل الإدخال لأي أداة تصميم كرنا متاحة للجمهور. حالما يتم تحديد أهداف كرنا 2-4 قرب موقع الإدراج، تعليم مواقع الربط كرنا والحافز بروتوسباسير المتاخمة (بام) تسلسل (نج) في البرامج المعلوماتية الحيوية. سيتم استخدام هذه كرناس للحث على فواصل الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة (انظر مناقشة لمزيد من التوجيه في تصميم كرنا).ملاحظة: يمكن تقديم تسلسل كرنا مخصص للتوليف مع بائع تجارية (مستحسن)، أو التسلسل يمكن استخدامها كنقطة انطلاق لتصميم استراتيجية توليف الاستنساخ أو في المختبر ، وخارج نطاق هذا البروتوكول (انظر المناقشة ). بدء بلازميد قالب المانحين، استخدام 1 كيلوبايت من تسلسل المنبع للموقع المطلوب الإدراج كذراع التماثل 5ʹ (ينبغي أن يتضمن هذا كودون ابدأ للطرفي ن الملاحق)، واستخدام 1 كيلوبايت من تسلسل مجرى النهر في موقع الإدراج المطلوب 3ʹ ذراع التماثل (ينبغي أن يتضمن هذا كودون التوقف للملاحق ج–المحطة الطرفية). عادة لا يتم حذف القواعد بين اثنين من الأسلحة التماثل. بما في ذلك المتغيرات خط الخلية المحددة في الأسلحة التماثل سيحافظ على هذه المتغيرات الجينية في الخلايا المحررة الناتجة عن ذلك. بين اثنين من الأسلحة التماثل، إدراج تسلسل تنظيم الأسرة (أو أخرى تدق في تسلسل) وتسلسل رابط (انظر مناقشة لمزيد من التوجيه في linkers). لبه الطرفي ن، رابط يجب أن يكون التسلسل مباشرة 3ʹ لتنظيم الأسرة؛ للعلامات ج–المحطة الطرفية، ينبغي أن يكون تسلسل رابط مباشرة 5ʹ تنظيم الأسرة. تعطيل مواقع الربط كرنا في بلازميد قالب المانحة لمنع قطع Cas9 من تسلسل الجهات المانحة (انظر مناقشة للاعتبارات عند تغيير مواقع الربط كرنا). إذا كان ذلك ممكناً، تعطل بام لتسلسل خلاف نج أو تذمر المفضل. بدلاً من ذلك، إدخال طفرات نقطة إلى ثلاث قواعد في منطقة البذور كرنا (الأقرب إلى بام 10 قواعد) من المتوقع أن يعطل كرنا ملزمة بما فيه الكفاية. تعطلت بعض مواقع الربط كرنا الأخذ بالتسلسل FP في بلازميد قالب الجهات المانحة؛ تأكد من أن بام لا، أو المنطقة ملزمة سليمة لا يزال موجوداً في هذه الحالات.ملاحظة: يمكنك تقديمها في السيليكون المانحة قالب بلازميد تخليق الجينات قبل بائع تجارية، أو يمكن استخدامه كنقطة انطلاق لتصميم استراتيجية استنساخ، الذي خارج نطاق هذا البروتوكول. يكفي أن يكون دعامة بسيطة مثل pUC19 أو pUC57. 2-ريبونوكليوبروتين (رنب) تعداء “وساطة” كريسبر/Cas9 تدق في هيبسكس ملاحظة: في هذا البروتوكول، يصف هذا المصطلح ‘جرنة’ كرنا الاصطناعية وتراكرنا بشكل صحيح إعادة معلقة وكمياً والرصاصية قبل كل إرشادات الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد). تكملة جميع وسائل الإعلام مع 1% “البنسلين والستربتوميسين”. يرد وصف المبادئ التوجيهية تثقيف العامة من خط هيبسك برجي مركز التجارة العالمي بمزيد من التفصيل في18،Explorer خلية الين19. برجي مركز التجارة العالمي هيبسكس المستخدمة في هذا البروتوكول، ولكن مع التحسين تعداء السليم، انهانسر رنب والمانحة قالب بلازميد يمكن تكييفها بنجاح إلى أنواع الخلايا الأخرى. إعداد 10 ميكرون العامل مخزونات جرنة ونوع البرية المقيّحة س. Cas9 البروتين2،20؛ الحفاظ على الجليد. إعداد 1 ميكروغرام/ميليلتر العامل الأوراق المالية من الجهات المانحة قالب بلازميد؛ الحفاظ على درجة حرارة الغرفة (RT). استخدام المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات 8.0 درجة الحموضة لتخفيف جميع. إعداد لوحة المغلفة بمصفوفة زراعة الأنسجة 6-جيدا مع 5 مل وسائط النمو جديدة تستكمل مع 10 ميكرون روك المانع (Ri) كل بئر. الحفاظ على لوحة مع وسائل الإعلام في الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 حتى جاهزة لخلايا لوحة بعد الإجراء تعداء (بحد أقصى 2 حاء).ملاحظة: جميع لوحات المغلفة بمصفوفة المستخدمة في هذا البروتوكول مصنوعة بإضافة كمية من ماتريجيل المثلج المخفف 01:30 في وسائط الإعلام DMEM/F12 الباردة وفقا لمعهد ألن للبروتوكول “خلية العلم” لاستزراع خط هيبسك برجي مركز التجارة العالمي19. استخدام كاشف رقيقة خلية واحدة تفارق كما أوصى في الجدول للمواد، ممر هيبسكس في الخلايا خلية واحدة تعليق وعدد مرات استخدام العداد الآلي الخلية، أو هيموسيتوميتير.ملاحظة: يمكن الاطلاع على بروتوكول مفصل للخط هيبسك برجي مركز التجارة العالمي المستخدمة هنا في “مستكشف خلية الين”19. بإيجاز، يغسل خلايا مرة واحدة مع الرايت دببس وتعامل مع كاشف الانفصال لمدة 3-5 دقائق. ثم تريتوراتي الخلايا في خلية واحدة تعليق لطيف بيبيتينج وبيليه بالطرد المركزي. ريسوسبيند بيليه خلية حية في وسائط النمو وتستكمل مع 10 ميكرون ري. إعداد قاسمة 1.84 × 106 خلايا لكل حالة تجريبية يكون ترانسفيكتيد في أنابيب منفصلة 1.5 مل.ملاحظة: يتم حساب كافة وحدات التخزين لوحدة تخزين إجمالي رد فعل ميليلتر 4.5 في مجلد انهانسر 100 ميليلتر، أوقات 2.3 ردود الفعل. وهذا يفسر تعداء المكررة والزائدة للخطأ بيبيتينج. إعداد ribonucleoprotein أنابيب معقدة (رنب) لكل حالة تجريبية عن طريق إضافة 2.88 ميليلتر من 10 ميكرون جرنة و 2.88 ميليلتر من 10 ميكرون Cas9 إلى أنبوب 1.5 مل. تبني على RT للحد أدنى من 10 دقيقة (ح 1 كحد أقصى). بيليه خلية واحدة الكوة (أعد الخطوة 2.3.1) في 211 x ز لمدة 3 دقيقة في المادة طافية الرايت أسبيراتي وريسوسبيند بيليه الخلية في 220 ميليلتر من انهانسر المخزن المؤقت الشركة المصنعة. إضافة 220 ميليلتر من الخلايا حراكه من الخطوة 2.5 إلى 1.5 مل رنب أنبوب معقدة إعدادها في الخطوة 2، 4. إضافة 4.60 ميليلتر من بلازميد قالب 1 ميكروغرام/ميليلتر المانحين إلى أنبوب 1.5 مل إعدادها في الخطوة 2، 4. استخدام تلميح نوكليوفيكشن وماصة لخلط محتويات الأنبوبة 2-3 مرات، ثم نقل 100 ميليلتر من تعليق للجهاز انهانسر المعدة. تجنب إدخال أي فقاعات في التلميح. تطبيق 1300 الخامس لنبض 1 30 مللي ثانية. بلطف نقل التعليق في لوحة 6-جيدا استعدادا من الخطوة 2، 2 مع حركة دوامات. تفريق الخلايا عن طريق تحريك لوحة جنبا إلى جنب والجبهة إلى الوراء بلطف. استخدام تلميح نوكليوفيكشن جديدة، كرر الخطوات من 2.8-2.9 مع ميليلتر 100 المتبقية من التعليق ونقل في بئر ثانية للوحة 6-جيدا استعداد. كرر الخطوات من 2.4 من خلال 2.10 لكل جرنة المانحة قالب بلازميد تركيبة، بما في ذلك عدم استهداف جرنة والمانحة بلازميد القالب فقط، والمخزن المؤقت فقط عناصر التحكم. الحرص على تغيير ماصة ونوكليوفيكشن نصائح لتجنب التلوث المتبادل. احتضان transfected الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2. تغيير الوسائط وسائط النمو العادية (لا ري) في 24 ساعة، ومواصلة التغذية هيبسكس كل 24 ساعة ح 72-96، رصد كونفلوينسي. عندما هيبسكس التوصل إلى التقاء 60-80%، انتقل إلى الخطوة 3.ملاحظة: موت الخلية الثقيلة (> 70%، قدرت) العادي 24-48 ح بعد تعداء. 3-نظام مراقبة الأصول الميدانية-الإثراء “تحرير مزعومة” هيبسكس ملاحظة: عند فرز الخلايا الجذعية، التكيف مع إعدادات أداة لتعزيز بقاء الخلية كما اقترح في المناقشة. باختصار، استخدم أكبر فوهة الممكنة (130 ميكرومتر)، وانخفاض معدل التدفق (≤ 24 ميليلتر/دقيقة)، والسوائل غمد خالية من حافظة (مثل المحلول الملحي، انظر الجدول للمواد)، وعينه منخفضة الضغط (10 رطل/بوصة مربعة). قبل البدء في تجربة نظام مراقبة الأصول الميدانية، تغيير الوسائط وسائط النمو وتستكمل مع 10 ميكرون ري واحتضان خلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لح 2-4 تعزيز البقاء على قيد الحياة بعد نظام مراقبة الأصول الميدانية. استخدام كاشف رقيقة خلية واحدة تفارق كما أوصى في الجدول للمواد، ممر هيبسكس في تعليق خلية واحدة في وسائط النمو وتستكمل مع 10 ميكرون ري19. تصفية هيبسك تعليق من خلال تصفية مش ميكرومتر 35 في أنابيب مستديرة القاع البوليستيرين. فرز الخلايا باستخدام مبعثر إلى الأمام ومبعثر الجانب (بما في ذلك ارتفاع مقابل عرض) ﻻستبعاد الحطام ودوبليتس. استخدام حية، المخزن المؤقت فقط التحكم خلايا لتعيين بوابة FP إيجابية، مثل أن < 0.1% من المخزن المؤقت فقط خلايا تقع داخل البوابة. فرز جميع السكان لتنظيم الأسرة-إيجابية الخلايا في أنبوب البولي بروبلين 1.5-15 مل تحتوي على 0.5-2 مل وسائط النمو RT تستكمل مع 10 ميكرون ري.ملاحظة: بولي بروبلين يقلل احتمال التصاق الخلايا بالبلاستيك. الطرد المركزي الخلايا التي تم جمعها في غ س 211 لمدة 3 دقائق في الرايت نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 200 ميليلتر من وسائط النمو وتستكمل مع 10 ميكرون ري بعناية. نقل خلايا تم فرزها حتى 3,000 إلى بئر واحدة لوحة 96-جيدا المغلفة بمصفوفة جديدة19.ملاحظة: مع إعداد صك ملائم، يمكن أيضا أن فرز الخلايا (بالجملة) مباشرة في بئر واحدة من صفيحة زراعة الأنسجة 96-جيدا المغلفة بمصفوفة تحتوي على 200 ميليلتر من وسائط النمو وتستكمل مع 10 ميكرون ري في كثافة الموصى بها من الخلايا 1,000 3,000 كل بئر هيبسك. احتضان خلايا تم فرزها في 37 درجة مئوية و 5% CO2. تغيير الوسائط وسائط النمو وتستكمل مع 5 ميكرومتر ري في ح 24. تبدأ تغذية الخلايا وسائط النمو العادية (لا ري) كل 24 ساعة ح 72-96، رصد كونفلوينسي في ح 48. البقاء على قيد الحياة بعد نظام مراقبة الأصول الميدانية وتقدر بأكثر من 50% إذا هي المصنفة كحد أدنى من 500 الخلايا في بئر واحدة من صفيحة 96-جيدا. عندما هيبسكس التوصل إلى التقاء 60-80%، وإظهار مورفولوجيا ناضجة (مراكز مستعمرة السلس، ومعبأة جيدا)، مرور في لوحة تنسيق أكبر مثل لوحة 24-جيدا، ثم من لوحة 24-جيدا في لوحة 6-جيدا. عند التوصل إلى التقاء 60-80% هيبسكس في لوحة 6-جيدا وإظهار النضج مورفولوجيا، توسيع لوح 100 مم، إعادة لوحة للتصوير، كريوبريسيرفي، أو البذور في استنساخ الانتقاء الكثافة (الخطوة 4)19. 4-توليد مزعومة “تحريرها الاستنساخ” هيبسك خطوط استخدام كاشف رقيقة خلية واحدة تفارق كما أوصى في الجدول للمواد، ممر هيبسكس في تعليق خلية واحدة وتحديد عدد الخلايا كل مل19. خلايا البذور 10,000 من سكان هيبسكس على طبق زراعة الأنسجة المغلفة بمصفوفة جديدة 100 مم باستخدام وسائط النمو وتستكمل مع 10 ميكرون ري19تم تحريرها. تغيير الوسائط وسائط النمو دون 24 ري ح بعد البذر، وتغذية هيبسكس مع وسائط النمو الطازجة كل 24 ساعة لمدة 5-7 أيام. عندما هيبسكس شكلت مستعمرات مرئية الميكروسكوب (حوالي 500 ميكرومتر) فكبيرة بما يكفي لتكون معزولة. إعداد لوحة 96-جيدا المغلفة بمصفوفة يسفط مصفوفة الزائدة وإضافة 100 ميليلتر من وسائط النمو وتستكمل مع 10 ميكرون ري الواحدة وكذلك19. ماصة P-200 استخدام مجهر تشريح، أو، شبيه بلطف كشط ونضح مستعمرات فردية من سطح اللوحة. نقل وحدة التخزين (~ 20-100 ميليلتر) التي تحتوي على هذه المستعمرة إلى بئر واحدة للوحة 96-جيدا إعدادها في الخطوة 4، 3. بعد أن تم نقل جميع المستعمرات، احتضان اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة في شركة 37˚C و 5%2. تغيير الوسائط وسائط النمو العادية (لا ري) في 24 ساعة، والاستمرار في تغذية الخلايا كل 24 ساعة ح 72-96 حتى المستعمرات قد تضاعف ثلاث مرات تقريبا في الحجم (حوالي 1500 ميكرومتر).ملاحظة: اختيار المستعمرات 24-96 الواحدة كرنا المستخدمة في تعداء ينصح. البقاء على قيد الحياة من الحيوانات المستنسخة معزولة عادة أكثر من 95%. استخدام كاشف رقيقة خلية واحدة تفارق كما أوصى في الجدول للمواد، هيبسك مرور استنساخ في صفيحة 96-جيدا المغلفة بالمصفوفة جديدة كما يلي19. باستخدام الشافطة 8 قنوات، إزالة وتجاهل وسائل الإعلام من العمود الأول من لوحة 96-جيدا. استخدام P-200 ماصة متعددة القنوات، إضافة ~ 200 ميليلتر من دببس إلى العمود الأول من لوحة 96-جيدا لغسل الخلايا. باستخدام الشافطة 8 قنوات، إزالة وتجاهل أغسل دببس من العمود الأول من لوحة 96-جيدا. استخدام P-200 ماصة متعددة القنوات، إضافة 40 ميليلتر من تفكك كاشف للعمود الأول من لوحة 96-جيدا. كرر الخطوات 4.5.1-4.5.3 لتصل إلى ما مجموعة ستة أعمدة لوحة 96، حسنا، تغيير نصائح من المؤكد ليس عبر تلويث آبار. ضع اللوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقيقة من الوقت الذي تمت إضافة الكاشف الانفصال إلى العمود الأول (الخطوة 4.5.3).ملاحظة: من المستحسن المرور فقط كحد أقصى من ستة أعمدة (48 الآبار) في كل مرة بسبب الوقت الذي يستغرقه لتنفيذ هذه الخطوات. عند تنفيذ هذا البروتوكول لأول مرة، تبدأ مع باساجينج عمود واحد أو اثنين فقط في كل مرة. الحد من عدد الأعمدة باساجيد في وقت واحد يضمن أن لا يتم ترك الخلايا في الكاشف الانفصال لفترة طويلة جداً، التي يمكن أن تكون ضارة هيبسكس. عندما بدأت الخلايا في العمود الأول من اللوحة رفع قبالة الجزء السفلي من اللوحة، استخدم ماصة الأقنية P-200 إضافة 160 ميليلتر من دببس إلى العمود الأول من لوحة 96-جيدا و بلطف تريتوراتي الخلايا في “12:00” ، “03:00″، “06:00” ومواقف “09:00” لكل بئر. نقل وحدة التخزين بأكملها من تعليق خلية (200 ميليلتر) إلى لوحة 96 الخامس-أسفل بئر. كرر الخطوة 4.5.5 للأعمدة المتبقية من الخلايا التي تحتوي على كاشف تفارق فيها؛ تغيير نصائح بشأن عدم عبر تلوث الآبار. تدور الخامس-أسفل لوحة في أجهزة الطرد مركزي في 385 x ز لمدة 3 دقائق في الرايت استخدام P-200 ماصة متعددة القنوات، إزالة المادة طافية بلطف وريسوسبيند الخلايا في 200 ميليلتر من وسائط النمو جديدة تستكمل مع 10 ميكرون ري كل بئر. كرر جميع الآبار، تغيير نصائح بشأن عدم تلوث الصليب. نقل كل من تعليق خلية إلى لوحة 96-جيدا المغلفة بمصفوفة جديدة19. احتضان اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة في 37 درجة مئوية و 5% CO2. تغيير الوسائط وسائط النمو العادية (لا ري) في 24 ساعة، والاستمرار في تغذية الخلايا كل 24 ساعة ح 72-96، حتى تصل غالبية الحيوانات المستنسخة إلى التقاء 60-80%.ملاحظة: يساعد هذا المقطع انتشرت الخلايا والسماح لمزيد من النمو على مدى المنطقة بأكملها من لوحة 96-جيدا. مراقبة الحيوانات المستنسخة وتحديد نسبة تقسيم مناسب لكل استنساخ منفردة في لوحة 96-جيدا (مثلاً، 01:10 أو 1:8). استخدام كاشف رقيقة خلية واحدة تفارق كما هو مقترح في جدول للمواد، استنساخ هيبسك مرور إلى جديدة المغلفة بمصفوفة 96-جيدا صفيحة (الخطوات 4.5.1-4.5.8) نقل نسبة تعليق الخلية المناسبة لكل نسخة. احتضان اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة في شركة 37˚C و 5%2. تغيير الوسائط وسائط النمو العادية (لا ري) في 24 ساعة، والاستمرار في تغذية الخلايا كل 24 ساعة ح 72-96، حتى أن غالبية الحيوانات المستنسخة التوصل إلى التقاء 60-80%، وإظهار مورفولوجيا ناضجة.ملاحظة: كل استنساخ قد نسبة تقسيم مختلفة بسبب معدل نمو مختلفة قليلاً أو البقاء على قيد الحياة من المقطع السابق، حيث يساعد هذا المقطع لتطبيع عدد الخلايا كل بئر من كل استنساخ لخطوة التجميد لمتابعة. نظراً لتباين معدلات البقاء على قيد الحياة والنمو، قد كسا بعض الحيوانات المستنسخة أو تفشل في النمو خلال هذه باساجينج الخطوات. إنقاذ ما تبقى من تعليق خلية وبيليه لعزل جدنا بواسطة الخلايا سينتريفوجينج في صفيحة 96 الخامس-أسفل بئر في 385 x ز لمدة 3 دقائق في إزالة الرايت طافية والمضي قدما لعزل جدنا باستخدام مجموعة 96، حسنا، أو تخزين صفيحة خلايا الأعلاف في-20˚C لتصل إلى منتدى المجالس الرومانسية أسابيع هة. 5-تجميد خطوط الخلايا الاستنساخ في شكل لوحة 96-جيدا استخدام كاشف تفكك خلية واحدة، هيبسك مرور الحيوانات المستنسخة كما سبق ذكره (الخطوات 4.5.1-4.5.7). نضح المادة طافية استخدام P-200 ماصة متعددة القنوات وإعادة تعليق في 60 ميليلتر من وسائط النمو وتستكمل مع 10 ميكرون ري. تكرار لجميع الآبار؛ تغيير نصائح بشأن عدم تلوث الصليب. نقل 30 ميليلتر من تعليق خلية لصفيحة مصفوفة غير المغلفة بزراعة الأنسجة 96-جيدا. ثم بسرعة إضافة 170 ميليلتر تجميد المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد) لكل بئر، دون خلط. تكرار بنقل ميليلتر 30 الباقية من تعليق إلى أخت اللوحة وإضافة 170 ميليلتر تجميد المخزن المؤقت.ملاحظة: تتم هذه العملية في أخت مكررة لوحات حيث أن سكان احتياطية من خلايا موجودة بعد ذوبان الجليد إحدى اللوحات الفردية. وضع cryopreserved الخلايا فقط كل عمود آخر للوحة 96-جيدا يسمح لسرعة ذوبان الجليد (الخطوة 5، 6). التفاف لوحة مع بارافيلم ووضعه في مربع RT الستايروفوم مع غطاء. ضع مربع كله في ثلاجة-80 درجة مئوية. بعد 24 ساعة ويمكن نقلها من خارج منطقة الجزاء الستايروفوم لوحات والمخزنة في-80˚C لمدة تصل إلى أربعة أسابيع.ملاحظة: في حين الخلايا يتم تخزينها مؤقتاً في-80 درجة مئوية، يمكن إجراء فحوصات مراقبة الجودة الوراثية مع جدنا حصادها من الخلايا التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.6.1 بغية تحديد المستنسخين ذوبان الجليد، ونشر كذلك، كما نوقش في الأعمال المنشورة سابقا 12-بإيجاز، يمكن استخدامها نسخة رقم تجميعية رقمية PCR مقايسة لتحديد النسخ التي تحتوي على نسخ واحد أو اثنين من التجارة والنقل وليس المانحين قالب بلازميد العمود الفقري التكامل. مزيج من نقطة النهاية PCR فحوصات وسانغر التسلسل يمكن ثم تحديد النسخ التي تحتوي على إدراج دقيقة. لذوبان الجليد، إحضار لوحة كاملة إلى 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة، يراقب بعناية للكريات الجليد في الذوبان. الآبار على حافة اللوحة تميل إلى ذوبان الجليد أولاً. عندما يذوب بيليه الجليد لاستنساخ المرجوة، نقل بلطف ميليلتر 200 أسرة لأنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على 3 مل وسائط النمو RT تستكمل مع 10 ميكرون ري وأجهزة الطرد المركزي في 211 x ز لمدة 3 دقائق في الرايت نضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا الأعلاف في 1 مل وسائط النمو RT تستكمل مع 10 ميكرون ري. نقل إلى لوحة 24-جيدا المغلفة بمصفوفة جديدة واحتضان في شركة 37˚C و 5%2. تغيير الوسائط وسائط النمو العادية (لا ري) في 24 ساعة، والاستمرار في تغذية الخلايا كل 24 ساعة ح 72-96 حتى يصل إلى 60-80% كونفلوينسي الاستنساخ وقد مورفولوجيا ناضجة19.

Representative Results

وكان الهدف من هذه التجربة فتيل ميجفب (أحادي تعزيز التجارة والنقل) للبروتين B1 لأمين النووية بإدخال تسلسل ميجفب إلى نهاية 5ʹ جين LMNB1 (N-محطة للبروتين). وكان اختيار رابط (تسلسل الأحماض الأمينية سجلرسراقاس) استناداً إلى السابقة بنيات كدنا من “مايكل ديفيدسون الفلورسنت البروتين جمع”21. نظراً لأن المنطقة كرنا ملزمة في بلازميد قالب المانحين لكل مرشح كرنا تعطلت بعد الإدراج في السيليكون ميجفب وتسلسل رابط، لا الطفرات نقطة ينبغي بذل لعرقلة محتملة كرنا الاعتراف والانقسام التي Cas9 تسلسل الجهات المانحة (الشكل 1). التسلسل المانحة الواردة 1 كيلوبايت التماثل الأسلحة المرافقة كلا طرفي للتسلسل ميجفب-رابط. 2,734 الناتجة عن شركة بريتيش بتروليوم للحمض النووي تم استنساخ في العمود الفقري pUC57، التحقق من تسلسل، وكان تنقية بلازميد قالب المانحة الناتجة عن استخدام الإعدادية خالية من الذيفان ماكسي. تم transfected بلازميد قالب المانحين ورنب المعقدة وخلايا تم تحريرها مزعومة تم إثراء وإضفاء الطابع المحلي على البروتين الانصهار B1 أمين ميجفب النووية وأكد fluorescence مجهرية (الشكل 2). يرد وصف النتائج فقط من تعداء crRNA1 هنا، على الرغم من أن كلا تسلسل كرنا أنتج السكان مزعومة المحرر12. عند مقارنتها بعنصر التحكم السلبية، التي تتضمن لا جرنة أو البروتين Cas9 المانحة قالب بلازميد في رد فعل انهانسر (المخزن المؤقت فقط)، LMNB1 crRNA1 transfected الخلايا الواردة الخلايا إيجابية ميجفب 0.95 في المائة تمثل مزعومة تم تحريرها ميجفب النووية لأمين B1 السكان (الشكل 3a). كانت هذه النتيجة ضمن نطاق تدق في الكفاءة ولاحظ عبر العديد من مواضع الجينوم باستخدام هذا الأسلوب، كما ذكر سابقا12. الخلايا ميجفب-إيجابية تم عزلة بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية وتصويرها بحية مجهرية لتأكيد التعريب المتوقعة من البروتين الانصهار B1 أمين ميجفب النووية على المغلف النووية. بعد تخصيب نظام مراقبة الأصول الميدانية، كانت حوالي 90% خلايا تم فرزها من السكان crRNA1 LMNB1 ميجفب-إيجابية (كما يحددها مجهرية)، مما يوحي بأن بعض الخلايا ميجفب السلبية تنقية يشترك مع الخلايا بروتينات فلورية خضراء-إيجابية أثناء إجراء الفرز. وكان هذا بمستوى مقبول من تخصيب اليورانيوم الذي يسمح للانتقاء من الحيوانات المستنسخة 96 التي ثم يتم فرزهم وراثيا للتحرير الناجحة. عموما، هو وقف تخصيب نجاح 50% إيجابية التجارة والنقل. أغلبية سكان الخلية فرز عرض الأسفار في المغلف النووية (هامش النووي) في الخلايا نونديفيدينج وإلى الصفيحة نووية موسعة داخل السيتوبلازم خلال الانقسام توفير الثقة في الصحيح الجينوم تحرير في LMNB1 المكان. السكان المخصب الوارد الخلايا مع إشارة ساطعة أو خافت. وقد يعكس هذا الاختلاف في كثافة إشارة مزيجاً من الصحيحة وغير الصحيحة تحرير النتائج ويسلط الضوء على الأداة المساعدة لتوليد خط الاستنساخ وراثيا المصادق عليها لمواصلة الدراسات (انظر المناقشة) (الشكل 3b)12. بعد جيل خط الاستنساخ، وراثيا التحقق من صحة الخلايا أظهرت كثافة التجارة والنقل الموحدة في تجارب الفحص المجهري (الشكل 3 ج). الشكل 1 . تصميم استراتيجية لوضع علامات على بروتينات فلورية خضراء تيرمينوس ن الجين LMNB1. وصمم العلامة التجارة والنقل للطرفي ن الإدراج 5ʹ من إكسون أول من LMNB1 الموجودة على كروموسوم 5. الأسلحة التماثل 5ʹ و 3ʹ هي كل 1 كيلو بايت ولقاء بين كودون ابدأ (ATG) والرامزة الثانية (التماثل الأسلحة يمثل جزئيا فقط في الشكل). هما المرشح كرناس صممت لتوجيه Cas9 تهزم بالقرب من موقع الإدراج المقصود قدر الإمكان، في حين لا يزال يجري فريدة من نوعها في الجينوم. تسلسل ميجفب ورابط الأحماض الأمينية كانت 3ʹ فقط المدرج من كودون ابدأ (تسلسل ميجفب ورابط لا لتوسيع نطاق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 2 . سير العمل لإنتاج اندوجينوسلي معلم خطوط الاستنساخ هيبسك. مكونات تعداء، بما فيها مجمع رنب تراكرنا/Cas9/كرنا (تظهر حمراء البروتين Cas9 كرنا الذهب وتراكرنا الأرجواني)، بلازميد قالب الجهات المانحة التي تحتوي على الأسلحة التماثل (قد، سيظهر في الذهب)، وتنظيم الأسرة + رابط التسلسل (هو موضح في الأخضر)، وقد اليكتروبوراتيد. بعد 4 أيام، FP-إيجابيا تحرير مزعومة الخلايا تم اثراؤه بنظام مراقبة الأصول الميدانية والموسع كعدد سكان قبل البذر كافة الخلايا التي تم فرزها في بئر واحدة من صفيحة 96-جيدا (~ 1,000 الخلايا)، وثم توسعت في الثقافة حتى عدد سكانها عدة ملايين عامل الخلايا يمكن أن تكون جزيئي “السكان المخصب” (انظر البروتوكول خطوة 3.8). يختلف عائد الخلايا FP إيجابية بالتجربة بسبب معدلات متغيرة من12من تقرير التنمية البشرية؛ قد تشمل تخصيب ناجحة عادة ~ 300-5,000 الخلايا بعد تعداء لحوالي 1.6 x 106 خلايا الوركين. وأكدت دراسات تمهيدية بالتصوير الإشارات والتعريب من البروتين الانصهار في السكان المخصب. المستعمرات اعتقلوا يدوياً في لوحة 96-جيدا للتوسع ونعد. المزيد من الفحص الجينومي مراقبة الجودة باستخدام التجميعية الرقمية بكر (دبكر) وفحوصات أخرى تستند إلى بكر ثم استخدمت لتحديد استنساخ تم تحريرها بشكل صحيح، كما هو موضح سابقا12. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 3 . تخصيب خلية مزعومة تحرير السكان. (A) التدفق الخلوي قطع LMNB1 تحرير الخلايا تعداء بعد أربعة أيام. يعرض المحور الصادي كثافة التجارة والنقل ويعرض المحور السيني المبعثر إلى الأمام. تم تعيين غيتس الفرز استناداً إلى مراقبة المخزن المؤقت فقط. منذ هيبسكس حساسة لاضطراب، أسقطت وصمة عار يعيش الميت وبوابة منتدى التعاون الأمني/SSC متحفظة جداً واستخدمت بدلاً من ذلك. (ب) بعد تخصيب اليورانيوم، سكان LMNB1 Cr1 تحرير الخلايا أظهرت ~ 90% خلايا التي تحتوي على بروتينات فلورية خضراء إضفاء الطابع المحلي على المغلف النووية (التعريب LMNB1 المتوقعة). السكان يتضمن خلايا كثافة متفاوتة في التجارة والنقل، فضلا عن بعض الخلايا بروتينات فلورية خضراء-السلبية. أشرطة مقياس من 10 ميكرون. (ج) بعد جيل خط الاستنساخ، أظهرت الخلايا كثافة التجارة والنقل موحدة، مع بعض الاختلافات تعتمد دورة الخلية. مقياس بار 20 ميكرون.

Discussion

الطريقة المعروضة هنا لتوليد اندوجينوسلي ينظم اندماج بروتين فلوري في هيبسكس اتباع نهج مرنة وقوية لتوليد خطوط الخلايا الجينات تحريرها مع التطبيقات بدءاً من تصوير الخلايا الحية إلى مختلف الدراسات الفنية و ” نماذج المرض في طبق “باستخدام هيبسك المستمدة من المريض خطوط13،،من1415. بينما قد استخدمت هذا الأسلوب لإدخال العلامات وتنظيم الأسرة الكبيرة إلى N-أو ج-المحطة من البروتينات الذاتية، فإنه يمكن استخدامها لإدخال العلامات أو التغيرات الوراثية الصغيرة الأخرى إلى نموذج أو الصحيح المسببة للمرض الطفرات22،23 . لإدراج أصغر، يمكن تقليل حجم الذراع التماثل، ولكن قد لا يزال تطبيق النهج العام للتحرير في هذا الأسلوب24،25. بينما استخدام هيبسكس مدعوة بقوة لفائدتها العظمى، مع التحسين حذراً، قد تكييف هذا البروتوكول لتحرير الجينوم لخطوط خلايا الثدييات الأخرى.

عند تحديد نات اهتمام لوضع علامات على تنظيم الأسرة، تقديرات الوفرة نسخة (من بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أو ميكرواري) هي نقطة انطلاق جيدة لتقييم ما إذا كان يتم التعبير عن أحد الجينات أو isoform من الاهتمام، على الرغم من أن مستويات نسخة لا ترتبط دائماً مستويات البروتين. نظام مراقبة الأصول الميدانية لتخصيب الاستراتيجية الوارد وصفها هنا ستعمل أفضل للجينات التي يتم التعبير عنها على الأقل معتدلة جيدا في الخلية نوع من الفائدة. كما نجحت هذه الاستراتيجية في تحديد للانشطار التي تظهر أنماط التعريب الشروريه و/أو المنفصلة مثل سينترين وديسموبلاكين وباكسيلين حيث هو إشارة إلى خلفية نسبة منخفضة جداً12،19. الجينات التي لم تعبر عن الغاية أو يتم التعبير عنها إلا في أنواع الخلايا المشتقة قد تتطلب استراتيجيات اختيار إضافية.

ينبغي أن تكون نقطة الانطلاق للتصاميم بلازميد كرنا والمانحة القالب المستخدمة في خطوط الخلايا البشرية الجينوم البشرية المرجع (GRCh38). لأنه يمكن أن يختلف الجينوم لخطوط خلايا مختلفة ضمن نفس الأنواع، ونظرا لأن كريسبر/Cas9 الخاصة بالتسلسل، أنها مفيدة للغاية لتحديد المتغيرات الخاصة بخط الخلية (مجمع الأشكال المتعددة النوكليوتيدات واحدة أو الملاحق/الحذف (إينديلس)) التي تختلف عن الجينوم المرجعية وتدمجها في التصميم. وهذا ما يضمن أن كرناس سوف تكون متوافقة مع جينوم المضيف وأن الأسلحة التماثل بلازميد قالب المانحة سوف تحتفظ بأية متغيرات خط الخلية المحددة. استراتيجية مقترحة لإدماج المتغيرات متماثل في الأسلحة التماثل بلازميد قالب كرناس والجهات المانحة خلال عملية التصميم. تتضمن المتغيرات متخالف اختياري. استخدام الكواشف محددة كبيرة تدق في التجارب وترد أدناه مناقشة الاعتبارات الرئيسية الأخرى لهذا البروتوكول.

بروتين Cas9

أن الفائدة الأساسية من استخدام البروتين Cas9 أن إدخال Cas9 وقد تبين جرنة رنب معقدة تؤدي في مدة محدودة النشاط نوكلاس مقارنة بالنهج المستندة إلى بلازميد فيها التعبير عن Cas9 وجرنة قد تستمر لأيام ويؤدي إلى أن أكبر المستهدفة ومن إيقاف نشاط26،27. فائدة إضافية لاستخدام البروتين Cas9 أنها متاحة بسهولة تهزم مرة واحدة داخل الخلايا. وهذا يتناقض مع الأساليب التقليدية أكثر من استخدام مرناً Cas9 أو Cas9/جرنة بلازميد تتطلب النسخ والترجمة والبروتين تجهيز26،28. بروتين Cas9 المقيّحة س. Wildtype متاحة الآن من العديد من المصادر التجارية.

دليل الحمض النووي الريبي

هناك العديد من الأدوات المتاحة للعموم للعثور على أهداف كرنا قرب موقع الإدراج FP المرجوة التي تحتوي على صفر أو قليلة توقع إيقاف-الأهداف في المضيف الجينوم29،30،،من3132. الكفاءة في دقة نتائج تقرير التنمية البشرية وتقرير التنمية البشرية تختلف على نطاق واسع بين أهداف كرنا المستخدمة في موضع معين12. ولهذا السبب، اختبار كرناس عدة (2-4 ويفضل أن يكون ذلك ضمن 50 بي بي للموقع المطلوب الإدراج) ينصح كل محور كهذا قد يزيد من احتمال تجربة ناجحة للتحرير. الإمكانيات الحالية لتقديم جرنة تشمل الاصطناعية 2-جزء كرنا وتراكرنا، جرناس واحد الاصطناعية (سجرناس)، في المختبر نسخها سجرناس، أو تسليم من بلازميد إلى خلايا الإعراب عن سجرنا من مروج U6. هذا البروتوكول ليس الأمثل للانقسام وعالية النشاط. واستخدمت غير معدلة 2-جزء كرنا وتراكرنا (انظر الجدول للمواد) بهدف توليد خطوط الخلايا معلم FP مونو الاليلي بينما تسبب اضطراب الأقل المحتملة للخلايا.

المانحة قالب بلازميد

لأن بعض من التماثل تسليح تسلسل شريطة ستدمج في الجهة المانحة بلازميد القالب في جينوم المضيف أثناء الحدث تقرير التنمية البشرية، ينبغي الأخذ بالطفرات إلى مواقع الاعتراف كررنا لمنع المزيد من الانقسام التي Cas9 بعد تقرير التنمية البشرية. وغالباً ما هو التغيير التخريبية أبسط التحور التسلسل بام. لأنه لا يزال يمكن التعرف بعض تسلسلات بام غير متعارف عليه حسب نوع البرية المقيّحة س. Cas9، فمن الأفضل تجنب استخدام نج أو تذمر أو نغا33. عندما تحور الذراع التماثل، تجنب الطفرات غير مترادفين، وإدخال codons نادرة. إذا لم يكن ممكناً تغيير مرادفاً للتسلسل بام، النظر في تقديم ثلاثة الطفرات نقطة مرادفة في منطقة البذور (10 bp الدانية إلى بام) موقع الربط كرنا. وينبغي الحرص الشديد عند إجراء هذه التغييرات في المنطقة غير مترجمة 5ʹ (UTR) حيث أن هذه المناطق يمكن أن تحتوي على تسلسلات التنظيمية الهامة. الاستشارات وراثية حفظ قاعدة بيانات مثل “علم الجينوم المقارن” المسارات “مستعرض الجينوم التسخن” يمكن أن توفر التوجيه في هذه الحالات، كما قد يتم إدخال تغييرات على قواعد غير المصانة التسامح أفضل من تغييرات على قواعد عالية حافظ17. في بعض الأحيان مجرد إدراج تسلسل FP ما يكفي لتعطيل الموقع ملزم كررنا (كما في الشكل 1)؛ ومع ذلك، يجب التحقق من تسلسل الملحقة حديثا استمرار الربط كرنا وتسلسل بام.

وينصح linkers الأحماض الأمينية بين تنظيم الأسرة والبروتين الأصلي للحفاظ على وظيفة البروتين الانصهار34. غالباً ما يمكن اختيار رابط من الأحماض الأمينية لتهمة معينة أو الحجم. إذا كان الانصهار كدنا مع تصميم مماثلة إلى المستهدف الذاتية البروتين الانصهار جيدا ودرست، أنه يمكن استخدام نفس تسلسل رابط لل12،تدق في تجربة كريسبر/Cas919. في حالة عدم توفر هذه المعلومات رابط قصيرة مثل جتسجس كما تم استخدامها بنجاح12. دراسات أخرى أثبتت النجاح مع تسلسل عامة رابط الأحماض أمينية 3 صغيرة لمجموعة متنوعة من الأهداف35.

تعداء وإثراء نظام مراقبة الأصول الميدانية

العديد من الكواشف المتوفرة تجارياً تعداء تصاغ لتقديم أنواع معينة من الجزيئات إلى الخلايا، بينما يمكن استخدام نظام انهانسر توفير الكواشف مع طائفة واسعة من حجم والمسؤول، وتكوينها. بالإضافة إلى كونه طريقة تعداء شائعة للخلايا الثابت ترانسفيكت مثل هيبسكس، يحمل انهانسر أيضا الفائدة من تسليم جميع العناصر الثلاثة كريسبر/Cas9-بوساطة FP تدق كما هو موضح في هذا الأسلوب. تم العثور على انهانسر لإنتاج أفضل النتائج عند مقارنة بغيرها الكواشف المتوفرة تجارياً عند وضع هذا الأسلوب (البيانات لا تظهر)، وقد استخدمت قبل الآخرين أيضا رنب تسليم26،28،36 .

عند استخدام هذا البروتوكول لتحرير هيبسكس، ينبغي إيلاء عناية خاصة لضمان المعالجة لطيف للخلايا قبل وبعد الجينات تحرير عملية لبقاء الخلية المثلى والتمايز عفوية الحد الأدنى. على وجه الخصوص، ينبغي أن تكون أساليب الإثراء نظام مراقبة الأصول الميدانية تكييفها لفرز الخلايا الجذعية باستخدام أكبر فوهة الممكنة (130 ميكرومتر)، وانخفاض معدل التدفق (دي تو فور ميليلتر/دقيقة)، والسوائل غمد خالية من حافظة (مثل المحلول الملحي، انظر الجدول للمواد)، ونموذج منخفض الضغط (10 رطل/بوصة مربعة). بدلاً من خلية مفردة الفرز، مما يؤدي إلى بقاء الأمثل في الخلايا الجذعية، فرز بالجملة هيبسكس أثري نظام مراقبة الأصول الميدانية وتوسيعه كعدد سكان تحسين سلامة البقاء والخلايا الجذعية خلية. ومع ذلك، فرز خلية واحدة قد تكون ملائمة لأقل أنواع الخلايا الحساسة. ولتعزيز بقاء الخلية، عاد إلى ثقافة لم تعد من ساعة واحدة بعد الحصاد لإثراء نظام مراقبة الأصول الميدانية الخلايا وتحفظ في درجة حرارة الغرفة طوال عملية الفرز. لبعض أنواع الخلايا، يمكن أيضا تعزيز بقاء الخلية من الخلايا تحضين على الجليد (4 درجة مئوية) في جميع مراحل عملية الفرز.

توسيع الجزء الأكبر من خلايا FP إيجابية تتيح فرصة لتقييم السكان عن طريق تحليل التصوير للانصهار البروتين التعريب قبل توليد خطوط الاستنساخ. في حين قد يكون السكان المخصب الناتج من خلايا كافية لبعض الدراسات، عرض هؤلاء السكان كثيرا ما إشارة FP مختلفة الشدة. خطوط الاستنساخ معزولة لها إشارة موحدة (الشكل 3) وجعلها أكثر ملاءمة للتجارب الفنية12.

توليد خط خلية الاستنساخ

طوال عملية توليد خط التحرير والاستنساخ، من المهم رصد مورفولوجيا الخلايا. يجب أن يحمل المستعمرات هيبسك نمت في ظروف خالية من علبة التغذية بالورق حواف ناعمة و18،12،مركز معبأة جيدا، وحتى19. ينبغي التقيد بخلايا متمايزة في أقل من 5 في المائة للثقافة. عند اختيار المستعمرات الفردية، اختر تلك مورفولوجيا جيدة هذا المعرض. خلال لوحة 96-بئر باساجينج الأحداث، تحقق من الحيوانات المستنسخة مورفولوجية والتوقف عن تلك التي تكون متضخمة وهذا قد يؤدي إلى التمايز أو يكون مؤشرا على عدم الاستقرار الوراثي.

جيل خطوط الخلايا الاستنساخ يسمح لتأكيد الجينية دقيقة والتحرير، هو أمر مهم لأنه يكسر حبلا المزدوج الناجم عن Cas9 في الجينوم هي غالباً ما أصلحت غير دقيقة أنماطاً على الرغم من إدراج العلامة في المكان المطلوب. فحوصات تم وصفه مسبقاً على أساس PCR أظهرت أن تراكمياً عبر عشر فريدة من نوعها المكاني الجينوم كثيرة (45 في المائة) المستنسخين معربا عن تنظيم الأسرة يعاني من المانحين بلازميد العمود الفقري التكامل في المكان المستهدف أو (نادراً) عشوائياً في الجينوم12. بالإضافة إلى ذلك، استنساخ 23 في المائة مصابات بالتجارة والنقل (n = 177) عبر عشر المكاني فريدة من نوعها تم العثور على إيواء الطفرات في أو بالقرب من الموقع قطع كررنا المتوقعة في اليل غير المميزة، الأكثر احتمالاً بسبب نهيج12. هذا التحليل الجيني للعديد من خطوط الاستنساخ (~ 100 استنساخ/تحرير) شدد على أهمية التحقق من الصحة الوراثية التي لا يمكن في عدد سكان خلية منذ FP-التعبير والانصهار المتوقعة البروتين التعريب وحدها لا تضمن دقة التحرير12 . بالإضافة إلى ذلك، لا يمكن إجراء هذه الاختبارات المستندة إلى بكر على سكان بالتخصيب الخلايا التي تحتوي على أي قدر من اليقين، تستدعي الحاجة إلى توليد خط الاستنساخ قبل إتمام تحليل ذي مغزى. تأكيد الوراثية للعلامة FP المدرج والتحقق من سلامة الوراثية اليل غير المحررة (في استنساخ محرر مونو الاليلي) كلاهما ضروري لضمان تحرير دقيقة في المكان المستهدف وراء التعبير العلامة.

قد لوحظ انخفاض معدل عمليات التحرير ثنائية الاليلي وانعدام الطفرات خارج الهدف (جزيئي سانغر وتسلسل عزمي) إلى تاريخ باستخدام هذا الأسلوب (بيانات غير منشورة)12. وهذا يتفق مع الدراسات السابقة التي تصف استخدام رنب قصيرة الأمد لتجارب كريسبر/Cas926،27. عدم وجود خطوط الخلايا الاستنساخ مع أظهر استقصاء المعلومات الجينية قد تكون أيضا موضع محدد أو بسبب عدم قدرة الخلية على تحمل اثنين معلم نسخاً البروتين الضروري كما هو مقترح من تجارب منشورة سابقا حيث كانت الخلايا المحرر الثنائي الاليلي المفترضة ولاحظ لمحور واحد (LMNB1)، ولكن ليس آخر (TUBA1B)12. تم إنشاؤها خطوط ثنائية الاليلي خلية الاستنساخ الكامل تم التحقق من صحتها باستخدام هذا الأسلوب للعلامة ST6 بيتا-جالاكتوسيدي ألفا-2, 6-سياليلترانسفيراسي 1 (ST6GAL1)، وعضو RAB5A رأس السرطاني الأسرة (RAB5A) مع ميجفب19.

بعد تأكيد دقة التحرير في الجينوم، وهناك مجموعة متنوعة من فحوصات مراقبة الجودة التي يمكن استخدامها لزيادة تميز الخط الاستنساخ وتحديد النسخ التي تفي بجميع الخلايا الجذعية الجينية، وخلية المعايير البيولوجية لاستخدامها في المستقبل دراسات . يمكن استخدام الخلية البيولوجية والفنية فحوصات لتأكيد التعبير المناسب، والترجمة، ووظيفة البروتين الانصهار12. المقارنة إلى غير محررة “المراقبة الأبوية” سيساعد على تقييم تأثير عملية التحرير على الترجمة، وديناميات، والدالة. فحوصات أخرى مثل تحليل النمو واختبارات للاستقرار الجينوم يمكن أن تساعد أيضا تحديد ما إذا كان البروتين المعلمة المقلق للخلية. عند استخدام هيبسك في هذا البروتوكول، يمكن تقييم علامات بلوريبوتينسي وإمكانات المفاضلة حاسمة في تحديد استنساخ ما قيمة المصب الدراسات12. نظراً لتوسيع ثقافة هيبسك ما ثبت أنه يؤدي إلى عدم الاستقرار الوراثي، رصد معدل النمو وهو تناذر خطوط الخلايا الاستنساخ أيضا مهمة12،37. ولكن الغرض النهائي استخدام الخلايا المحررة ستحدد في نهاية المطاف مستوى وعمق تحليل مراقبة الجودة، وسوف تختلف استناداً إلى التطبيق.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونحن نشكر “دافني دامبورنيت” للعديد من المناقشات الثاقبة وإسداء المشورة بشأن الجينات التحرير، ثاو للتوضيح، انجيليك نيلسون لقراءة نقدية من المخطوطة، وأندرو تاكر لتوليد خط الخلية B1 لمين معلم ميجفب. نود أن نعترف بالخلايا الجذعية وتحرير الجينات وفرق “تطوير الفحص” في معهد الين “علوم الخلية” لمساهماتها في عملية مراقبة الجودة وتحرير الجينات. قدمت خط برجي مركز التجارة العالمي التي استخدمت لإنشاء خط الخلية الجينات في تحريره لدينا مختبر Conklin ر. بروس في المعاهد غلادستون و UCSF. ونحن نشكر معهد ألن مؤسس “علم الخلية”، بول الين زاي، لرؤيته، التشجيع، والدعم.

Materials

Geneious R9 Biomatters, or similar bioinformatics software for in silico donor plasmid design
TE Buffer pH 8.0 IDT, or similar 11-01-02-05
HERAcell VIOS 160i CO2 incubator, or similar ThermoFisher Scientific, or similar 51030408
Pipettes (1000 µL, 200 µL, 20 µL, 10 µL, 2 µL) Rainin, or similar
Pipette tips (1000 µL, 200 µL, 20 µL) Rainin, or similar
Multi-channel Pipette (200 µL) Rainin, or similar
Serological pipetes (25 mL, 10 mL, 5 mL) Costar, or similar
BRAND 8-Channel Manifold for Quiksip, Autoclavable Millipore Sigma, or similar BR704526-1EA use with non-filtered pipet tips, such as Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10, below
Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10 Thermo Fisher, or similar 3501-05
XP2 Pipette Controller Drummond, or similar 4-000-501
Disposable Pasteur Pipets VWR, or similar 53300-567
Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet CELLGARD, or similar NU-481
Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced Corning 354230 lot tested before use with hiPSC
DMEM/F12 (-phenol red) Gibco 11039-021 cold, for diluting Matrigel 1:30
mTeSR1 Complete Media StemCell Technologies 85850 recommended growth media for WTC hiPSC line
Penicillin-streptomycin Gibco 15070-063
WTC hiPSC line Coriell GM25256 the hiPSC line used in this protocol is available through Coriell
Tissue culture dish 100 mm Falcon 353003
6-well Cell Culture Plate CELLSTAR 657160
StemPro Accutase Gibco A11105-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) no calcium, no magnesium Gibco 14190144
15 mL polystyrene conical Sarstedt 62.554.100
Y-27632 (ROCK Inhibitor) StemCell Technologies 72308
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic crRNA, unmodified (custom sequence) Dharmacon Custom0247
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA Dharmacon U-002005-05
Recombinant wild-type Streptococcus pyogenes Cas9-NLS purified protein, 40 µM University of California-Berkeley QB3 Macrolab
Custom donor plasmid (PriorityGENE) Genewiz donor insert design was synthesized and cloned into pUC57 backbone by Genewiz
DNA LoBind Tube 1.5 mL Eppendorf 22431021
NucleoBond Xtra Maxi EF Clontech 740424.50
Neon Transfetion System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 100 µL kit ThermoFisher Scientific MPK10096
5 mL Polystyrene Round-bottom Tube with Cell Strainer Cap Falcon 352235
15 mL High Clarity Polyproylene Conical Tube Falcon 352196
FACSAriaIII Fusion BD Biosciences 656700
FACSDiva software BD Biosciences
FlowJo version 10.2 TreeStar
NERL Blood Bank Saline ThermoFisher Scientific 8504 used as preservative-free FACS Buffer
Olympus SZX7 Stereo Microscope, or similar Olympus, or similar
Tissue culture plate, 96-well Falcon 353072
96 well Cell Culture Plate, V-Bottom CELLSTAR 351180
CryoStor CS10 Sigma C2874-100ML used as cryopreservation buffer for cells in 96-well plate format
Parafilm Bemis PM-996
24 well Cell Culture Plate CELLSTAR 662160
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333 (6040), 307 (2011).
  2. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  3. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  4. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  5. Dambournet, D., Hong, S. H., Grassart, A., Drubin, D. G. Tagging endogenous loci for live-cell fluorescence imaging and molecule counting using ZFNs, TALENs, and Cas9. Methods in Enzymology. , 139-160 (2014).
  6. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Sci Rep. 5, 9592 (2015).
  7. Hendriks, W. T., Warren, C. R., Cowan, C. A. Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells: Approaches, Pitfalls, and Solutions. Cell Stem Cell. 18 (1), 53-65 (2016).
  8. Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
  9. Doyon, J. B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).
  10. Cho, W. K., et al. Super-resolution imaging of fluorescently labeled, endogenous RNA Polymerase II in living cells with CRISPR/Cas9-mediated gene editing. Sci Rep. 6, 35949 (2016).
  11. White, C. W., Vanyai, H. K., See, H. B., Johnstone, E. K. M., Pfleger, K. D. G. Using nanoBRET and CRISPR/Cas9 to monitor proximity to a genome-edited protein in real-time. Sci Rep. 7 (1), 3187 (2017).
  12. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Mol Biol Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
  13. Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
  14. Young, J. E., Goldstein, L. S. Alzheimer’s disease in a dish: promises and challenges of human stem cell models. Human Molecular Genetics. 21 (R1), R82-R89 (2012).
  15. Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper. Stem Cell Reports. 3 (6), 931-939 (2014).
  16. . . Gene, NCBI- National Center for Biotechnology Information. , (2017).
  17. . . Gene, NCBI- National Center for Biotechnology Information. , (2017).
  18. . . Allen Cell Methods: Single cell passaging human iPS cells. , (2018).
  19. . . Allen Cell Explorer. , (2017).
  20. Lingeman, E., Jeans, C., Corn, J. E. Production of Purified CasRNPs for Efficacious Genome Editing. Curr Protoc Mol Biol. 120, 31-31 (2017).
  21. . . Michael Davidson Fluorescent Protein Collection. , (2017).
  22. Cox, D. B., Platt, R. J., Zhang, F. Therapeutic genome editing: prospects and challenges. Nature Medicine. 21 (2), 121-131 (2015).
  23. Haas, S. A., Dettmer, V., Cathomen, T. Therapeutic genome editing with engineered nucleases. Hamostaseologie. 37 (1), 45-52 (2017).
  24. Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases. G3 (Bethesda). 3 (4), 657-664 (2013).
  25. Orlando, S. J., et al. Zinc-finger nuclease-driven targeted integration into mammalian genomes using donors with limited chromosomal homology. Nucleic Acids Research. 38 (15), e152 (2010).
  26. DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Methods. 121-122, 9-15 (2017).
  27. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  28. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
  29. Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).
  30. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
  31. Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
  32. . . CRISPOR V4.3. , (2017).
  33. Zhang, Y., et al. Comparison of non-canonical PAMs for CRISPR/Cas9-mediated DNA cleavage in human cells. Sci Rep. 4, 5405 (2014).
  34. Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Adv Drug Deliv Rev. 65 (10), 1357-1369 (2013).
  35. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).
  36. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
  37. Baker, D., et al. Detecting Genetic Mosaicism in Cultures of Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 7 (5), 998-1012 (2016).

Tags

CRISPR/Cas9Endogenous Protein TaggingHuman Induced Pluripotent Stem CellsRibonucleoproteinFluorescent TagFACSClonal Cell LinesGene EditingLive Cell ImagingCellular StructuresCellular Processes

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (138), e58130, doi:10.3791/58130 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image